工程改造免疫球蛋白的方法

专利名称：工程改造免疫球蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及工程改造和制备包含经修饰的免疫球蛋白可变区多 肽的分子的方法。
一般领域是工程改造蛋白质以赋予其特异性结合的特性。更具体 地讲，这里相关的工程蛋白质是免疫球蛋白(抗体)，甚至更具体地讲，
是免疫球蛋白的单个可变结构域(variable domain)、或单个可变结构域 对或组合、或与其它免疫球蛋白结构域的组合。免疫球蛋白的特异性 结合特性是重要的特征，因为它们控制着与其它分子如抗原的相互作 用，使得免疫球蛋白可用于诊断和治疗的应用。 背景
抗体的结构
不同物种和不同类别的抗体的基本结构是相似的，在这里用 一个
完整IgGl免疫球蛋白的作为例子来解释。
两个同样的重(H)链和两个同样的轻(L)链结合形成Y形抗体分 子。重链各有四个结构域。氨基末端可变结构域(VH)在Y的顶部。后 接有三个恒定区结构域(constant domain) CH1 、 CH2和在Y主干的底 部的羧基端CH3。 一段短的区段转换区(switch)连接重链可变区和恒 定区。铰链将CH2和CH3 (Fc片段)连接到抗体(Fab片段)的剩余部分。 一个Fc和两个同样的Fab片段可通过蛋白酶切割完整抗体分子的铰 链而产生。轻链由被转换区分隔的可变(VL)和恒定(CL)两个结构域组 成。
铰链区的二硫键连接着两条重链。轻链通过另外的二硫键与重链 连接。
重链和轻链的可变区(VL)和(VH)位于Y的"顶部"，它们定位于此与抗原反应。该分子的这个顶部是氨基酸序列N -末端所在的一端。
Y的主干表现在某种程度上有效地介导效应功能例如补体活化和 与Fc受体相互作用、或ADCC和ADCP。其CH2和CH3结构域凸 出以方便与效应蛋白相互作用。氨基酸序列C -末端位于顶部的对 边，可称为Y的"底部"。 免疫球蛋白可变结构域(V结构域)
抗体分子中每个结构域有一个相似的结构两个p片层在紧缩的 反向平行卩桶中彼此紧压。该守恒的结构被定义为免疫球蛋白折叠。 参考Bork等(1994)J. Mol. Biol. 242:309-320; Halaby等(1999) Protein Engineering 12: 563-571; Immunobiology . 5th ed. Janeway, Charles A.; Travers, Paul; Walport， Mark; Shlomchik， Mark. New York and London: Garland Publishing; 2001 。
可变结构域折叠有9个P股，排列在4股和5股的两个片层中。 上述5股的片层与恒定结构域的3股片层结构同源，但是含有额外的 股C和股C"。剩余的股(A、 B、 C、 D、 E、 F、 G)与其在恒定结构域 免疫球蛋白折叠中的负体有同样的拓朴结构和相似的结构。如在恒定 结构域中一样，二硫一建连接在相对的片层中的股B和股F。免疫球蛋 白轻链和重链的可变结构域都含有三个高变环，即互补决定区(CDR)。 V结构域的三个CDR (CDR1 、 CDR2、 CDR3)群集在卩桶的一端。CDR 是连接免疫球蛋白折叠的P链B-C、 C，-C"和F-G的环。CDR上的残 基随各种免疫球蛋白分子的不同而不同，赋予每种抗体对抗原的特异 性。
在抗体分子顶部的VL和VH结构域紧压在一起以至6个CDR(每 个结构域3个)配合构成特异性结合抗原用的表面(或空腔)。因而抗体 的天然抗原结合位点由连接轻链可变结构域的股B-C、股C，-C"和股 F-G和重链可变结构域的股B-C、股C，-C"和股F-G的环组成。 用于蛋白质工程的支架
利用蛋白质3D结构作为设计的辅助，用蛋白质的核心结构作为支架，使位于许多蛋白质表面的氨基酸残基随机化。以下参考文献中
描述或综述了该策略的实例，以引用的方式并入本文Nygren PA, Uhlen M., Curr Opin Struct Biol. (1997) 7:463-9; Binz HK, Amstutz P, Kohl A， Stumpp MT， Briand C, Forrer P， Grutter MG， Pluckthun A. Nat Biotechnol. (2004) 22:575-82; Vogt M, Skerra A. Chembiochem. (2004) 5:191-9; US 6,562,617; Hufton等FEBS Letters (2000) 475: 225; Binz等 Nat Biotechnol. (2005) 23:1257-68; Hosse 等 Protein Sci . (2006)15:14-27。
该技术的基本原理是基于对许多蛋白质具有稳定核心的观察，该 核心通过如p片层或a螺旋的二级结构元件的特定排列而形成，而二 级结构元件通过环、转角或无规巻曲结构相互连接。通常，后面这三 种结构元件对于蛋白质整体结构的重要性较小，在这些结构元素中的 氨基酸残基可被交换而常常不会破坏总的蛋白质折叠。这一设计原理 的天然例子是如可在抗体、T-细胞受体和其它免疫球蛋白超家族分子 中发现的免疫球蛋白样结构域的CDR。 免疫球蛋白可变结构域CDR环的搡作
很多现有技术文献显示免疫球蛋白样支架被用于对现有的抗原 或配体结合位点进行搡作以引入新的结合特性的目的。更确切地讲， 主要是对CDR区进行抗原结合工程改造，换言之对于免疫球蛋白折 叠而言，修饰天然抗原结合位点以改变其结合亲和力或特异性。现有 大量文献描述这些被操纵的免疫球蛋白的不同形式，通常以完全抗 体、融合产物和/或片段如单链Fv片段(scFv)、双抗体、微型抗体、单 结构域或Fab片段等等的形式表达，或者在噬菌体颗粒或其它病毒和 细胞表面展示，或者在各种原核或真核表达系统中可溶性表达。这些 技术例如在Holliger & Hudson." Nat. Biotechnol. (2005) 23:1126-36和 Hoogenboom, Nat. Biotechnol. (2005)23:1105-16中综述。 免疫球蛋白可变结构域的骨架或非CDR区
免疫球蛋白可变结构域的CDR环决定抗原特异性。分子的剩余 部分叫做骨架(FR)。然而这些骨架区由(3股和环结构组成。天然免疫球蛋白可变结构域中的非CDR环的环没有抗原结合或 表位结合特异性，但是有助于免疫球蛋白结构域的正确的总体折叠 因，此也有助于CDR的正确定位和结构域之间的相互作用。为了本 发明的意图，将这些环称为结构环。
通常出于很多不同的原因对抗体可变结构域进行操作，例如各种 抗体形式(format)的构建、CDR移植(也就是将特定抗体的特异性移植 到另 一个骨架；例如Jones等Nature (1986) 321: 522-525; Kashmiri等 Methods (2005) 36:25-34)、改变可变结构域的表面以使其更具可溶性 和稳定性(例如Ewert等Methods (2004) 34:184-99; Conrath等J Mol Biol. (2005) 350:112- 125)、使其变为单体(例如Dottorini等 Biochemistry (2004) 43: 622-628))或研究可变结构域之间的相互作用 (例如Masuda等FEBS J. (2006) 273:2184-94)。很多那些操作已经包括 了改变分子骨架区；已经完成了一些在可变结构域的结构环内部的氨 基酸突变。
从CDR移植结果看，远端骨架区对CDR环定位的影响是明显的， CDR移植结果显示骨架氨基酸的频繁突变对于在CDR从一个骨架移 植到另一个骨架之后恢复抗原结合是必需的(例如Foote & Winter (1992) J. Mol. Biol. 224: 487- 499; Kettleborough等Protein Eng . (1991) 4:773-783; Wu等J. Mol. Biol. (1999) 294:151-162)。
Simon & Rajwesky (Protein Sci. (1992) 5:229-234)研究了将四个残 基插入来自抗-NP抗体Bl-8的重链可变区的FR3环的影响。插入突 变体实现在生物合成中没有重要缺陷的分泌型抗体，表明抗体可变结 构域不仅可在互补决定区(CDR)而且在骨架区(FR)环适应长度的变 化。在这种情况下，由CDR环形成的初始抗原结合位点不受邻近结 构环上的修饰的影响。 CDR环移植到结构环区
EP0640130B1描述了具有超过一个生物学结合位点(单个V结构 域或多个Fv)的嵌合免疫球蛋白超家族蛋白类似物(嵌合蛋白(chi-protein))。这些蛋白上的结合位点由来源于与免疫球蛋白分子超家 族的分子相关的分子的高变区组成，这些分子包括免疫球蛋白、细胞 表面抗原(如T细胞抗原)和细胞受体(如Fc受体)。所述高变区叫做 "CDR样区"并确定配体结合位点。另外，该嵌合蛋白具有至少一个以 上的配体结合位点区段，还有CDR样区，拼接到(3桶结构域的FR样 区中。
因此该嵌合蛋白的每个配体结合位点由来自免疫球蛋白超家族 的分子的CDR样区组成。例如，配体结合位点由来自其配体是抗原 的免疫球蛋白分子的CDR组成。
这样，EP0640130B1教导怎样将来自免疫球蛋白超家族分子的具 有给定特异性的CDR样区剪接成可变结构域的结构环。推测用该技 术可制备双特异性功能抗体。对该技术来说存在以下需要对于可变 结构域而言，使CDR样环的相对定位(CDR环对称性)复制成合理近 似于结构环的相对定位。EP0640130B1声称该CDR样环对称性对于 结构环的近似是存在的。然而，CDR环的相对定位与结构环的相对定 位在细节和分辨率(resolution)上的足够相似性是令人怀疑的，因此， 至今为止还没有用该技术开发双特异性分子的实际可能性的描述。
EP0640130B1举例说明了 R19.9(特异于对偶氮苯胂酸盐的鼠类单 克隆抗体)和26-10(特异于乌本苷的鼠类单克隆抗体)分别被用作提供 主要CDR环(primary CDR loop)的骨架，并且将鼠类抗溶菌酶抗体 D1.3的CDR环移植到结构环区。然而，没有描述移植后的功能特异 性。
另一个例子描述了特异于乌本苷的单链抗体26-10能够在将来自 溶菌酶特异抗体的两个CDR移植到乌本苷特异的单链Fv抗体片段的 结构环之后保持其乌本苷特异性。然而，没有描述根据该方法制备的 抗体片^殳还具有溶菌酶结合特异性。 多肽移植到结构环区
WO00244215A2描述了包含特异性靶结合位点和Fc效应肽的结合分子。Fc效应肽是100多个氨基酸的与效应分子相互作用的多肽。 效应肽可以例如插入抗体环区中，前提是结合抗原的能力不受到不利 影响。例证了效应肽被插入到免疫球蛋白片段的CH1结构域的非CDR 环。对于可变结构域的同样的插入没有进行描述。根据该公开说明书 移植到非CDR环的每个多肽由于其所在的不同的结构环境而具有很 高的失活机会。另外，如果多肽移植到可变结构域的结构环中，那么 在亲本免疫球蛋白中保持特异的CDR环构象可能是困难的。因此，
植到可变结构域。
PCT/EP2006/050059描述了工程改造免疫球蛋白以获得新的抗原 结合位点的方法，该免疫球蛋白在结构环区包含修饰。该方法广泛应 用于免疫球蛋白并可用于制备一系列靶向多种抗原为的免疫球蛋白。
US2005/266000A1描述了包含变体重链可变骨架结构域(VFR)的 多肽。VFR是可与抗原接触的抗原结合袋或沟的一部分。VFR是CDR 环区(在本文中也叫做CDR区)的一部分，位于在CDR环旁边的可变 结构域，通过CDR环区支持抗原结合。没有为了工程改造抗原结合 位点而对骨架环(而非VFR)进行诱变。
本发明的目标是提供免具有改良的抗原结合特性的疫球蛋白和 可变免疫球蛋白结构域、以及工程改造和制备具有改良的可变结构域 的免疫球蛋白的方法。 发明描述
本发明主题满足此目标的需要。
本发明涉及工程改造免疫球蛋白并测定所述免疫球蛋白与抗原 表位结合情况的方法，该免疫球蛋白包含可变结构域和在所述免疫球 蛋白的至少两个结构环内的至少 一 个修饰，其中未修饰的免疫球蛋白 明显不与所述表位结合，所述方法包括以下步骤
-提供编码包含至少两个结构环的免疫球蛋白的核酸，
-修饰每个所述结构环的至少 一个核苷酸残基，-将所述经修饰的核酸转移到表达系统中，
-表达所述经修饰的免疫球蛋白，
-使所表达的修饰免疫球蛋白与表位接触，和
-测定所述的修饰免疫球蛋白是否与所述表位结合。
根据本发明工程改造的结构环优选位于 一 个或两个结构环区的
内部，在某些情况下将修饰置于在甚至超过2个的结构环区内。
为了克服在WO00244215A2和EP0640130B1中所描述的将结合 位点工程改造到在抗体可变结构域的结构环区中的现有技术水平的 缺点，本发明提供方法以对多肽(即包含修饰的结构环区的可变结构域 肽)进行其天然环境(context)(即抗体可变结构域)中的特异性结合的选 择。为了增加可根据抗原结合情况而进行选择的变体免疫球蛋白结构 域的潜在结构的数量，根据本发明对至少两个结构环或环区进行修 饰。因此引入和选择对总体结构域结构干扰最小的许多不同的修饰是 可能的。修饰至少两个环或环区的另一个优势是扩大的表面积有可 能与特异性结合配偶体相互作用。根据特异性功能或结合情况，对如 此修饰的免疫球蛋白可变结构域进行选择。本发明能够对修饰的免疫 球蛋白可变结构域和修饰的免疫球蛋白进行工程改造，这两者使它们 的经修饰的结构环或环区以高亲和力结合和/或高特异性与结合配偶 体结合。该方法允许选择具有最小限度的修饰且没有破坏免疫球蛋白 可变结构域总体结构的特异性结合分子。
为了克服难以保持亲本免疫球蛋白中的特定CDR环构象的困难， 根据本发明对可变结构域的结构环进行了修饰。因此这是第一次可能 为免疫球蛋白增加抗原结合特性而不显著损失亲本抗体的抗原结合 乃至效应分子结合。令人异想不到的是，有可能根据本发明工程改造 免疫球蛋白而没有明显干扰亲本免疫球蛋白特定CDR环构象的结合 特性，例如结合亲和力、亲合力和特异性。
特定的CDR环构象为抗原结合提供CDR环或CDR环区。根据 本发明可修饰任何经由这种CDR环构象与抗原结合的免疫球蛋白，以获得在免疫球蛋白结构环上的另外结合位点，优选同时该特定的
CDR环构象和亲本分子的初始抗原结合特性可保持或不变。优选CDR环构象的结合特性可维持到亲本分子的结合亲和力没有显著减少的程度，例如，解离常数Kd没有显著增加，意味着Kd的差异是优选小于104、更优选小于103、甚至优选小于102或小于IO的倍数。
依照本发明，本发明的 一个关键特征是免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域的工程改造发生在通常不涉及抗原结合的区域，换句话说，发生在抗体可变结构域的CDR之外的区域。据观察免疫球蛋白结构域的特异折叠允许在与CDR结构类似但序列及结构的位置不同的区域引入随机突变。根据本发明鉴别用于修饰的区域是像CDR —样的连接免疫球蛋白折叠的P链的环区。如本发明所述，可对这些结构环或环区进行突变而不影响经过CDR环介导的免疫球蛋白可变结构域的结合。通过对所述的结构环或环区进行突变，产生新的分子结合表面或结合口袋，其大小和形状与由抗体天然抗原结合位点的CDR环形成的结合表面或结合口袋相似。因为通过插入另外的氨基酸也可使结构环延长，新生结合位点的结构可被自动调节到它应结合的靶标。例如，特别适合小分子结合的深的结合口袋可优先通过长环(即具有插入到它们之中的额外氛基酸的结构环)来形成；而适合与具有大且扁平的分子表面的靶标结合的相当平坦的结合表面，优先在对结构环上的残基进行不插入额外残基的突变时形成。更具体地说，本文描述的是，通过在连接人或人源化重链可变结构域的卩股A-B,C-D和E-F的环中引入随机突变，可以选出特异性结合人血清蛋白或Fcy受体III的突变结构域，而这两者通常不被人或人源化的免疫球蛋白可变结构域识别和结合。引入的突变包括通过用随机选择的残基置换被选择的野生型序列的氨基酸残基的突变，还包括在上述环中的额外氨基酸残基的插入。因此，优选根据本发明提供按上述方法可获得和生产的经修饰的免疫球蛋白，而且其对抗原、特别是血清白蛋白、细胞受体和补体因子、更特别是人血清白蛋白和Fc受体具有特异性结合位点。具体而言，本发明涉及工程改造免疫球蛋白可变结构域和含有这种与抗原表位特异性结合的结构域的免疫球蛋白的方法。
具体地说，本发明的方法包含以下步骤
-提供编码与至少一个第一表位特异性结合的免疫球蛋白的核酸，而所述免疫球蛋白包含至少两个结构环或环区，
-修饰由所述核酸编码的每个所述结构环或环区的至少一个核苷酸残基，
-将所述经修饰的核酸转移到表达系统中，-表达所述经修饰的免疫球蛋白，
-使所表达的修饰免疫球蛋白可变结构域与所述至少一个第二表位接触，并且
-测定所述修饰免疫球蛋白可变结构域是否与第二表位特异性结合。
优选将此方法应用于免疫球蛋白可变结构域肽。更优选本发明该实施方案的方法涉及经由其CDR区或特定的CDR环构象与所述第一表位结合的免疫球蛋白。
本发明的方法进一步涉及在所述免疫球蛋白可变结构域的至少两个结构环或环区中的每个的至少一个修饰、以及测定所述结构环或环区与至少 一种抗原特异性结合的情况，其中含有未修饰结构环或环区的免疫球蛋白可变结构域不与这样的抗原特异性结合。
本文所用术语"免疫球蛋白"包括免疫球蛋白或免疫球蛋白的组成部分、片段或衍生物。因此它包括按照本发明修饰的"免疫球蛋白可变结构域肽"(本文所用术语免疫球蛋白和抗体是可以互换的)；和免疫球蛋白可变结构域、或它的含有结构环的部分如微型结构域(minidomain)、或这种结构域的结构环。免疫球蛋白可被用作分离的多肽或与其它多肽组合的分子。在某些情况下，优选将确定的修饰结构环或结构环区、或其组成部分用作以结合或组合为目的的分离分子。本文所定义的"免疫球蛋白可变结构域"含有这种在修饰和工程改造后具有特异性结合特性的免疫球蛋白可变结构域肽或多肽。所述肽
与免疫球蛋白可变结构域序列同源，优选长度为至少5个氨基酸，更优选至少10个或甚至至少50或100个氨基酸，至少部分构成可变结构域的结构环区或非CDR环区。优选所述肽排除了那些被认为是非功能氨基酸的插入、杂合或嵌合CDR区或CDR样区和/或CDR区正则结构(canonical tructure)。结合特性涉及与特定表位结合、亲和力和亲合力。
根据本发明的免疫球蛋白衍生物是一种或多种本发明免疫球蛋白的任何组合和或融合蛋白，其中本发明免疫球蛋白的任何结构域或微型结构域可融合在一种或多种其它蛋白(如其它免疫球蛋白、配体、支架蛋白、酶、毒素等等)的任何位置。还可通过重组技术或与其它物质通过诸如共价偶联、静电作用、二硫键等的各种化学技术结合，来获得本发明免疫球蛋白的衍生物。
结合到免疫球蛋白的其它物质可以是脂类、糖类、核酸、有机和无机分子或它们的任何组合(例如PEG、前药或药物)。衍生物还可为具有同样氨基酸序列但完全或部分由非天然的氨基酸或化学修饰的氨基酸制成的免疫球蛋白。
按本发明工程改造的分子被用作独立蛋白以及融合蛋白或衍生物，最典型以这样一种方式融合以致成为较大抗体结构或完整抗体分子的部分、或它的组成部分如Fab片段、Fc片段、Fv片段和其它。用工程改造的蛋白质生产双特异性、三特异性甚至同时携带多种特异性的分子将是可能的，同时根据这种分子的计划用途的需要同时控制和预选结合价数也是可能的。
本发明另一方面涉及除可变结构域CDR环构象之外还具有至少一个环区的免疫球蛋白，其特征为上述的至少一个环区包含形成至少一个修饰环区的至少 一个氨基酸修饰，其中上述的至少 一个修饰环区与抗原的至少一个表位特异性结合。
优选使至少一个经修饰的抗体结构域与至少一种其它结合分子进行分子结合，所述经修饰的抗体结构域通过非可变序列或结构环与 特异性配偶体结合，所述其它结合分子可以是抗体、抗体片段、可溶 性受体、配体或另外的经修饰的抗体结构域。
由本发明免疫球蛋白特异性识别的、起着作为结合对的 一部分作 用的分子优选选自蛋白质分子、核酸和糖类。
本发明免疫球蛋白的修饰环或环区可与任何种类的结合分子或 结构特异性结合，特别是与抗原、蛋白质分子、蛋白质、肽、多肽、
核酸、多聚糖、糖类、脂类、小的有机分子、无机分子或它们的组合 或融合物特异性结合。当然，所述经修饰的免疫球蛋白可包含至少两 个环或环区，由此每个环或环区可与不同的分子或表位特异性结合。
按照本发明，各种细胞表面抗原的抗原结合区或抗原结合位点可 被引入到给定抗体结构的结构环。
本发明免疫球蛋白的结合优选一方面通过CDR区来进行(前提是 该免疫球蛋白含有这样的CDR区)，而在另一方面通过由修饰至少两 个结构环而形成的额外结合位点来进行。那些结构环置于具有一个或 多个修饰的结构环的一个或者至少两个可变结构域上。因此，通过至 少两个可变结构域的至少一个修饰或者至少一个可变结构域的至少 两个修饰，本发明免疫球蛋白在可变结构域的结构环中含有至少两个 修饰。优选经修饰的免疫球蛋白通过改变蛋白质的一级结构或者通过 改变三级结构来展示结合位点，以获得构象特异性结合位点。
以此类推，来自任何类别的免疫球蛋白和来自任何物种免疫球蛋 白的免疫球蛋白可变结构域都可按照这类型工程改造进行处理。此 外，不仅可以对本发明实施例中作为目标的特定环进行操作，还同样 可对免疫球蛋白可变结构域中任何连接(3股的环进行操作。
根据本发明可以将来自任何生物体和任何类别免疫球蛋白的工 程免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域用作例如单结构域或者较大 分子的一部分。例如，它们可以是完整免疫球蛋白的组成部分，因此 该免疫球蛋白具有其"正常的"由6个CDR中的至少 一个形成的抗原结合区和新的工程改造抗原结合位点。照这样，可产生多特异性，例如 双特异性或三特异性免疫球蛋白。所述工程免疫球蛋白结构域也可是 任何融合蛋白的组成部分。
本发明的免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域可为完整的抗体
分子或抗体的部分，所述抗体例如有IgG、 IgA、 IgM、 IgD、 IgE等等。 本发明免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域也可包含以下或由以下 组成功能抗体片段如Fab、 Fab2、 scFv、 Fv或其组成部分、或免疫 球蛋白的其它衍生物或组合如d、抗体(minibody)、可变区重链和轻链 的结构域(如Fd、 VL，包括V入和Vk、 VH、 VHH)以及由被至少两个 结构环连接的两条免疫球蛋白结构域(3股组成的微型结构域(例如，见 Laffly等(2005) Hum Antibodies. 2005; 14 : 33-55)，作为分离的结构域 或在天然締合分子的环境(context)中。
根据本发明修饰的免疫球蛋白可能进一步与一个或多个修饰免 疫球蛋白或未修饰免疫球蛋白或其组成部分结合，得到组合免疫球蛋 白。优选通过重组技术获得组合，也可以通过经吸附、静电相互作用 等的締合，或者通过使用或不使用接头的化学结合来获得。优选的接 头序列是天然接头序列或者是功能合适的人工序列。
可以理解的是，术语"免疫球蛋白"、"免疫球蛋白可变结构域肽" 和"免疫球蛋白可变结构域"还包括衍生物。衍生物是一种或多种免疫 球蛋白的任何组成部分或组合和/或融合蛋白，其中按照本发明获得的 免疫球蛋白的任何结构域或微型结构域可在任何位置与 一种或多种 其它的肽或蛋白质组合或融合(包括但不限于其它的免疫球蛋白、免疫 球蛋白结构域、Fc部分、配体、支架蛋白质、酶、毒素、血清蛋白等 等)。利用各种化学技术如共价偶联、静电相互作用、二硫键等通过将 本发明未修饰或修饰的免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域与其它 物质相结合，也可获得本发明免疫球蛋白的衍生物。
与免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域结合的其它物质可以是 脂类、糖类、核酸、有机和无机分子或其任何组合(例如PEG、前药或药物)。衍生物也是有同样氨基酸序列的免疫球蛋白或免疫球蛋白可 变结构域，但它完全或部分由非天然的、人工或化学修饰的氨基酸组 成。
按照本发明工程改造的分子将被用作独立蛋白质以及融合蛋白 质或衍生物，最通常在修饰前或后以成为较大抗体结构或完全抗体分 子或其组成部分的一部分的方式融合。因此本发明的免疫球蛋白还可
包含Fab片段、Fc片段、Fv片段、单链抗体、特别是单链Fv片段、 双或多特异性scFv、双抗体、多抗体、免疫球蛋白结构域的多价体或 多聚体和其它，或由它们组成。用工程改造的蛋白质制备单特异性、 双特异性、三特异性的分子和甚至可能携带更多特异性的分子将是可 能的。通过本发明，根据这些分子的计划用途的需要同时控制和预选 结合价是可能的。
按照本发明，可将抗原的一个或多个结合位点或者一种或多种抗 原的抗原结合位点引入给定抗体可变域结构的结构环或环区。所述抗 原可以是天然存在的分子或化学合成的分子或重组分子，在溶液或混 悬液中，例如位于如固相的粒子表面或内部、细胞表面或内部或者病 毒表面。令人意想不到的是，甚至当抗原仍粘附或结合在将阻碍其结 合的分子和结构上时，按照本发明仍能够实现免疫球蛋白与抗原的结 合。通过使用在其选择的或天然的环境和结构中的靶抗原，来选出经 修饰和设计的免疫球蛋白，鉴定和获得那些最适用于诊断或治疗用途 的修饰免疫球蛋白是可能的。
本文所用术语"抗原"将包含选自以下的分子过敏原、肿瘤相关 抗原、包括白蛋白的自身抗原、T细胞受体、FcRn、细胞表面受体、 酶、Fc受体、补体系统蛋白、血清分子、细菌抗原、真菌抗原、原生 动物抗原和病毒抗原、还有引起传染性海绵状脑炎(TSE)的分子如感染 性或非感染性的朊病毒和涉及阿尔茨海默症的标记或分子。
在一个优选的实施方案中，所述免疫球蛋白以其修饰的结构环特 异地结合到至少两个这样的表位为相同抗原或不同抗原的、彼此相同或不同的表位。
例如，本发明方法涉及工程改造与至少一个第一表位特异性结 合的免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域，其包含在所述免疫球蛋白 的至少两个结构环或环区的每个中的至少一个修饰；测定所述环或环 区与至少一个第二表位特异性结合的情况，所述表位选自上述抗原， 其中未修饰的结构环或环区(非CDR区)不与所述的至少一个第二表 位特异地结合。
本文所用术语抗原将具体包括作为整个靶分子或作为这种分子 的片段(特别是靶标的亚结构，通常称作"表位")的、能够被免疫球蛋 白或抗体结构的结合位点识别的所有抗原和耙分子。
被本发明免疫球蛋白靶向的优选的抗原是那些已经被证明是或 能够产生免疫性的、被免疫应答因子结合的、或免疫学或治疗学相关 的、特别是那些临床功效已被检验的抗原或分子。
本发明术语"抗原"将意指已知与或能够与免疫球蛋白CDR环区 相互作同的分子或结构。与天然抗体有关的现有技术结构环区不与抗 原相互作用但提供整体结构和/或有助于效应分子的结合。
按照一个优选的实施方案，与本发明免疫球蛋白结合的抗原是细 胞表面抗原。术语"细胞表面抗原"包括能够被细胞表面的抗体结构识 别的所有抗原或分子，以及这些分子的片段。优选的"细胞表面抗原" 是那些已经被证明是或能够是免疫学或治疗学相关的、特别是那些临 床前或临床功效已经被检验的抗原。那些介导细胞杀伤活性的细胞表 面分子出于本发明的意图是尤其相关的。本发明免疫球蛋白与至少两 种那些细胞表面分子结合后，免疫系统马上为细胞溶解或细胞死亡作 准备，从而可提供攻击人类细胞的有效手段。
优选抗原选自细胞表面抗原，包括受体、特别是选自erbB受体酪 氨酸激酶(如EGFR、 HER2 、 HER3和HER4,但不仅限于这些)的受 体、TNF受体超家族的分子如Apo-l受体、TNFR1、 TNFR2、神经生 长因子受体NGFR、 CD40、 T细胞表面分子、T细胞受体、T细胞抗原OX40、 TACI受体、BCMA、 Apo-3、 DR4 、 DR5、 DR6、诱杀型 受体如DcRl、 DcR2 、 CAR1、 HVEM、 GITR、 ZTNFR-5、 NTR画1、 TNFL1但不限于这些分子、B细胞表面抗原如CDIO、 CD19、 CD20、 CD21、 CD22、实体瘤或血液癌细胞的抗原或标记、淋巴瘤或白血病 细胞、包括血小板的其它血液细胞，但不限于这些分子。
根据本发明进一步优选的实施方案，与修饰结构环或环区结合的 抗原或分子选自肿瘤相关抗原，特别是EpCAM 、肿瘤相关糖蛋白 -72(TAG-72)、肿瘤相关抗原CA 125、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、 高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、表达Lewis Y相关糖的肿 瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、 CEACAM5、 HMFG PEM、粘蛋白 MUC1、 MUC18和细胞角蛋白肺瘤相关抗原、细菌抗原、病毒抗原、 过敏原、变态反应相关分子IgE、 cKIT和Fc-s-受体I、 IRp60、 IL-5 受体、CCR3、红血球受体(CR1)、人血清白蛋白、小鼠血清白蛋白、 大鼠血清白蛋白、新生Fc卞受体FcRn、 Fc-y-受体Fc卞RI、 Fc-y-RII、 Fc-yRlII、 Fc-a-受体、Fc-s-受体、荧光素、溶菌酶、toll样受体9、促 红细胞生成素、CD2、 CD3、 CD3E、 CD4、 CDll、 CDlla、 CD14、 CD16、 CD18、 CD19、 CD20、 CD22、 CD23、 CD25、 CD28、 CD29、 CD30、 CD32、 CD33 (p67蛋白)、CD38、 CD40、 CD40L、 CD52、 CD54、 CD56、 CD64、 CD80、 CD147、 GD3、 IL-1、 IL-1R、 IL-2、 IL-2R、 IL-4、 IL陽5、 IL-6、 IL-6R、 IL-8、 IL-12、 IL陽15、 IL-18、 IL誦23、 a干扰 素、(3干扰素、y干扰素；TNF-a、 TNF(32、 TNFa、 TNFa卩、TNF-R1、 TNF-RII、 FasL、 CD27L、 CD30L、 4-lBBL、 TRAIL、 RANKL、 TWEAK、 APRIL、 BAFF、 LIGHT、 VEG1、 OX40L、 TRAIL受体-1、 Al腺苷 受体、淋巴毒素(3受体、TACI、 BAFF-R、 EPO; LFA-3、 ICAM-1、 ICAM-3、整联蛋白pi、整联蛋白P2、整联蛋白a4/p7、整联蛋白a2、 整联蛋白a3、整联蛋白a4、整联蛋白a5、整联蛋白a6、整联蛋白av、 aVp3整联蛋白、FGFR-3、角质形成细胞生长因子、VLA-1、 VLA-4、 L-选择蛋白、抗-Id、 E-选择蛋白、HLA、 HLA-DR、 CTLA-4、 T细胞受体、B7-l、 B7-2、 VNR整联蛋白、TGF卩1、 TGF卩2、嗜伊红粒细胞 趋化蛋白1、 BLyS(B-淋巴细胞刺激因子)、补体C5、 IgE、 IgA、 IgD、 IgM、 IgG、因子VE、 CBL、 NCA 90、 EGFR (ErbB画l)、 Her2/neu (ErbB-2)、 Her3 (ErbB-3)、 Her4 (ErbB4)、组织因子、VEGF、 VEGFR、内皮素受 体、VLA-4、糖类如血型抗原和相关糖类、糖基化Galili、促胃液素、 促胃液素受体、肿瘤相关糖类、半抗原NP-帽或NIP-帽、T细胞受体 a/卩、E-选择蛋白、P-糖蛋白、MRP3、 MRP5、谷胱甘肽-S-转移酶pi(多 重耐药蛋白)、a-颗粒膜蛋白(GMP)140、地高辛、胎盘碱性磷酸酶(PLAP) 和睾丸PLAP样碱性磷酸酶、运铁蛋白受体、肝素酶I、人心肌球蛋 白、糖蛋白1Ib/nia(GPlIb/IIIa)、人巨细胞病毒(HCMV)gH包膜糖蛋 白、HIVlIlBgp120、 HCMV、呼吸道合胞体病毒RSV F、 RSVFFgp、 VNR整联蛋白、Hep B gpl20、 CMV、 gp II bllla、 HIV IIIB gpl20 V3环、 呼吸道合胞体病毒(RSV) Fgp、单纯疱疹病毒(HSV)gD糖蛋白、HSV gB 糖蛋白、HCMV gB包膜糖蛋白、产气荚膜梭菌肠毒素及它们的片段。 优选抗原选自病原体抗原、肿瘤相关抗原、酶、底物、自身抗原、 有机分子或过敏原。更优选抗原选自病毒抗原、细菌抗原、来自真核 生物或噬菌体病原体的抗原。优选的病毒抗原包括HAV-、 HBV-、 HCV- 、 HIV I - 、 HIV II -、细小病毒-(Parvovirus-)、流感病毒-(Influenza-)、 HSV-、肝炎病毒(Hepatitis Virus)、黄病毒(Flaviviruses)、 西尼罗病毒(Westnile Virus)、埃波拉病毒(Ebola Virus)、痘病毒 (Pox-Virus)、天花病毒(Smallpox Virus)、麻渗病毒(Measles Virus)、疱 渗病毒(Herpes Virus)、 &泉病毒(Adenovirus)、乳头瘤病毒(Papilloma Vims)、 多瘤病毒(Polyoma Vims)、 细小病毒(Parvovims)、鼻病毒 (Rhinovirus)、柯萨奇病毒(Coxsackie virus)、脊髓灰质炎病毒(Polio Virus)、埃柯病毒(Echovirus)、 曰本脑炎黄病毒(Japanese Encephalitis virus)、登革热病毒(Dengue Virus)、蜱传脑炎病毒(Tick Borne Encephalitis Virus)、 黄热病病毒(Yellow Fever Virus)、 冠4犬病毒 (Coronavirus)、呼吸道合月包病毒(respiratory syncytial virus)、副流感病毒(parainfluenza vims)、拉克罗斯病毒(La Crosse Virus)、拉沙病毒 (Lassa Virus)、狂犬病毒(Rabies Viruse)、轮状病毒(Rotavirus)的抗原； 优选的细菌抗原包括假单胞菌-(Pseudomonas-)、分枝杆菌-(Mycobacterium-)、 葡萄球菌-(Staphylococcus-)、 沙门氏菌-(Salmonella-)、 脑膜炎5求菌-(Meningococcal-)、疏螺》走体-(Borellia-)、李斯特菌-(Listeria)、奈瑟氏球菌-(Neisseria-)、梭菌-(Clostridium-)、埃希氏菌-(Escherichia-)、军团菌- (Legionella-)、芽胞杆菌-(Bacillus-)、乳酸杆菌-(Lactobacillus)、链J求菌-(Streptococcus-)、肠J求菌-(Enterococcus-)、才奉状杆 菌-(Corynebacterium-)、 i若卡氏菌-(Nocardia-)、纟工义艮菌-(Rhodococcus-)、莫 ^立氏菌陽(Moraxella-)、布鲁氏菌(Brucella)、 弯曲片干菌-(Campylobacter-)、 心杆菌-(Cardiobacterium-)、 弗朗西斯氏菌-(Francisella-)、螺杆菌-(Helicobacter-)、嗜血杆菌-(Haemophilus-)、克雷伯氏菌-(Klebsiella-)、志贺 氏菌-(Shigella-)、耶尔森氏菌-(Yersinia-)、弧菌-(Vibrio-)、衣原体隱 (Chlamydia-)、 4勾端螺^走体-(L印tospira-)、立克次氏体-(Rickettsia-)、分牙支 杆菌-(Mycobacterium-),密螺旋体-(Treponema-)、巴尔通氏体-(Bartonella-) 的抗原。优选的致病真核生物的真核抗原包括来自贾弟虫(Giardia)、弓 浆虫(Toxoplasma)、环孑包子虫(Cyclospora)、隐孑包子虫(Cryptosporidium)、毛 形线虫(Trichinella)、酵母、假丝酵母(Candida)、曲霉(Aspergillus)、隐球 菌(Cryptococcus)、芽生酵母(Blast。myces)、组织孢浆菌(Histopasma)、球孢 子菌(Coccidioides)。
本发明的修饰免疫球蛋白可优选与上面公开的分子之一结合。这 些分子还包含过敏原和半抗原。
抗原亚结构通常称为"表位"(例如B-细胞表位、T-细胞表位)，只 要它们是免疫学相关的，即也可被天然抗体或单克隆抗体识别。本发 明术语"表位"意指对于结合结构域或本发明的免疫球蛋白而言可完全
构成特异性结合配偶体或可为特异性结合配偶体一部分的分子结构。
从化学上，表位也可由糖类、肽、脂肪酸、无机物或其衍生物和 其任何组合组成。如果表位是肽或多肽，那么通常所述肽中包含至少3个氨基酸、优选8-50个氨基酸、更优选在大约10-20个之间的氨基 酸。肽的长度没有临界上限，其可包含几乎多肽序列的全长。表位可 以是线性表位或构象表位。线性表位由多肽链一级序列的单个区段组 成。线性表位可以是连续的或重叠的。构象表位由通过折叠多肽形成 三级结构而集合的氨基酸组成，在线性序列中氨基酸不必相互邻近。
特别地，表位是诊断相关分子的最小组成部分，即样品中是否存 在表位与疾病、或健康状况、或制造过程状态、或环境和食物状况定 性或定量相关。表位也可是治疗相关分子的最小组成部分，即可被改 变病程的特异性结合结构域靶向的分子。
除了按照本发明工程改造的免疫球蛋白抗原结合位点以外，还可 进一步将结合能力引入到可变结构域的结构环区或结构环区之外，例 如与其它抗原、小分子、药物或酶、酶的催化部位或酶底物、或与酶
底物的过渡态类似物结合的结合能力。
优选结构环上的新抗原结合位点对于未修饰的免疫球蛋白可变 结构域而言是外源的。因此本质上不被可变结构域结合的外源靶标如 效应分子、血清蛋白或Fc-受体或细胞表面受体，优选作为被本发明 免疫球蛋白可变结构域结合的抗原或结合分子。
在上下文中术语"外源的"意指抗原不被免疫球蛋白的特异CDR 结合区或其它天然或固有的结合区识别。外源的结合配偶体(但不是免 疫球蛋白的天然结合配偶体)因此可被新形成的结构环抗原结合位点 结合。这意味着天然结合配偶体(如Fc-受体或免疫系统效应物)不认为 被对未修饰的免疫球蛋白而言是外源的抗原结合位点结合。
本文所用术语"特异地结合"或"特异性结合"是指在异种分子群中 决定目标相关配体的结合反应。因此在指定的条件下(例如免疫测定条 件)，特异的抗体可变结构与其特定的"靶标"结合并且没有与存在于样 品中的其它分子大量结合。特异性结合意指结合跟据所选择靶标的特 性和高、中、低结合亲和力或亲合力而具有选择性。如果结合常数或 结合动力学相差至少IO倍则通常可实现选择性的结合。术语"表达系统"是指在可操作的连接中包含所需的编码序列和调 控序列的核酸分子，以致用这些序列转化或转染的宿主能够产生所编 码的蛋白质。为了实现有效的转化，表达系统可被包含在载体上，而
相关DNA随后还可整合到宿主染色体中。或者，表达系统可被用作 体外转录/转译。
以下列方式理解本发明的"结构环"或"非CDR环"免疫球蛋白由 具有所谓的免疫球蛋白折叠的结构域构成。实质上，反向平行(3片层 被环所连接形成紧缩的反向平行卩桶。在可变结构域中，结构域的一 些环基本上贡献抗体的特异性，即与抗原的结合。这些环叫做CDR 环。
CDR环位于邻近CDR环的在某些情况下也可称作可变骨架区(称 为"VFR，，)的CDR环区内部。已知VFR也有助于形成通常主要由CDR 环确定的抗体的抗原结合口袋。因此，那些VFR被认为是CDR环区 的组成部分，不适合用于本发明的目的。与这些位于CDR环区内部 或最接近CDR环的VFR相反，可变结构域的其它VFR特别适合于本 发明使用。那是位于CDR环区对面的或者在免疫球蛋白可变结构域C 末端的VFR结构环。
在CDR环区外的抗体可变结构域的所有环贡献了相当多的分子 结构。这些环在本文中定义为结构环或非-CDR环。
免疫球蛋白氨基酸序列的所有编号是根据IMGT编号模式进行编 号的 (IMGT, the international ImMunoGeneTics information system@imgt.cines.fr; http:〃imgt.cines.fr; Lefranc等,1999， Nucleic Acids Res. 27: 209-212; Ruiz等,2000 Nucleic Acids Res. 28: 219-221; Lefranc等,2001， Nucleic Acids Res. 29: 207-209; Lefranc等，2003, Nucleic Acids Res. 31: 307-310; Lefranc等，2005， Dev Comp Immunol 29:185-203)。
根据本发明优选的实施方案，免疫球蛋白可变结构域来源于人、 駱驼、兔、鸡、鼠、狗、马、羊或鼠科动物。因为修饰的免疫球蛋白可用于各种目的，特别是在药物组合物方 面，免疫球蛋白优选来源于人、骆驼或鼠科动物。当然，修饰的免疫 球蛋白也可以是人源化或嵌合免疫球蛋白。在本发明最优选的实施方
化可变结构域。
人源化免疫球蛋白可变结构域具有与天然的人免疫球蛋白可变
结构域序列的至少约50%氨基酸序列同一性，优选至少约55%氨基酸 序列同 一性、更优选至少约60%氨基酸序列同 一性、更优选至少约65% 氨基酸序列同一性、更优选至少约70%氨基酸序列同一性、更优选至 少约75%氨基酸序列同 一性、更优选至少约80%氨基酸序列同 一性、 更优选至少约85%氨基酸序列同一性、更优选至少约90%氨基酸序列 同一性、更优选至少约95%氨基酸序列同一性。
此外，当将所有表面可及的氨基酸与天然的人免疫球蛋白可变结 构域序列的表面可及的氨基酸相比较时，人源化的免疫球蛋白可变结 构域有至少约50%氨基酸序列同一性、优选至少约55%氨基酸序列同 一性、更优选至少约60%氨基酸序列同一性、更优选至少约65%氨基 酸序列同 一性、更优选至少约70%氨基酸序列同 一性、更优选至少约 75%氨基酸序列同 一性、更优选至少约80%氨基酸序列同 一性、更优 选至少约85%氨基酸序列同 一性、更优选至少约90%氨基酸序列同一 性、更优选至少约95%氨基酸序列同一性。
优选的同源性或序列同 一性特别是指骨架区序列的那些同源性 或序列同一性。
本发明优选的免疫球蛋白包含与未修饰结构域有至少50%同源性 的结构域。
术语"同源性"是指多肽在它们的一级、二级、三级结构中相应的 位置上有相同的或保守的残基。该术语也延伸到两个或多个编码同源 多肽的核苷酸序列。
"同源免疫球蛋白结构域"意指本发明的免疫球蛋白，其具有与如本文所公开的全长天然序列免疫球蛋白结构域序列或全长免疫球蛋
白结构域序列的任何其它片段的至少约50%氨基#列同一性。优选 同源免疫球蛋白结构域与如本文所公开的天然免疫球蛋白结构域序 列或全长免疫球蛋白结构域序列的任何其它具体确定的片段具有至 少约50%氨基酸序列同 一性，优选至少约55%氨基酸序列同 一性，更 优选至少约60%氨基酸序列同一性，更优选至少约65%氨基酸序列同 一性，更优选至少约70%氨基酸序列同一性，更优选至少约75%氨基 酸序列同一性，更优选至少约80%氨基酸序列同一性，更优选至少约 85%氨基酸序列同一性，更优选至少约90%氨基酸序列同一性，更优 选至少约95%氨基酸序列同一性。
在本文中鉴定的关于免疫球蛋白结构域序列的"氨基酸序列同一 性百分比(％)"定义为在进行序列比对、必要时为实现最大序列同一 性百分比而引入缺口并且不考虑作为序列同一性组成部分的任何保 守取代之后，与特定免疫球蛋白可变结构域序列氨基酸残基具有同一 性的、候选序列中的氨基酸残基的百分比。为了确定氨基酸序列百分
算机软件如BLAST、 BLAST-2、 ALIGN或Megalign (DNASTAR)软 件来完成。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括 对将被比较的序列的全长进行最大比对所需的任何运算法则。
氨基酸序列同一性％数值可通过使用WU-BLAST-2计算机程序 按照如下所述的来获得(Altschul等 ，Methods in Enzymology 266:460-480 (1996))。大多数WU-BLAST-2检索参数设置为默认值。 那些没有设置为默认值的参数(即可调参数)用下列值进行设定重叠 ^争度(overlap span)=l，重叠分数(overlap fraction)=0.125，字域(word threshold) (T)=l 1 ，得分矩阵-BLOSUM62。当使用WU-BLAST-2时， 氨基酸序列同一性。/o数值通过将以下(a)除以(b)来确定(a)根据WU-BLAST-2 测定，具有来源于天然免疫球蛋白可变结构域序列的目标免 疫球蛋白可变结构域氨基酸序列与目标比较氨基酸序列(即与可为未修饰的免疫球蛋白可变结构域的目标免疫球蛋白可变结构域进行比
较的序列)之间配对相同的氨基酸残基数；(b)目标免疫球蛋白可变结 构域的非随机化部分的氨基酸残基总数。例如，在"包含与氨基酸序列 Y有至少80%氨基酸序列同一性的氨基酸序列X的多肽"的陈述中， 氨基酸序列A是目标比较tt酸序列，氨基酸序列B是目标免疫球蛋 白可变结构域的氨基酸序列。
在优选的实施方案中，本发明的多肽是双特异性抗体、或双特异 性单链抗体、或双特异性Fab或双特异性sdAb。进一步优选的是，所 述多肽包含双特异结构域或其部分。具体实例是指Fab或dAb分子， 其通过位于CDR区对面的新结合位点而具有另外的功能性。为Fab 分子的本发明优选的免疫球蛋白可例如在CH1和/或CL结构域的C末 端环侧上含有一个或两个额外的结合位点。为dAb分子的本发明优选 的免疫球蛋白可例如在Vh, Vhh或VI结构域的C末端环侧上含有额 外的结合位点。通过这些额外的结合位点，可将额外的功能性如延长 的半寿期(例如通过与FcRn或血清蛋白如白蛋白或IgG的结合)、或效 应功能(例如通过与T细胞受体、Clq或CD64的结合)加到分子中去。 根据这些实例，将以合适的大小制备专用的Fab或dAb文库，使得能 够选出针对特定结合配偶体的特异性结合物(binder)。
本发明优选的可变结构域选自VH、 VL，包括Vk和V u VHH 和其组合。当将修饰引入VH、 Vk、 VX或VHH的环或环区，且经修 饰的环或环区包含在氨基酸7-21、氨基酸25-39、氨基酸41-81、氨基 酸83-85、氨基酸89-103或氨基酸106-117内的至少一个修饰时，结 果发现那些修饰是特别有利的。
根据本发明所修饰的来源于人或人源化的免疫球蛋白的结构环 或环区或免疫球蛋白可变结构域优选选自包含氨基酸8-20、氨基酸 44-50、氨基酸67-76和氨基酸89-101，最优选氨基酸位置12-17、氨 基酸位置45-50、氨基酸位置69-75和氨基酸位置93-98的结构环。
在另一个优选的实施方案中，包含氨基酸93-98的结构环或环区中的修饰与包含氨基酸8-20的结构环或环区中的修饰相结合。
以上确定的单独的免疫球蛋白的氨基酸区域指定为适合本发明 修饰目的的环或环区。优选这些修饰的组合(例如至少两个指定环或环 区中的修饰组合)工程改造到本发明的免疫球蛋白中。
优选在包含氨基酸93-98的结构环或环区上的修饰与在一个或多 个其它结构环上的修饰结合。
在一个优选的实施方案中，在包含氨基酸93-98的结构环或环区 的修饰与在包含氨基酸69-75的结构环区的修饰相结合。
最优选包含氨基酸93-98、氨基酸69-75和氨基酸8-20的各个结 构环含有至少 一个氨基酸修饰。
在另一个优选的实施方案中，包含氨基酸93-98、氨基酸69-75、 氨基酸44-50和氨基酸8-20的各个结构环含有至少一个氨基酸修饰。
根据本发明优选的实施方案，鼠科动物来源的免疫球蛋白的结构 环或环区或免疫球蛋白可变结构域(例如VH)包含氨基酸6-20、氨基酸 44-52、氨基酸67-76和氨基酸92-101。
根据本发明另 一个优选的实施方案，骆驼来源的免疫球蛋白的结 构环或环区或免疫球蛋白可变结构域(例如VHH)包含氨基酸7-18、氨 基酸43-55、氨基酸68-75和氨基酸91-101。
骆驼来源的可变结构域或骆驼来源的人源化变体具有以下优势 它们能够很容易地与其它可变结构域结合，例如与其它骆驼来源的修 饰的或天然的VHH结合。骆驼来源的VHH组合的可能性是多价免疫 球蛋白的基础。因此，根据本发明，骆驼来源的经特定修饰的可变结 构域是多价組合，优选具有至少3、更优选具有至少4或5价或VHH。
优选将结构环上的新的抗原结合位点引入到免疫球蛋白，该免疫 球蛋白由至少有一个核苷酸取代、缺失和/或插入的经选择的核酸所编 码。
根据本发明另一个优选的实施方案，在各个至少两个结构环或环 区的至少 一 个核苷的修饰导致在由所述核酸编码的免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域的取代、缺失和/或插入。
免疫球蛋白或抗体可变结构域的至少两个环或环区的修饰可导 致两个或更多个氨基酸的取代、缺失和/或插入，优选点突变、整个环
的氨基酸改变，更优选至少2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14、直到30个氨基酸的改变。然而，插入免疫球蛋白或免疫球 蛋白可变结构域的结构环或环区的氨基酸最大数目在特定情况下可 不超过30个，优选25个，更优选20个氨基酸。
因此，经修饰的序列包含不包括在结构环的保守区内的氨基酸、 为天然存在但对于修饰位点来说是外源的新引入的氨基酸、或天然存 在的氨基酸的取代。当外源的氨基酸选自特定类别的氨基酸如带有特 定极性或疏水性的氨基酸时，可根据本发明获得在随机化位置上富含 特定类别氨基酸的文库。这样的文库也被叫做"集中"库("focused library")。
优选通过随机、半随机或特别是定点随机诱变的方法对至少两个 环或环区进行突变或修饰。
引入修饰的优选方法是定点随机突变。以此方法用随机生成的插 入使环的两个或更多个特定氨基酸残基交换或引入到所述结构环中。 或者优选的是使用组合的方法。
在另一个优选的实施方案中，通过P逸机的、半随机或特别是定点 随机诱变方法来突变或修饰免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域的 至少三个结构环或环区。
这些方法可用于在本发明的免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构 域的所需位置上进行氨基酸修饰。在这些情况下位置的选择是随机 的，或用某种规则对氨基酸进行改变。例如可将某些残基突变成任何 氨基酸，而可将其它残基突变成限定组别(restricted set)的氨基酸。这 可以逐步的方式通过突变和选择的循环交替或同时来实现。
经随机修饰的核酸分子可包含本文所确定的、编码所有已知的天 然存在的氨基酸或其子集(subset)的重复单位。那些含有修饰序列的、其中特定子集的氨基酸用作修饰目的的文库叫做"集中"库。这种文库 的成员在修饰位置上具有这种子集氨基酸的可能性增加，至少比平常
高出两倍，优选至少高3倍乃至至少4倍。这种文库还具有有限或较 低数量的文库成员，以致实际的文库成员数量达到了理论的文库成员 数量。在某些情况下，聚焦文库的文库成员数量不少于理论数量的103 倍，优选不少于102倍，最优选不少于10倍。
本发明的文库可被设计成包含特定免疫球蛋白形式的文库成员 的或由这些文库成员组成的文库。为本发明的目的，那些由特定免疫 球蛋白分子形式组成的文库叫做专用文库(dedicated library)。专用文库 优选含有占大部分的特定形式，至少50%、优选至少60%、更优选至 少70%、更优选至少80%、更优选至少90%、，或基本上由特定抗体 形式组成的文库。优选特定抗体形式，以致根据本发明优选的文库选 自VH文库、VHH文库、Vk文库、V、文库、Fab文库、CH1/CL 文库和CH3文库。特别优选特征为组成分子(composite molecule)内含 有超过一个抗体结构域的文库，如IgG文库或Fc文库。其它优选的 文库是那些含有T细胞受体，形成T细胞受体的文库。进一步优选的 文库是表位文库，其中融合蛋白包含具有表位变体的分子，还能够选 择出有相似结合功能但不同功能性的竟争分子。例示性的文库是 TNFa文库，其中由单个基因包(genetic package)展示了 TNFa融合蛋 白的三聚体。
然而，插入免疫球蛋白环或环区的氨基酸的最大数目最好不超过 30,优选25个，更优选最多20个氨基酸。优选通过本领域已知的和 在本专利申请中公开的方法，用所有可能的氨基酸或选出优选的用于 随机目的的氨基酸，使氨基酸的取代和插入随机或半随机地发生。
修饰位点可以位于特异的单个结构环或结构环区。环区通常由至 少两个、优选至少3个或至少4个4皮此邻近的环组成，可通过形成抗 原结合位点或抗原结合口袋促进抗原的结合。优选一个或多个修饰位 点位于IO个氨基酸区域内，更优选在20、 30、 40、 50、 60、 70、 80、90直至100个氨基酸内，特别在结构环区内形成抗原可空间上接近环 区的表面或口袋。
优选将至少 一个环或环区进行突变或修饰以产生文库，优选通过 随机、半随机或特别是通过定点随机诱变的方法，特别是缺失、交换 或将随机生成的插入引入结构环。另外的优选是使用组合的方法。可 使用任何已知的诱变方法，其中之一是盒式诱变。这些方法可用来在 本发明免疫球蛋白预期的位置上进行氨基酸修饰。在一些情况下，位 置是随机选择的，例如，用任何可能的氨基酸或选择优选的氨基酸使 环序列随机化，或用简化的规则产生氨基酸变化。例如，优选所有残 基可被突变成特定的氨基酸如丙氨酸，称为氨基酸或丙氨酸扫描 (scanning)。这样的方法可与使用选择方法的更尖端的工程改造手段相 结合，以筛选更高水平序列多样性。
本发明优选的方法是指编码免疫球蛋白、免疫球蛋白结构域或其 部分的随机修饰的核酸分子，其包含在具有序列5 ' -NNS-3 ' 、 5'-NNN-3' 、5'-NNB-3'或5'-NNK-3'的结构环编码区内的至少一个核苷 酸重复单位。在一些实施方案中，修饰的核酸包含选自TMT、 WMT、 BMT、脂C、腹G、 MRT、 SRC、 KMT、 RST、 YMT、 MKC、 RSA、 RRC、 NNK、 NNN、 NNS或其任何其组合的核苷密码子(编码依照 IUPAC)。
随机修饰的核酸分子可包含上述确定的编码所有已知天然存在 的氨基酸或其子集的重复单位。
核酸分子的修饰可通过将合成的寡核苷酸引入到较大区段的核 酸中或通过完整核酸分子的从头合成来完成。如果将要编码氨基酸的 子集，那么可用能够减少无义序列组合数量的三核苷酸结构单元来完 成核酸的合成(例如Yanez等Nucleic Acids Res. (2004) 32:el58; Virnekas等Nucleic Acids Res. (1994) 22:5600-5607)。
优选被修饰的位置是暴露于表面的氨基酸。可从已知的抗体可变 结构域的蛋白质结构和通过这种没有实验上确定的结构可用的氨基酸序列的相似或同源性，来判断结构环氨基酸的表面暴露。
在本发明优选的实施方案中，引入到至少两个结构环的修饰包含
至少1、 2、 3、 4、 5、或6个外源氨基酸或在非修饰免疫球蛋白或免 疫球蛋白结构域的结构环各自的位点上的非天然存在的氨基酸。
氨基酸的修饰优先可为偏爱(bias)的，以便引入到已知经常参与蛋 白质之间相互作用的结构环或环区氨基酸(例如，Lea & Stewart (1995) FASEB J. 9:87- 93; Fellhouse等(2006) J. Mol. Biol. 357:100-114; Adib-Conquuy等(1998) International Immunology 10:341-346; Lo Conte等 (1999) J. Mol. Biol. 285:2177-2198; Zemlin等(2003) J. Mol. Biol. 334:733-749)。
根据发明的 一个实施方案，依据发明方法得到的免疫球蛋白用于 制备具有展示或编码本发明免疫球蛋白的成员的文库，特别是蛋白 质、融合蛋白、细胞的文库、尤其是微生物细胞，像细菌或酵母细胞、 噬菌体、病毒、核酸或核糖体文库。
下列说明不仅涉及多肽或蛋白质变体的文库，当然还涉及例如上 述的用于表达本发明免疫球蛋白的备选文库。 在一个优选的实施方案中，包含本发明免疫球蛋白或免疫球蛋白 可变结构域的多肽变体文库被用作选择的库(pool)，其中所述修饰含有 或引入至少一个、更优选至少两个氨基^/个经修饰的结构环，所述氨 基酸来自色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、 曱硫氨酸、丙氨酸和天冬酰胺。
根据本发明结果发现，可以给变体可变结构域多肽提供对于天然 多肽而言是外源的特定突变。色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、 异亮氨酸、丝氨酸、曱碌u氨酸、丙氨酸和天冬酰胺中的任何一种M 酸都不存在于人天然免疫球蛋白的结构环中，因此被认为是"夕卜源的"。 通过至少一个结构环的修饰并且为了构成结合位点，本发明变体多肽 在结构环中可含有至少两个所述的外源氨基酸。
如果修饰的免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域是来源于人的或人源化的免疫球蛋白可变结构域，那么优选的修饰是在12-17、 45-50、 69-75和93-98的任何一个位置上至少一个酪氨酸的掺入，和/ 或在12-17、 45-50、 69、 71-75、 93-94和96-98的任何一个位置上至 少一个色氨酸的掺入，和/或在12-17、 46、 47、 49、 50、 69-74和93 -98 的任何一个位置上至少一个组氨酸的掺入，和/或在12-17、 45-47、 49、 50、 70-73、 75、 94-96和98的任何一个位置上至少一个天冬酰胺的掺 入，和/或在12-17、 46-50、 69-71、 73-75、 93、 95、 96和98的任何 一个位置上至少一个曱硫氨酸的掺入，和/或13、 71、 75、 94、 95和 98的任何一个位置上至少一个丝氨酸的掺入，和/或在12、 14-17、 45-50、 69、 70、 72-75、 93和96-98的任何一个位置上至少一个异亮 氨酸的掺入，和/或在15、 46、 48、 70-73、 75、 93、 95和98的任何 一个位置上至少一个苯丙氨酸的掺入。
根据本发明另 一个优选的实施方案，在人或人源化单结构域抗体 的15-17、 29-34、 85.4-85.3、 92-94、 97-98和/或108-110位置上的至 少两个氨基酸残基被修饰。
可将编码经修饰的免疫球蛋白或免疫球蛋白结构域(并且贯穿整 篇说明总是包括包含修饰的免疫球蛋白可变结构域的免疫球蛋白和 免疫球蛋白片段)的核酸分子克隆到宿主细胞，使其表达并测定其结合 特异性。用熟知的程序来完成这些实践，在Molecular Cloning-A Laboratory Manual , 3.sup.rd Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 200 l)和Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons)中描述了可在本发明中找到使用的多种方 法。可将编码本发明修饰的免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域的核 酸掺入到表达载体中，以便表达所述的免疫球蛋白。表达载体通常包 含与调控或调节序列可操作连接(即被放在与调控或调节序列有功能 关系的位置)的免疫球蛋白、选择标记、任何融合配偶体和/或另外元 件。可在诱导或引起修饰的免疫球蛋白表达的适当条件下，通过培养 用核酸、优选用含有编码修饰免疫球蛋白的核酸的表达载体转化的宿主细胞来产生本发明修饰的免疫球蛋白，。将外源核酸分子引入宿主 细胞的方法在本技术领域是为人熟知的，并随所使用的宿主而变化。 当然，也可使用适合于修饰免疫球蛋白表达的非细胞或无细胞表达系 统。
在本发明优选的实施方案中，将表达后的修饰的免疫球蛋白纯化 或分离。可用为本技术领域所熟知的多种方式对修饰的免疫球蛋白进 行分离或纯化。标准的纯化方法包括色谱技术、电泳、免疫、沉淀、 透析、过滤、浓缩和层析聚焦技术。通常用特殊的融合配偶体可使纯
化成为可能。例如，如果使用了 GST融合，可用谷胱甘肽树脂纯化抗 体，如果使用了His标签，可用N产-亲和色谱法纯化抗体，或者如果 使用了 flag标签，可用固定化的抗-flag抗体纯化抗体。对于合适的纯 4b才支术的一般指南，参见例如Scopes, "Protein Purification: Principles and Practice", 1994，第3版，Springer-Science and Business Media Inc., NY or Roe, "Protein Purification Techniques : A Practical Approach", 2001， Oxford University Press。当然，在宿主表面特别是在细菌、昆虫 细胞或酵母细胞表面或在噬菌体或病毒表面表达本发明修饰的免疫 球蛋白也是可能的。
可用多种方法筛选本发明的修饰的免疫球蛋白，包括但不限于那 些使用体外测定、体内和基于细胞测定的方法和选择技术。在筛选程 序中可利用自动操作和高通量筛选技术。筛选可利用融合配偶体或标 记的用途，例如酶、免疫标记、同位素标记或小分子标记如荧光或比 色染料或发光分子。
在一个优选的实施方案中，在体外测定中筛选免疫球蛋白的功能 和/或生物物理特性。在一个优选的实施方案中，对抗体功能性进行筛 选，例如它催化反应的能力或其结合特异性、交叉反应性和/或与其靶 标的亲和力。
在另 一个优选的实施方案中，可在体内选择有利的修饰免疫球蛋 白，例如通过将其引入细胞或有机体来进行。可从体液如血液或淋巴液中或从特定器官中分离特异性结合的变体，视所需要的修饰结构域 的特性而定。
可使用多种检测方法进行测定，包括但不限于产色的、焚光的、 发光的或同位素标记物。
如在本领域所熟知的，有多种选择技术可用于鉴定和分离具有某 些结合特性和亲和力的蛋白质，包括例如如下面所描述的展示技术如 噬菌体展示、核糖体展示、细胞表面展示等等。制备和筛选抗体变体
的方法在本领域是为人熟知的。在Antibody Engineering,由0\^&61& Kontermann编辑,Springer-Verlag， Heidelberg, 200l;和Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683-689; Maynard & Georgiou， 2000， Annu Rev Biomed Eng 2:339-76中描述了关于抗体分子生物学、 表达、纯化和筛选的一般方法。
如领域中所知的， 一些筛选方法选择有利的文库成员。这些方法 在本文中称为"选择方法"，这些方法在本发明中在筛选修饰的免疫球 蛋白方面得到应用。当用选择方法筛选变体免疫球蛋白可变结构域文 库时，只有那些有利的、满足某些选择标准的文库成员被增殖、分离 和/或观测到。正如将被意识到的，因为只有最合适的变体才被观测到，
更大的文库。通过任何方法、技术、或共价或非共价连接免疫球蛋白 表型与其基因型(即连接抗体的功能与其编码核酸)的融合配偶体，都 可使选择得以实现。例如通过使文库成员与噬菌体外壳蛋白(最常使用 的是丝状噬菌体基因III蛋白，也可使用其它外壳蛋白如蛋白VIII、蛋 白VII、蛋白VI和蛋白IX)融合，使得噬菌体展示能够作为选择方法
使用。以这种方式，对满足某些标准(例如与免疫球蛋白靶标的结合亲 和力)的修饰免疫球蛋白的选择或分离也选择或分离编码它的核酸。编 码修饰免疫球蛋白的单个基因或多个基因一经分离后马上可进行扩 增。可重复进行这一被称作淘选的分离和扩增过程，使文库中有利的 抗体可变结构域变体得以富集。对附着的核酸进行核酸测序最终允许基因鉴定。
可在本发明发现的、用于筛选免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构 域文库的多种选择方法为本领域已知的。这些方法包括但不限于噬菌
体展示(Phage display of peptides and antibodies: a laboratory manual, Kay等，1996, Academic Press, San Diego, Calif" 1996; Lowman等，1991: Biochemistry 30:10832-10838; Smith, 1985, Science 228:1315-1317)和 其衍生方法例如选择性噬菌体感染(Malmborg等，1997， J Mol Biol 273:544-551)、选择性感染的噬菌体(Krebber等，1997, J Mol Biol 268:619-630)和延迟感染性淘选(panning) (Benhar等，2000, J Mol Biol 301:893-904)，细胞表面展示(Witrrup， 2001, Curr Opin Biotechnol, 12:395-399)例如细菌展示(Georgiou等，1997, Nat Biotechnol 15:29-34; Georgiou等，1993, Trends Biotechnol 11:6-10; Lee等，2000, Nat Biotechnol 18:645-648; Jun等，1998, Nat Biotechnol 16:576-80)、酵母展 示(Boder & Wittrup， 2000, Methods Enzymol 328:430-44; Boder & Wittrup, 1997， Nat Biotechnol 15:553-557)和哺乳动物细胞展示 (Whitehorn等，1995， Bio/technology 13:1215-1219)，以及体外展示技术 (Amstutz等，2001, Curr Opin Biotechnol 12:400-405)如多核糖体展示 (Mattheakis等，1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:9022-9026)、核糖体展 示(Hanes等，1997, Proc Natl Acad Sci USA 94:4937- 4942)、 mRNA展 示(Roberts & Szostak， 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94:12297-12302; Nemoto等，1997, FEBS Lett 414:405-408)和核糖体灭活展示系统(Zhou 等，2002， J Am Chem Soc 124, 538-543)。
在本发明发现使用的其它选择方法包括不依靠展示的方法，例如 体内方法包括但不限于周质表达和细胞计量筛选(Chen等，2001 ， Nat Biotechnol 19:537-542)、抗体片段互补测定(Johnsson & Varshavsky, 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:10340-10344; Pelletier等，1998, Proc Natl Acad Sci USA 95:12141-12146)和酵母双杂交筛选(Fields & Song, 1989， Nature 340:245-246)及以选择模式被使用的酵母双杂交筛选(Visintin et al., 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96:11723-11728)。在一个 备选的实施方案中，与表达载体上特定序列结合的融合配偶体使选择 得以进行，因此共价或非共价地将融合配偶体和相关的免疫球蛋白文 库成员与其编码核酸连接。例如，WO9308278描述了在本发明中可发 现使用的这样的融合配偶体和技术。在一个备选的实施方案中，如果 抗体的表达赋予细胞某些生长、繁殖或存活优势，那么可在体内进行 选择。
一些选择方法称为"定向进化"方法。那些方法包括在选择过程中 对有利序列的进行配对(mating)或选育，有时掺入新的突变。正如为本 领域技术人员所了解的那样，定向进化方法能促进在大多数多肽中最 有利序列的鉴定，能增加被筛选序列的多样性。为本领域所了解的多
变体，包括但不限于DNA改组(PCT WO00/42561; PCT WO 01/70947)、 外显子改组(Kolkman & Stemmer, 2001, Nat Biotechnol 19:423-428)、家 族改组(Crameri等，1998， Nature 391:288-291)、选择性组合随机化 (WO03012100, WO04018674Al)、瞬时模板的随机嵌合方法(Coco等, 2001, Nat Biotechnol 19:354_359)、由在体外重组的交错延伸程序(StEP) 进行的分子进化(Zhao等，1998， Nat Biotechnol 16:258- 261; Shao等, 1998, Nucleic Acids Res 26:681-683)、核酸外切酶介导的基因装配(美 国专利第6,352,842号;美国专利第6,361,974号)、基因位点饱和诱变 (美国专利第6,358,709号)、基因重新装配(美国专利第6，358，709号)、 SCRATCHY(Lutz等，2001, Proc Natl Acad Sci USA 98:11248- 11253)、 DNA片段化方法(Kikuchi等，Gene 236:159- 167)、单链DNA改组 (Kikuchi等，2000， Gene 243:133-137)、定向进化抗体工程技术(应用分 子进化)(美国专利第5,824，514号；美国专利第5 , 817 , 483号；美 国专利第5,814，476号；美国专利第5 ， 763 , 192号；美国专利第5， 723 , 323号)。
在一个优选的实施方案中，用 一种或多种基于细胞测定或体内测定筛选免疫球蛋白或抗体可变结构域变体。对于这些测定，通常将纯 化的或未纯化的修饰免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域从外部加 入，以使细胞暴露于单独的免疫球蛋白或修饰的免疫球蛋白可变结构 域、或属于文库的修饰免疫球蛋白可变结构域的库。这些测定通常但 不总是基于免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域的所需功能，即根据 本发明修饰的抗体或抗体可变结构域与其耙标结合的能力、以及介导 某些生化事件(例如效应功能、配体/受体结合抑制、凋亡等等)的能力。 这样的测定经常涉及监测细胞对抗体可变结构域的反应，例如细胞存 活、细胞死亡、细胞形态变化、或转录激活例如天然基因或报告基因 的细胞表达。例如，这样的测定可测量可变免疫球蛋白结构域变体诱
导ADCC、 ADCP或CDC的能力。对于一些测定，额外的细胞或组 分(即除了靶细胞之外的细胞和组分)可能需要加入，例如血清补体、 或效应细胞例如外周血单核细胞(PBMC)、 NK细胞、巨噬细胞等等。 这样的额外细胞可来自任何生物体，优选人、小鼠、大鼠、兔和猴。 免疫球蛋白可引起某些表达靶标的细胞系的凋亡，或者它们可通过已 被加入测定的免疫细胞介导对靶细胞的攻击。在本技术领域已知的监 测细胞死亡或生存力的方法包括使用染料、免疫化学的、细胞化学的 和放射性的试剂。例如，半胱氨酸蛋白水解酶染色试验能够测量凋亡， 放射性底物或荧光染料的吸收或释放能够监测细胞生长或活化。
可供选择的是，可通过测量一种或多种天然胞内組分例如乳酸脱 氬酶的释放，监测死亡或受损的靶细胞。转录激活也可作为基于细胞 的测定中测定功能的方法。在这种情况下，可通过测定可能被上调的 天然基因来对反应进行监测，例如可测量某些白细胞介素的释放，或 者可另外借助报告系统读出。基于细胞的测定也可包括测量作为对修 饰免疫球蛋白可变结构域的存在作出反应的细胞形态变化。用于这种 测定的细胞类型可以是原核的或真核的，可使用本技术领域所熟知的 多种细胞系。
可供选择的是，可使用经变体免疫球蛋白可变结构域的编码核酸转化或转染的细胞，来完成基于细胞的筛选。在这种情况下，不将本发明抗体可变结构域变体从外部加入所述细胞中(例如Auf der Maur, 2004, Methods, 34:215-224)。在另一个备选的方法中，基于细胞的筛选 利用细胞表面展示。可使用能在细胞表面展示修饰的免疫球蛋白可变 结构域的融合配偶体(Witrrup, 2001， Curr Opin Biotechnol, 12:395-399)。
在一个优选的实施方案中，可用 一种或多种免疫学的或基于细胞 的检测，在实验上改变和确定修饰的免疫球蛋白的免疫原性(例如 Koren 等,2002, Current Pharmaceutical Biotechnology 3:349-360; Chirino等，2004, Drug Discovery Today 9:82誦90; Tangri等，2005, J. Immunol. 174:3187-3196; Hermeling等，2004， Pharm. Res. 21:897-903)。 在一个优选的实施方案中，可利用离体T-细胞活化测定在实验上对免 疫原性进行定量。在该方法中，用目标肽或完整抗体或免疫球蛋白对 来自匹配供体的抗原呈递细胞和幼稚T-细胞进行一次或多次攻击。可 用很多方法4企测T-细胞活化，例如通过监测细胞因子释放或测量氖-胸腺嘧。定脱氧核苷吸收。在优选的实施方案中，LUMINEX技术用于 测量细胞因子释放(例如de Jager等，Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2003, 10:133-139)或者用Elispot测定法监测y干扰素生产(Schmittel等，2000, J. Immunol. Meth., 24: 17-24)。
本发明修饰的免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域的生物学特 性或功能特性可在细胞、组织和完整生物体实验中表现出来。正如在 本领域已知的，为了测量药物治疗疾病或疾病^^莫型的疗效或者测量药 物的药物动力学、毒性和其它特性，经常用包括但不限于小鼠、大鼠、 兔、狗、猫、猪和猴的动物进行药物试验。这些动物可称为疾病模型。 治疗剂经常在包括但不限于棵鼠、SCID小鼠、异种移殖小鼠和转基 因小鼠(包括基因敲入和敲除突变体)的小类中进行试验。这样的实验 方法可为确定多肽变体用作治疗剂的潜力提供有意义的数据。任何生 物体，优选哺乳动物可用于试验。由于与人类具有遗传相似性，猴可
40能是合适的治疗模型，因此可被用来试验本发明修饰的免疫球蛋白的 疗效、毒性、药物动力学或其它特性。在人体中试验的候选药物通常 需要通过作为治疗剂的审批，因此当然这些实验是被考虑在内的。因 此可在人体内试验本发明修饰的免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构 域以确定它们的治效、毒性、免疫原性、药物动力学、药效学和/或其 它临床特性。
本发明的免疫球蛋白可用于在免疫球蛋白技术领域已知的任何 目的，也允许依赖于由本发明引入的特异性组合的应用。
在一个实施方案中，本发明的抗体变体作为诊断、工业化合物或 研究试剂、优选治疗剂用于治疗或预防、制备或分析的用途。抗体变 体可在单克隆、寡克隆或多克隆抗体組成中得到应用。在优选的实施 方案中，本发明修饰的免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域用于杀死 荷有靶抗原的靶细胞，例如癌细胞。在一个备选的实施方案中，本发 明的修饰的免疫球蛋白被用来阻断、拮抗或对抗靶抗原，例如通过拮 抗细胞因子或细胞因子受体。在另一个优选的实施方案中，本发明的 修饰免疫球蛋白被用来阻断、拮抗或抗对靶抗原并杀死荷有靶抗原的 耙细胞。
在备选的优选实施方案中，本发明的修饰的免疫球蛋白被用来阻 断、拮抗或对抗生长因子或生长因子受体并杀死荷有或需要靶抗原的 耙细胞。在备选的优选实施方案中，本发明的修饰的免疫球蛋白被用 来阻断、拮抗或对抗酶或酶的底物。在另一个备选的优选实施方案中， 本发明的修饰的免疫球蛋白可变结构域被用来中和传染性病原体如 病毒、小病毒、朊病毒、细菌或真菌。
本发明的修饰的免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域可用于各 种治疗目的。在一个优选的实施方案中，将包含修饰的免疫球蛋白或 免疫球蛋白可变结构域的抗体给予患者以治疗特定的病症。本发明目 的的"患者，，包括人类和其它动物，优选哺乳动物，最优选人。本文"特 定的病症"意指可通过给予包含本发明修饰的免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域药物組合物而得以改善的病症。
在一个实施方案中，本发明的修饰的免疫球蛋白或免疫球蛋白可 变结构域是给予患者的唯一的治疗活性剂。或者，本发明的修饰的免 疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域与 一 种或多种其它的治疗剂联合 给药，这些治疗剂包括但不限于细胞毒剂、化疗药物、细胞因子、生 长抑制剂、抗激素剂、激酶抑制剂、抗血管形成剂、保心药或其它治 疗剂。修饰的免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域可伴随一种或多种 其它治疗方案进行给药。例如，可配制本发明的抗体变体制剂并连同 化学疗法、放射疗法、或化学疗法和放射疗法一起给予患者。在一个 实施方案中，本发明的修饰的免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域可 与 一种或多种可包含或者不包含本发明的抗体变体的抗体联合给药。 依照本发明的另 一个实施方案，使用本发明的修饰的免疫球蛋白或免 疫球蛋白可变结构域和一种或多种其它的抗癌疗法来离体治疗癌细 胞。考虑的是这样的离体治疗在骨髓移植特别是自体骨髓移植中是有 用的。当然考虑本发明的抗体可与其它治疗技术如外科学结合使用。
多种其它的治疗剂可用于与本发明修饰的免疫球蛋白 一起给药。 在一个实施方案中，修饰的免疫球蛋白与在某种程度上阻断或干扰血 管发展的抗血管形成剂 一起给药。所述抗血管形成因子可例如为结合 到涉及促进血管生成的生长因子或生长因子受体的小分子或蛋白质，
例如抗体、Fc融合蛋白、或细胞因子。本文优选的抗血管生成因子是 结合到血管内皮生长因子(VEGF)的抗体。在一个备选的实施方案中， 修饰的免疫球蛋白与诱导和加强获得性免疫应答的治疗剂例如靶向 CTLA-4的抗体一起给药。在一个备选的实施方案中，所述修饰的免 疫球蛋白与在一定程度上抑制酪氨酸激酶活性的酪氨酸激酶抑制剂 一起给药。在一个备选的实施方案中，本发明的修饰的免疫球蛋白与 细胞因子一起给药。本文所使用的"细胞因子"意指由一个细胞群释放 的、对另 一种细胞起胞间介质包括趋化因子作用的蛋白质的通称。 考虑药物组合物，其中本发明的修饰的免疫球蛋白和一种或多种治疗活性剂进行配制。通过将具有所需纯度的所述修饰的免疫球蛋白 或免疫球蛋白可变结构域与任选的可药用载体、赋形剂或稳定剂
(Remington's Pharmaceutical Sciences, 1980, 16th edition, Osol, A. Ed.)
混合，以冻干制剂或水溶液的形式来制备本发明多肽变体制剂，用于 贮存。用于体内给药的制剂优选是无菌的。这通过经无菌过滤膜的过 滤作用或其它方法容易地完成。所述修饰的免疫球蛋白和本文公开的 其它治疗活性剂也可配制成免疫脂质体和/或包埋在^f殷嚢内。
包含本发明修饰的免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域的药物 组合物的给药，优选以无菌水溶液的形式，可以多种方式实施，包括 但不限于口服给药、皮下给药、静脉内给药、鼻内给药、intraotically、 透皮给药、局部给药(例如，凝胶剂、药膏、洗剂、面霜等等)、腹膜 内给药、肌内给药、肺内给药、阴道给药、胃肠外给药、直肠给药、 或眼内给药。
本发明另一个方面涉及制备由免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结 构域组成的分子或其药物制剂、以及测定所述分子与抗原表位的结合 情况的方法，所述分子在所述免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域的 两个结构环或环区的每个上包含至少一个修饰，其中未修饰的分子明 显不与所述的表位结合，所述方法包含以下步骤
-提供编码包含至少两个结构环或环区的免疫球蛋白可变结构域 的核酸，
-在每个所述的结构环或环区修饰至少一个核苷酸残基， -将所述经修饰的核酸转移到表达系统中， -表达所述经修饰的免疫球蛋白， -使所表达的修饰的免疫球蛋白与表位接触， -确定所述经修饰的免疫球蛋白是否与所述表位结合，和 -提供与所述表位结合的修饰的免疫球蛋白并任选将其制备成药 物制剂。
具体而言，本发明涉及一种方法，所述方法用于制备与至少一个第一分子特异性结合的多特异性分子或其药物制剂，所述特异性分子 在免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域的至少两个结构环或环区中
的每个上包含至少一个修饰；和测定所述至少两个环或环区与至少一 个选自抗原的第二分子的特异性结合情况。含有未修饰的结构环或环 区的免疫球蛋白或免疫球蛋白结构域不与所述至少一个第二分子特 异性结合。
所述方法明确包含以下步骤
-提供编码与至少一个第一分子特异性结合的、包含至少一个结构 环或环区的免疫球蛋白的核酸，
-修饰由所述核酸编码的至少 一个所述环或环区的至少 一个核苷 酸残基，
-将所述经修饰的核酸转移到表达系统中， -表达所述经修饰的免疫球蛋白，
-将所表达的修饰的免疫球蛋白与所述的至少一个第二分子接触，
和
-确定所述经修饰的免疫球蛋白是否与所述第二分子特异性结合
并且
-提供与至少一个第二分子特异性结合的经修饰的免疫球蛋白并 任选将其制备成药物制剂。
优选将多于一个结合位点或至少两种特异性工程改造到特异性 结合的配对的成员中(Kufer等(2004) Trends in Biotechnology第22巻 第238-244页)。
已经做出很多尝试以产生多特异性，例如双特异性、单克隆抗体 或抗体片段。制备由两组不同多肽链(重链和轻链)构成的双特异抗体 的 一个问题是必须在一个细胞中表达4条不同的链(2条重链和2条轻 链)，这致使产生许多不同的分子组合，它们必须与混合物中的所需的 双特异性分子分离。由于它们具有相似性，所以这些分子的分离既困 难又昂贵。已经使用了很多技术使这种不需要的配对的出现最小化(Carter (2001) Journal oflmmunological Methods,第248巻，第7-15页)。
对该问题的 一个解决办法是制备具有两种特异性的 一条多肽链 像例如互相连接两条的scFv或制备所谓的双抗体。这样的分子已经表 明难以折叠成天然分子，且众所周知难以制备(LeGaIl等.(2004) Protein Engineering, Design & Selection第17巻第357- 366页)
根据本发明优选的实施方案，所述表达系统包含载体。本领域已 知的任何表达载体可适当地用于此目的。
修饰的免疫球蛋白优选在宿主中表达，优选在细菌、酵母、植物 细胞、昆虫细胞、动物细胞或哺乳动物细胞或动植物器官或完整的动 物或植物中表达。
各种各样合适的宿主细胞可用于表达本发明修饰的多肽，这些宿
主细胞包括但不限于哺乳动物细胞(动物细胞)、植物细胞、细菌(例如 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli))、昆虫细 胞和酵母(例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae))。例如，在由美国典型培养物保藏中心提供 的ATCC细胞系目录中描述了很多可被用于本发明的细胞系。此外， 植物和动物也可用于本发明免疫球蛋白的表达宿主。根据所使用的宿 主可选择表达和转染载体或盒。
当然还可使用非细胞或无细胞蛋白质表达系统。可生成足够量蛋 白质的体外转录/转译蛋白质表达平台，提供无细胞蛋白质表达系统的 很多优势，排除通常与基于细胞的表达系统相关的繁瑣的上下游步骤 (例如宿主细胞转化、培养或溶解)。
双特异抗体当前设计的另 一个问题是虽然亲本抗体与它们各自 的结合配偶体二价结合(例如IgG)，但是产生的双特异抗体对于各自 的结合配偶体中的 一每种都是单价的。
本发明优选的多特异分子解决了这些问题
使双特异分子作为一条多肽链表达是可能的(具有两种结合特异 性的修饰的免疫球蛋白可变结构域，见实施例部分)，这比表达两条抗体多肽链更容易完成(Cabilly等Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277 (1984))。
也可将其制成抗体样分子(即由两条多肽链构成)。由于事实上第 二特异性位于可变结构域的非CDR部分，所以不需要两条不同的重 链或者不同的轻链。因此，不存在两条链错配的可能性。
本发明抗体可由共同形成与特异性结合配偶体结合的可变CDR 环区(即特异CDR环构象)的重链和轻链组成，而第二特异性可通过包 含在免疫球蛋白分子内的经修饰的结构环或环区(例如重链或轻链可 变结构域的结构环)、同时保持特异的CDR环构象来形成。结合位点 还可通过在两个可变结构域(例如可以是结构上相邻的重链可变结构 域和轻链可变结构域)上的至少一个或多于一个非CDR环形成。
修饰的抗体可以是完全抗体或抗体片段(例如Fab、 scFv、 Fv、小 抗体、dAb)或其衍生物，所述抗体片段包含至少一个免疫球蛋白可变 结构域和在结构环或环区上的修饰。
所述修饰的抗体可与结合配偶体单价或多价结合乃至以不同价 对应不同结合配偶体，视设计而定。例如，可以这种方式工程改造Fab 片>^或者等价的scFv:分别对VH和VL结构域的结构环进行工程改 造，使其结合与由CDR形成的结合位点所结合的相同的表位，从而 分别产生三价的Fab片段或scFv。在另一个实施方案中，含有同样的 工程改造VH和VL结构域的完整免疫球蛋白六价地与其靶表位结合。 如果例如由CDR形成的天然结合位点识别与工程改造的Vh和VI结 构域所识别的不同的靶表位，那么产生的Fab片段或scFv将会与第 一耙标单价结合，与第二靶标二价结合，所述第二靶标被VH和VL 结构域的修饰结构环分别独立地结合。可以多种不同的方式应用该标 准设计原理对于本领域技术人员而言是显而易见的。
因为有很多不同结构环可用于选择和设计重链和轻链结构域的 非CDR区域的特异性结合位点，所以设计具有甚至多于两种特异性 的抗体衍生物是可能的。例如，可分别工程改造通过其CDR识别第一靶标的VH和VL结构域，以使它们通过修饰的结构环所介导的相 互作用特异地与不同的(第二和第三)靶标结合。从而可产生与其靶标 中的每一种单价结合的三特异Fab片段或scFv。如果以完整大小IgG 的形式工程改造该Fab的修饰的可变结构域，那么将产生三特异的且 每种三特异性两价地结合的工程改造IgG。
在一条多肽链内部的特异性结合结构域可用或不用肽接头进行 连接。
一些抗体类别本性上可被视为多特异的，特别是双特异的它们 用可变结构域域与抗原(例如通常是外源结构或癌症相关的结构)结 合，而用Fc部分与Fc效应分子(例如在各种免疫细月包上的Fc受体或 补体蛋白)结合从而激活如ADCC、 ADCP或CDC的效应。
Fc效应分子可被免疫球蛋白分子的Fc部分(对于IgGl而言它由 结构域CH2和CH3组成)结合，已经描述了很多方法优化效应功能， 通过糖基化工程改造技术(US 6,602,684)、或通过直接在Fc上(US 2005/0054832)或间接在Fc外部进行工程改造(US 2005/02444403)的蛋 白质工程。这样的技术已经改变了 Fc区域与Fc受体的结合和/或与补 体蛋白如Cql的结合。通常人们尝试去提高与这样的Fc效应分子的 结合亲合力，因为这与效应功能的提高相关联。
以当前的发明，^没计在天然Fc结合区域外与Fc效应分子结合的 抗体是可能的。可从经修饰的环结构文库中选择抗体可变结构域的经 修饰的环(而非参与与"天然"Fc效应分子结合的环)或将其设计成与一 个或多个Fc效应分子结合。具有这种另外的Fc效应分子结合位点的 抗体将会对某些Fc效应分子或展示Fc效应分子的效应细胞具有更强 的亲和性，因而比糖基化工程抗体或者其他改良的Fc区域具更强的 效应。
与完整抗体相比，抗体片段具有某些优势。片段通常具有好的生 物分布特性，且更易制备。然而，大多数抗体片段设计缺乏效应功能 且体内半寿期短(Holliger P,等Nat Biotechnol . (2005) 23:1126-36)。CHI 、 CK和Ot结构域都不能介导效应功能，这就是为什么Fab分 子通常不表现ADCC、 ADCP或CDC的原因。
WO 02/44215描述了由抗体的抗原结合位点和结合Fc效应分子 的肽组成的结合分子。以这种方式可构建出展示效应功能的抗体片 段。所述肽被掺入到所述结合分子的位置上既不损害抗原结合又不破 坏所述肽与Fc效应分子结合能力。
然而根据本发明，经修饰的免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域 可用作实现与Fc效应分子的结合，为此根据与Fc效应分子的结合情 况，已经对其进行从免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域的固定支架 内的两个、三个或四个随才几化的结构环序列文库中选择。因此，选出 如果从Ig结构域支架中分离则不与Fc效应分子结合的特异环序列是 可能的。因此本发明所产生的多肽可优选由多于100个氨基酸组成并 可包含一个或多个免疫球蛋白可变结构域。
为了选择本发明的这种可变结构域的潜在效应功能，可根据与Fc 受体和/或补体因子如Clq结合情况，来对包含突变可变结构域的抗体 或抗体片段文库进行选择。可在天然表达相应受体的细胞表面或者通 过相应受体胞外部分的表达和純化，提供用于选择的Fey受体。经 IFN-g刺激的U937细胞(CRL-1503,美国典型培养物保藏中心)可被用 作耙细胞以分离经噬菌体展示的与高亲和力IgG受体、FqRI特异性 结合的修饰免疫球蛋白可变结构域(Berntzen等，2006, Protein Eng Des Sel. 19(3) : 121-8)。与Fc受体的结合情况可用U937细胞作为靶细胞 通过FACS进行检验，细胞可用选择的修饰免疫球蛋白可变结构域特 异地染色。此外，可将人Fcy受体的胞外结构域进行克隆、作为可溶 性蛋白或融合蛋白表达并用于分析潜在结合配偶体的特异性结合情 况(例如在Berntzen等，2005, J Immunol Methods, 298 (1-2 ): 93-104)。 可基本上类似地实施对修饰的免疫球蛋白可变结构域与补体因子Clq 特异性结合的鉴定和鉴别(例如在Lauvrak等1997 Biol Chem. 378 (12): 1509-19)。为了增加包含这种可变结构域或由其组成的分子的体内半衰期，
可根据与FcRn或血清白蛋白的结合情况，对本发明的突变可变结构 域文库进行选择。为了与将被设计成体内半寿期增加的分子的那些分 子结合，那些负责通过与血清蛋白或补体蛋白特异性结合来延长分子 的半寿期的修饰的结构环可用作单独的结构环或用在免疫球蛋白或 其部分的前后序列中。
可在天然表达相应受体的细胞表面或者通过表达和纯化相应受 体的胞外部分，来提供用于选择的FcRn受体或其它细胞受体。为本 发明的目的，针对FcRn的第一轮筛选可选出突变的可变结构域(或包 含这种可变结构域的分子)，可进一步对其进行体外试验和更进一步在 FACS实验中通过与表达FcRn受体的细胞结合情况进行鉴定。筛选和 选择也可考虑与FcRn结合的pH依赖性(如在PCT WO02/060919; PCT W097/34631中所述)。可通过与各种重组FcRn、同种型和同种异型结 合的亲和力分级用例如表面等离子共振技术进一步进行表征(例如在 Dall' Acqua等Journal of Immunology, 2002， 169: 5171-5180)。
本发明的修饰的免疫球蛋白可包含重链或轻链或其组成部分和 至少一个可变结构域。
本发明的免疫球蛋白优选包含至少一个免疫球蛋白恒定结构域 和/或至少一个可变结构域或其组成部分。
可变结构域通常被看作免疫球蛋白可变部分的免疫球蛋白折叠 单位，也称为可变区的结构域(例如VH、 Vk、 VI、 Vd)。
本发明另 一 优选的免疫球蛋白由具有至少两个结构环或环区的 重链或轻链可变结构域或其部分组成，其特征是所述的至少两个修 饰结构环或环区包含至少两个氨基酸修饰而形成至少两个修饰的结 构环或环区，其中所述至少两个修饰结构环或环区与至少一个抗原表 位特异地结合。在这样一个优选的本发明免疫球蛋白中，所述的至少 两个氨基酸修饰可位于一个或两个结构环或环区中或者位于一个或 两个结构环上，以构成抗原结合位点。根据本发明优选的实施方案，修饰的多肽与分子的特异性结合是
由选自免疫学测定、优选酶联免疫吸附测定法(ELISA)、表面等离子 共振分析、饱和转移差异核磁共振波i普法、转移NOE (trNOE)核磁共 振波镨法、竟争测定法、组织结合测定、活细胞结合分析和细胞提取 测定(cellular extract assay)的结合分析所决定的。
可用多种本领域已知的方法进行结合测定，包括但不限于以
FRET (荧光共振能量转移)和BRET(生物发光共振能量转移)为基础 的测定法、》文大发光临近同质分析(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)、闪烁亲近测定法、ELISA (酶联免疫吸附测定)、 SPR(表面等离子共振)、等温滴定量热法、差示扫描量热法、凝胶电 泳和包括凝月交过滤的色谱法。
本发明的修饰的多肽优选与标记缀合，所述标记选自有机分子、 酶标记、放射性标记、颜色标记、荧光标记、产色标记、发光标记、 半抗原、地高辛配基、生物素、金属络合物、金属、胶体金以及它们 的混合物。
与上述标记缀合的修饰多肽可用在例如诊断方法中。 修饰的免疫球蛋白可与允许在例如结合测定(例如ELISA)和结合 研究中对所述缀合物进行简单检测的其它分子缀合。
本发明另一方面涉及具有至少两个环或环区的、包含轻链或重链 或其组合的可变结构域的多肽，其特征是所述至少两个结构环或环 区中的每个包含至少 一个氨基酸修饰而形成至少两个修饰的结构环 或环区，其中所述的至少两个修饰结构环或环区与至少一个抗原表位 特异地结合。
优选使至少一个修饰的抗体可变结构域与至少一个其它的结合 分子进行分子结合(combine molecularly)(=通过非可变序列或结构环 与特异配偶体结合)，所述结合分子可以是抗体、抗体片段、可溶性受 体、配体或另外的修饰抗体结构域。
与本发明的至少 一 个修饰的抗体可变结构域结合的其它结合分子选自蛋白质分子、核酸和糖类。
根据发明的修饰免疫蛋白的结构环或环区可与任何种类的结合 分子特异性结合，特别是蛋白质分子、蛋白、肽、多肽、核酸、多糖、 糖类、脂类、小和大的有机分子、无机分子。当然，本发明的修饰的 免疫球蛋白可包含至少两个环或环区，而每一个环或环区可特异地与 不同的分子或表位结合。
本发明的另 一个方面涉及本发明的或通过本发明方法可得到的 免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域用于制备自动免疫疫苗的应用。
因此，所述免疫球蛋白^C用作抗原药物制备疫苗或者用于诱捕(fishing) 或捕获抗原结构而在疫苗配制中使用。
本发明的另 一个方面涉及本发明的或者通过本发明可得到的免 疫球蛋白用于制备包含修饰免疫球蛋白可变结构域的多肽文库的用途。
本发明的另 一个方面更涉及特异性结合和/或检测靶分子的方法， 包含下列步骤
(a) 将包含根据本发明的修饰免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构 域的分子或包含通过本发明的方法可获得的修饰免疫球蛋白可变结 构域的分子与含有或怀疑含有所述靶分子的试样接触，并任选
(b) 检测特异免疫球蛋白/分子或免疫球蛋白可变结构域/分子复合 体的潜在形成情况。
本发明优选的方法用于特异地结合和/或;险测分子，包含下列步
骤
(a) 将本发明的1奮饰免疫3求蛋白(modified immunoglobulins or a modified immunoglobulin)文库与含有所述分子的试样接触，并任选
(b) 检测特异免疫球蛋白/分子复合体的潜在形成情况。 试样可以使人或动物样品，如血样或其它体液和细胞悬浮液，这
些样品可能含有与用于捕获和/或检测的免疫球蛋白特异性结合的靶 分子。本发明另一方面涉及特异地分离靶分子的方法，包含步骤
(a) 将包含根据本发明修饰的免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构
结构域的分子与含有所述靶分子的样品接触，
(b) 分离所形成的特异免疫球蛋白可变结构域/靶分子复合体，并且
(c) 从所述复合体随意分离靶分子。
根据本发明优选的方法用于特异地分离与分子结合的修饰免疫 球蛋白，包含步骤
(a) 将本发明修饰的免疫球蛋白文库与含有所述分子的样品接触，
(b) 分离所形成的特异的修饰免疫球蛋白/分子复合体，并且
(c) 任选从所述复合体分离修饰的免疫球蛋白。 这些样品通常被看作是用于分离制备那些分子的来源，例如复杂
的天然来源像动物、人或植物来源或微生物来源或细胞悬液和培养 物。
样品中特异地分离靶分子。如果使用多特异免疫球蛋白或免疫球蛋白 可变结构域，那么可从样品中分离出超过一种靶分子。在这些方法中 使用免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域特别具有优势，因为它允许 例々口生成具有均一表面(homogeneous surface)的基质(matrix), 所述均 一表面具有确定数量的能够与待分离的靶分子结合的结合配偶体(即 修饰的免疫球蛋白可变结构域)固定于其上。相反，如果使用单特异性 结合配偶体，则不会产生均匀基质，因为单结合配偶体不以同样的效 率结合到基质。
本发明另一方面涉及使化合物靶向靶标的方法，包含步骤
(a) 接触包含本发明的修饰的免疫球蛋白可变结构域的分子或包 含通过本发明的方法可获得的修饰免疫球蛋白的分子，所述分子能够 特异地与所述化合物结合，
(b) 向靶标提供包含免疫球蛋白可变结构域/化合物复合体的分子。本发明修饰的免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域可用于通过
使靶标结合至修饰的结构环区，来向靶标提供通过特异CDR环构象 结合至CDR的至少一种化合物。可用这种免疫球蛋白在疾病治疗过 程中将治疗剂靶向优选的作用位点。
本发明的另 一方面涉及包含、表达或编码本发明或通过本发明方 法可获得的免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域的分子文库。
本发明优选的免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域文库包含至 少IO个免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域，优选100,更优选1000, 更优选10000,更优选100000，最优选超过1000000个变体免疫球蛋 白或可变结构域，其在至少两个结构环或环区上具有修饰。
通常本发明的文库包含至少10个融合蛋白或结合因子(binding agent),优选至少100，更优选至少1000，更优选至少104，更优选至 少105，更优选至少106,更优选至少107，更优选至少108，更优选至 少109，更优选至少101G，更优选至少IO11， 一直到1012,在核糖体展 示的情况下甚至更高的数量也是可行的。
结果发现最优选的文库成员在至少两个结构环或环区具有至少4 个、甚至5个或6个氨基酸位置的突变。因此，本发明特别优选的文 库由在至少两个结构环上具有至少2、 3或4个氨基酸位置的突变的 成员组成。
本发明的文库也可包含选自VH、 Vk、 V人和VHH的免疫球蛋白
可变结构域的其中之一或其混合物或者由它们组成，适合于为商业原
因确定结合配偶体的目的。
构建所述文库的优选方法可在上面以及实施例中找到。本发明的 文库可用于鉴定与特定分子结合的免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域。
本发明特别涉及多肽的蛋白质文库用于设计免疫球蛋白衍生物 的用途，其包含本发明的或者通过本发明的方法获得的免疫球蛋白或 免疫球蛋白可变结构域。可通过^f吏用至少10个、优选100、更优选1000、更优选10000、更优选100000、最优选超过1000000的免疫球
蛋白或变体可变结构域(每个具有至少两个修饰结构环)的相应免疫球蛋白或可变结构域的蛋白质文库，将抗原结合位点引入到免疫球蛋白或可变结构域来改变现有的免疫球蛋白。然后才艮据与特异性抗原的结合情况，对文库进行筛选。在根据所需特性进行分子鉴定后，通过基因工程技术将选出的免疫球蛋白或可变结构域克隆到原免疫球蛋白
以取代野生型区。或者，可仅使编码修饰环或编码突变氨基酸的DNA进行交换，以获得具有额外特异抗原结合位点的免疫球蛋白。或者，可用其天然环境(context)的可变结构域，例如以Fab、 scFv或完整免疫球蛋白分子的形式完成可变结构域结构环上的修饰。除了当制备单
结构域免疫球蛋白、单免疫球蛋白结构域链或单链免疫球蛋白如scFv或单体(unibody)(单价免疫球蛋白片段)时之外，通常本发明的免疫球蛋白作为二聚体、优选异二聚体提供。
对突变的、抗原特异结构环的位点的选择取决于原免疫球蛋白的结构和额外结合位点的目的。如果例如原免疫球蛋白(即亲本免疫球蛋白)是Fab或scFv,那么对轻链和/或重链可变结构域中的至少两个结构环进行修饰是可能的，而且优选对CH1和/或CL结构域中的至少两个结构环进行修饰以生成本发明的免疫球蛋白。因此，本发明的Fab分子可通过CH1和或CL结构域中的修饰的环区而含有新的结合位点。在此情况下通常最重要的是保持特异的CDR环构像和亲本免疫球蛋白、scFv或Fab的天然结合特性。
为了生成文库，可制备在一个或多个可变结构域的两个或多个结构环中具有突变的突变体初始分子文库。对完全突变(completemutate)的初始分子进行选择可具有一些优势，因为根据与抗原的结合情况对修饰的结构环进行选择将将提供立体上有利的修饰。例如，如果完全分子是scFv，那么将会有利的是，根据与抗原的结合情况对突变的初始scFv的文库进行筛选，随后根据与被CDR环识别(初始特异性)的抗原的结合情况对特异性结合物进行筛选。在一个备选的选择程序中，初始(第一)抗原可在根据与抗原结合的情况对修饰的结构环进行
筛选期间结合到CDR环上。如果与抗原的结合受到与第一抗原结合的影响，那么这种同时筛选可允许挽救在连续的选择过程中丢失的克隆。
本发明的优选实施方案是包含以下可变结构域的、或由该可变结构域组成的变体免疫球蛋白文库在至少两个结构环的每一个上具有至少一个变体氨基酸位置的可变结构域。该文库可包含重链和轻链的免疫球蛋白结构域或其混合物和分子组合。
另一个优选的实施方案是包含以下VHH结构域或这种駱驼结构域的人源化形式的、或者由其组成的文库在至少两个结构环或环区的每一个上具有至少一个变体氨基酸位置的VHH结构域或其人源化形式。
本发明另一个优选的实施方案是包含单链抗体的、或由其组成的文库例如scFv文库，其在任何单链抗体或scFv的可变结构域的至少两个结构环或环区的每一个上具有至少一个变体氨基酸位置。
本发明另一个的优选实施方案是双抗体文库，其在双抗体任何可变结构域的至少两个结构环或环区的每一个中包含至少一个变体氨基酸位置或由其组成。
本发明另 一个优选的实施方案是小抗体文库，其在小抗体的任何可变结构域的至少两个结构环或环区的每一个中包含至少一个变体氨基酸位置或由其组成。
本发明另 一个优选的实施方案是Fab文库，其在Fab的任何可变结构域的至少两个结构环或环区的每一个里包含至少一个变体氨基酸位置或由其组成。
本发明另 一个优选的实施方案是抗体或IgG文库，优选人抗体文库，其在抗体或lgG结构域的任何可变结构域的至少两个结构环或环区的每一个里包含至少一个变体氨基酸位置或由其组成。
包含不同突变的免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域或突变的可变抗体结构域的融合分子的文库的大小需要(例如变体的数量)取决于工作任务。 一般来说，重新产生抗体结合位点的文库需比用于进一步修饰(例如提高亲和力或改变对抗原的细微特异性)由修饰的结构环或环区形成的现存的工程抗原结合位点的文库大。
本发明还涉及多肽文库或核酸文库，其包含多种含有免疫球蛋白
或环区的多肽或者其编码核酸。所述文库含有具有不同修饰的成员，其中大多数由在至少两个结构环或环区的修饰所确定。核酸文库优选
包括至少10个不同的成员(具有至少两个潜在的氨基酸修饰)和更优选包括至少100，更优选1000或10000个不同的成员(例如通过随机化
策略或组合技术进行设计)。还优选更具多样性的个体成员数目，如至
少1000000或至少10000000,更优选至少108，更优选至少109，更优选至少101G,更优选至少1011,直到1012，在核糖体展示的情况下更
高的数目也是可行的。
本发明进一步的方面是为了生成多特异免疫球蛋白，从至少两
个本发明文库中选择两个不同的免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域的组合。这些选择的特异免疫球蛋白可变结构域可彼此组合或与其它分子組合，与结构单元相似，设计结构域的最佳排列得到所需的特性如特异性和/或价数的组合。
此外，可在各种或所有不同的蛋白质位点将本发明的一个或多个修饰免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域引入，而不破坏蛋白质结构。通过这种"结构域改组"技术产生可根据所需特性再次进行选择的
新文库。
优选的文库含有本发明的免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域或其衍生物。
本发明优选的实施方案是包含至少一个免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域和根据本发明修饰的、以与抗原结合的至少两个结构环或环区的结合抗原的分子(抗原结合分子)，其中所述的结合分子与它的CDR环没有相关的和/或特异的结合活性。它可包含用作抗体活性的其它部分(例如天然的或修饰的效应区(序列))；然而，它缺乏"天然的"抗体结合区，即在它们天然位置上活性CDR环。本发明这些抗原结合分子具有以上对于该分子所描述的优势，然而没有特异的抗体结合活性；可是在结构环或环区有新引入的特异性结合活性。
对于本发明的抗原结合分子而言，还优选通过随机化技术(即通过随机化技术修饰至少两个结构环的 一个或多个氨基酸残基或者通过将随机生成的插入引入这些结构环内中)，将新的抗原结合位点51入到结构环中。备选优选的是使用组合方法。
根据另一方面，本发明涉及具有抗原结合位点的修饰的免疫球蛋白，所述抗原结合位点对于未修饰的免疫球蛋白来说是外源的并合并到免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域的一个、两个、三个或多个结构环中。本文中术语"外源的"是指抗原结合位点不是由免疫球蛋白可变结构域的特异结构环或环区天然形成。
还根据另一方面，本发明涉及具有抗原结合位点的修饰的免疫球蛋白，所述抗原结合位点对于未修饰的免疫球蛋白而言是外源的并合并到可变结构域的一个、两个、三个或多个结构环上，其中所述修饰的免疫球蛋白以至少103mol-1、至少104mol-1、至少1()5mor1、至少1()6mor1、至少l()7mo1-1、至少l()8mol"、或至少1(fmor1的亲和力与所述抗原结合。
根据本发明通常提供具有中或高亲和力的结合物。优选那些具有中等亲和力的结合物表现解离速率Kd介于10-5-10-7之间，那些具有高亲和力的结合物有已证实的Kd介于10-8-10-1()之间，那些Kd低于l(T9的结合物最优选作为高亲和力的结合物。在某些情况下选择Kd甚至更低例如低于l(T11，通常低到10"2的结合物是合适的。
本发明优选的免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域包含至少两个抗原结合位点，第一位点与第一表位结合，第二位点与第二表位结合。根据优选的实施方案，本免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域包 含至少三个环或环区，第一环或环区与第一表位结合，第二和第三环 或环区与第二表位结合。至少第一或至少第二和第三环或环区或者二 者都含有结构环。本发明免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域包括其
在本领域已知是功能性的片段，其含有根据本发明的基本元件根据 本发明的修饰结构环或环区。
本发明的免疫球蛋白优选由至少两个免疫球蛋白结构域或其包 括微型结构域的部分组成，每个结构域含有至少一个抗原结合位点。 优选的免疫球蛋白结构域对之一是CL/CH1对，可对其进行在位于 CL/CH1对C末端的结构环区的工程改造。由此对一个或两个新的结 合位点进行改造工程。在对特异的CL/CH1结合结构域对进行选择时， 它可与可变结构域VL和VH进行重组，得到在CDR区具有一个"天 然"结合位点和在其对面(即在CL/CH1结构域的C末端结构环区)具有 一个或两个额外的结合位点的Fab分子。
因此，通过修饰含有可变结构域的免疫球蛋白亲本分子可获得本 发明的免疫球蛋白。或者，可对免疫球蛋白恒定结构域进行工程改造， 以获得在结构环区的结合位点，然后将此结构用作结构单元产生与可 变免疫球蛋白结构域和任选与其它恒定结构域的组合，从而产生含有 可变结构域及由结构环或结构环区形成的新结合位点的本发明免疫 球蛋白。
根据本发明该优选的实施方案，提供一种免疫球蛋白，其包含至 少一个免疫球蛋白可变区结构域和至少一个免疫球蛋白恒定区结构 域；例如，在连接到CH1结构域的至少两个结构环中净皮修饰的可变结 构域。
本发明另一方面涉及结合配偶体的试剂盒，包含
(a) 包含具有合并到两个或多个结构环的抗原结合位点的修饰免 疫球蛋白可变结构域的多肽，并且
(b) 包含所述抗原表位的结合分子。优选本发明的结合配偶体试剂盒包含
(a) 本发明修饰的免疫球蛋白文库，并且
(b) 包含抗原表位的结合分子。
根据本发明该试剂盒的这种结合分子可被用来筛选和辨别样品 中或来自文库的天然的或修饰的本发明免疫球蛋白。它可进 一 步用于 鉴定包含本发明修饰的免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域的多肽 的结合特异性。通过使用本发明的该试剂盒的结合分子，可测定本发 明修饰的多肽的效能。
于此所定义的效能是指本发明修饰的分子与其抗原的结合特性。 为了质量控制的目的，可用本领域已知的测定方法根据特异性和/或亲 和力和/或亲合力定性或定量测定结合情况。
此外，本发明试剂盒的结合分子可用于从以上详细说明的文库中 选择包含本发明修饰的免疫球蛋白或免疫球蛋白可变结构域的多肽， 所述文库优选由为至少10、优选至少100、更优选至少1000、更优选 至少10000、尤其至少IOOOOO的在结构环上具有不同修饰的多肽组成。
下列实施例进一步说明本发明。
实施例1: VHH文库的设计
駱駝VHH结构域D2-L24与鸡蛋白溶菌酶的复合晶体结构(在 Brookhaven Database发表，其登录号为1ZVH. Pdb)用来帮助设计突变 的VHH结构域。SEQ ID No. 1给出结构文件IZVH. Pdb的A链序列。
SEQ ID No.l ,
YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAIiHNHYTQKSL.SLSPGKAAA
被用作构建VHH文库基础的序列是来自专利WO04041862A21 、 克隆3E的抗TNFa VHH结构域的序列，在SEQ ID No. 2中给出。SEQ工D No.2
ccatggcccc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgtgac
gagctcnnsn nsnnscaagt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta
tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcagccggagaaca
actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc
tacagcaagc ttaccgtgrm snnsnnsagg tggnnsnnsg ggaacgtctt
ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acacagaaga
gcctctccct gtctccgggt aaagcggccg ca
详细分析1ZVH. Pdb结构并对形成连接p链的环的残基进行目测 之后，决定使SEQIDNo,2的残基13、 15、(即在卩链A和B之间的 环)89、 90、 92和93(即在(3链E和F之间的环)随机化以生成文库。 另外，决定将三个随机化位置插入到SEQ ID No. 2的残基14和15之 间，决定将三个随机化位置插入到SEQ ID No. 2的残基92和93之间。 实施例2: VHH文库的构建
基因。图2显示了序列及其翻译。用下划线标注在文库构建中待随机 化的氨基酸残基。用于克隆的限制性位点包括如下并在图2中显示的 核苷酸序列中用下划线标注Ncol、 BglII和NotI。
合成基因所编码的氨基酸序列在SEQ ID. No.3中给出。
SEQ ID No.3
FLYSKLTVXXXRWXXGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAAA
最前的两个残基和最后的两个残基由用于克隆的限制性位点所
致。编码SEQ ID. No.3的核苷酸序列在SEQIDNo.4中给出。
SEQ ID &o,4: cttgccatgg ccccccgaga accacaggtg tac
最前的两个密码子和最后的两个密码子由用于克隆的限制性位 点所致。
用于合成基因PCR组装的寡核苷酸通过使用公用的软件工具 DNA Works 3.1 (http:〃helixweb.nih.gov/dnaworks/)进行设计，按照标准 实验方案用表l所出示的SEQ ID No. 5-SEQIDNo. 22的18条寡核苷 酸通过PCR进行装配(Hoover DM, Lubkowski J., DNAWorks:用于设 计基于PCR的基因合成用的寡核苷酸的自动化方法(DNAWorks: anoligonucleotides for PCR-based gene synthesis), Nucleic Acids Res. 2002 May 15 ; 30 (10): e43)。
1 -CCATGGCAAGTTCAGCTGCAGGAAAGCGGTGGCGGCCTG (SEQ ID No.5-)2.AGACGCAGGCTGCCGCCAGGCTGGACCAGGCCGCCACCGC(SEQIDNo.6)3.CGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGTGCGGCCAGCGGCCGTACC(SEQIDNo.7)
4 ,AGGTGTAGCCGCTATGGTCGCTAAAGGTACGGCCGCTGGC(SEQIDNo.8)
5，ACCATAGCGGCTACACCTATACCATTGGCTGGTTTCGTCA(SEQIDNo.9)
6，TCACGTTCTTTTCCTGGCGCCTGACGAAACCAGCCAATGG(SEQIDNo.10)
7 ,CGCCAGGAAAAGAACGTGAATTTGTGGCGCGTMTTACTG(SEQIDNo.11)
8 ,ATAGGTATTGCCGCTGCTCCAGTAAATACGCGCCACAAAT(SEQIDNo.12)9.GAGCAGCGGCAATACCTATTATGCGGATAGCGTGAAAGGC(SEQIDNo.13)10.TGTCGCGGCTAATCGCGAAACGGCCTTTCACGCTATCCGC(SEQIDNo.14)11.GCGATTAGCCGCGACMTGCCAAGAACACGGTAGATCTTA(SEQIDNo.15)
12 .'GGCTCCAGGTTGTTCATCGTAAGATCTACCGTGTTCTTGGC(SEQ ID No'.16)
13,CGATGAACAACCTGGAGCCCGAAGACACAGCCGTGTATTA(SEQIDNo.-17)
14 .GCCATCCCGAGCCGCGCAATAATACACGGCTGTGTCTTCG(SEQIDNo.IB)15.GCGGCTCGGGMGGCATTCCGACCAGCCGTAGCGTGGAAA(SEQIDNo..19)
16,CCCTGGCCCCAGTAATTGTAGCTTTCCACGCTACGGCTGG(SEQIDNo,"20)17.CAATTACTGGGGCCAGGGCACCCAGGTGACCGTCAGCTCT(SEQIDNo.21)18.GCGGCCGCAGAGCTGACGGTCACCTG (SEQ ID No. 22)
表1:用于组装编码工程改造的VHH基因的合成基因的寡核苷酸 简要地，将等体积寡核苷酸溶液(每个浓度为约1 mg/ml)混合并用 水稀释使每种寡核苷酸的终浓度为约1 ng/pl。用PCR溶液将寡核苷 酸混合物稀释5倍。组份的终浓度是:每种寡核苷酸0.2 ng/^il, Tris-HCl (pH 8.8) 20 mM, KCl 10 mM, (NH4) 2S0410 mM, MgS04 6 mM， Triton X-100 0.1%(v/v)，牛血清白蛋白0.1 mg/ml，每种dNTP0.2mM, Pfo 聚合酶2.5 U。用于基因組装的PCR方案以一个5分钟95。C的变性步 骤开始，期间加入聚合酶避免任何可能的引物错配(mispriming)("热启 动，，PCR)。该步骤后接包括以下各步的25个循环变性温度95°C 30 s， 退火温度55°C 30 s,延伸温度72°C 1.5 min。该方案的最后一步是72°C 10min保温循环。为了进行基因扩增，用基因组装反应所产生的1 ^ 混合物作为模板，用最外面的寡核苷酸作引物(SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 22)。用于PCR基因扩增的实验方案与用于基因组装的基本上一 样。随后通过在载体pET27b上的Ncol和Notl限制性位点克隆组装的 合 成 VHH 基 因 (Novagen，
http:〃www.merckbiosciences.co.uk/product/69863; http:〃www.novagen.com)并通过DNA测序对序列进行验证。
然后用PCR构建随机化文库。用于最初2次PCR反应的模板是 如上所述的所克隆的合成VHH基因。用于最初2次PCR反应的引物 对如下
3esynmul (gactccatgg . caagtgcaac tgcaggaaag cggaggcggt ctggttrmsc cannsrmsnn
snnsggcagc ctgcgtctga ^ct (SEQ工D No, 23)) 和 3esynmu2 (catgagatct acggtgttct tggcg (SEQ ID No- 24)),- 3esy頭u3 (catgagatct tacgatgnns nnsttgnnsn nsnnsrmsrm sgaagatacg
gcggtgtatt attg (SEQ ID No. 25))和3esyn2 (aatagcggcc
gcagagctca cggtcacc (SEQ ID No. 26) )
产生的PCR产物用BglII消化、连接，连接产物用作PCR反应的模板， 其引物为3esynl (acgtccatgg caagtgcaac tgcag (SEQ ID No. 27))和 3esyn2 (aatagcggcc gcagagctca cggtcacc (SEQ ID No. 26))。将在引物 3esynmul(SEQ ID No. 23)和3esynmu3 (SEQ ID No. 25)上的丽S密码 子在序列中引入随机位置。选择编码所有20种天然存在氨基酸的密 码子NNS(IUPAC编码，S是指C或G)，但要避免3个当中2个终止 密码子。图3显示了 PCR反应和连接程序的示意图。水平箭头显示 PCR引物的位置和方向，垂直线分别显示NcoI、 BglII和NotI位点的 位置(从左到右)。
随后通过Ncol限制位点将这种随纟几化PCR产物克隆到噬菌粒克 隆载体pHENl中，与pe旧分泌信号在同 一读码框内(Hoogenboom HR, Griffiths AD, Johnson KS, Chiswell DJ， Hudson P， Winter G.在丝状噬 菌体表面上的多亚基蛋白用于展示抗体(Fab)重链和轻链的方法 (Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains). Nucleic Acids Res. 1991 Aug 11; 19 (15) : 4133-7)。所述基因3'端的 Notl限制位点使VHH文库插入到与pHENl载体所包含的丝状噬菌体fd的次要外壳蛋白(蛋白m)编码基因在同一个读码框内。随机VHH 文库插入的工程改造序列作为SEQ ID No. 28中的核苷酸序列给出， 并翻译成SEQ ID No. 29的氨基酸序列。SEQ ID No， 29中的字母X表
示随机氨基酸残基。
SEQ ID No, 28'.
1 ccatggcaag tgcaactgca ggaaagcgga ggcggtctgg ttnnsccarm snnsrmsnns
61 ggcagcctgc gtctgagctg cgcggcgtcc ggccgtacct ttagcgacca ttcgggctat
121 acctatacca ttggctggtt ccgtcaggcg ccagggaaag aacgtgaatt tgtggcgcgt
181 atttactgga gcagcggcaa tacctactat gcggatagcg tgaaaggccg ttttgcgatt
241 agccgcgaca tcgccaagaa caccgtagat cttacgatgn nsrmsttgnn snnsrmsnns
301 rmsgaagata cggcggtgta ttattgcgca gcgcgtgacg gcattccgac ctcccgtagc
361 gtggaaagct acsattactg gggccagggc acccaggtga ccgtgagctc tgcggccgc
SEQ ID No. 29:
ETaSRDIAKNTVDI/TMXXLXXXXXEDTAVYYCAARDGIPTSRSVESYNYWGQGTQVTVSSAA
然后将连接产物转化到大肠杆菌TG1中，确定得到的克隆数，通 过限制性分析和DNA测序对许多所选的克隆进行检验。对于表面展 示文库噬菌体制备的下列步骤而言，遵照标准实验方案。简言之，通 过电穿孔将连接混合物转化到大肠杆菌TG1细胞。随后，用辅助噬菌 体M13-K07使噬菌体颗粒从E. coli TGI细胞中释放出来。然后用 PEG/NaCl在两个步骤中将噬菌体颗粒从培养悬浮液沉淀下来，用水 溶解并通过淘选进行选择或者将其储藏在-80 °C。 实施例3:针对人血清白蛋白(HSA)淘选VHH噬菌体文库
按照标准方案进行3轮淘选。(例如肽和抗体的噬菌体展示实验 室手册(Phage display of peptides and antibodies: a laboratory manual), Kay等，1996, Academic Press, San Diego， Calif.)简言之，应用下列方 法。用HAS包被Maxisorp96孔板(Nunc)。向每个孔加入200 pi下列 溶液0.1M碳酸钠緩沖液(pH9.6)、以下浓度的HAS:第一轮淘选 2mg/mlHAS;第二轮淘选lmg/mlHAS;第三轮淘选lmg/mlHAS。 于37°C孵育1小时，随后每个孔加2Q/。奶粉(M-PBS)200 ^il于室温下1小时进行封闭。然后通过加入100 pi噬菌体悬浮液和1004%奶粉 (M-PBS)允许表面展示噬菌体文库与被结合的HAS进行反应，随后室 温下振荡45分钟、静置90分钟来进行孵育。 按如下步骤洗去未结合的噬菌体颗粒。 在第一轮淘选之后10x300 plT-PBS、 5x300 plPBS; 在第二轮淘选之后15x300 plT-PBS、 10x 300 [xl PBS; 在笫三轮淘选之后20x300^1T-PBS、 20x300plPBS。 结合的噬菌体粒子的洗脱通过每孔加入200|il 0.1M甘氨酸(pH 2.2)、室温下振荡孵育30分钟来完成。随后通过力n入60pl2MTris碱 以中和噬菌体悬浮液，然后将10ml对数生长的大肠杆菌TG1培养物 与0.5 ml洗脱的噬菌体混合并于37°C保温30分钟，使噬菌体转染到 大肠杆菌TG1细胞中。最后，将经转染的细菌涂布于含有1%葡萄糖 和100 (ig/ml氨苄青霉素的TYE培养基，于30°C温育过夜。 实施例4:根据HAS选择所选出的VHH突变体克隆的可溶性表达克 隆
以中量制备来分离经过3轮淘选所选出的噬菌体的噬菌粒DNA。 用PCR对编码突变的VHH结构域区的DNA进行分批扩增并克隆 Ncol-Notl到载体pNOTBAD/Myc-His，它是具有插入的Notl限制位 点方便克隆的大肠杆菌表达载体pBAD/Myc-His(Invitrogen)。将所连 接的构建体用电穿孔转化到大肠杆菌LMG194细胞(Invitrogen)，于 30。C在含有1%葡萄糖和氨苄青霉素的TYE培养基上培养过夜。将所 选择的克隆接种到含有氨苄青霉素的200 ^ 2xYT培养基，于30°C培 养过夜，通过加入终浓度为0.1%的L-阿拉伯糖进行诱导。在16。C过 夜表达之后，离心收集细胞并用100 (il硼酸钠緩沖液(pH 8.0)于4。C 过夜处理，以制备胞质提取物。将50 胞质提取物用于ELISA(见下)。 实施例5:根据HSA筛选所得的VHH突变体的ELISA
根据以下方案用ELISA检验根据人血清白蛋白结合情况所选择 的VHH突变体的胞质提取物包被微量滴定板(NUNC， Maxisorp)，每孔100 ^ 含100吗HSA /ml的PBS， 4°C过夜。 洗涤3x200plPBS
封闭含1。/。酪蛋白封闭剂(BlockerCasein)的PBS溶液(Pierce)RT 下lh
洗涤3x200 |il PBS
胞质提取物结合50 pl胞质提取物(实施例4)， 50 pi PBS 0.05%吐 温20，室温过夜
洗涤3x200 pi PBS
第一抗体抗His4(Qiagen)， 1 : 1000在PBS 0 . 05%吐温20 RT下90min，每孔100 pl 洗涤3x200nlPBS
第二抗体山羊抗鼠氺HRP(SIGMA)， 1:1000在PBS 0.05%吐温 20， RT下90min(室温)，每孔100pl 洗涤3x200plPBS
检测含3mg/mlOPD的柠檬酸钠/磷酸钠緩沖液，pH4.5， 0.4 jal 30%H2O2
在背景达到太高之前停止100ml3MH2SO4
读取吸光度492/620 nm 实施例6:其中只对一个环(C"D环)进行随机化的文库的实例
使用编码经工程改造的VHH的合成基因(以上实施例2中所描述 的基因)作为两个PCR反应模板，其中用到以下引物对SEQIDNo. 30 (actgctcgag agacatcgcc aagaacac; esynmu4)和SEQ ID No. 26 (3esyn2) 以及SEQ ID No. 31 (cacactcgag atcgcaaasn nsnnsnncac snnsnncgca tagtaggtat tgcc; 3esynmu5)和SEQ ID No. 27 (3esynl)。产生的PCR产 物用Xhol消化、连接，使用连接产物作为模板与引物3esynl(SEQID No. 27)和3esyn2 (SEQ ID No. 26)进行PCR反应。与在实施例2中所 描述的相似，引物3esynmu4 (SEQ ID No. 30)和3esynmu5 (SEQ ID No.31)的NNS密码子将随机位置引入到序列中。图4显示了 PCR反应和 连接程序的示意图。水平箭头显示PCR引物的位置和方向，垂直线分 别显示NcoI、 Xhol和NotI位点的位置(从左到右)。
随后将该随机化的PCR产物克隆到噬菌粒克隆载体pHENl,与 pe旧分泌信号和载体pHENl所包含的丝状噬菌体fd的次要外壳蛋白 蛋白III)在同 一个读码框中(Hoogenboom HR, Griffiths AD， Johnson KS , Chiswell DJ, Hudson P , Winter G .在丝状噬菌体表面上的多亚基蛋 白用于展示抗体(Fab)重链和轻链的方法(Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage : methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains). Nucleic Acids Res . 1991 Aug 11 ; 19 (15 ): 4133-7)，如在实施例2中所描述。随机化VHH文库插入的工程改造 序列作为SEQ ID No. 32中的核苷酸序列给出，并且被翻译成SEQ ID No. 33中的氨基酸序列。SEQ ID No. 33中的字母X表示随机化的氨 基酸残基。
SEQ ID No. 31 ccatggcaag ttcagctgca ggaaagcggt ggcggcctgg tccagcctgg cggcagcctg 61 cgtctgagct gtgcggccsg cggccgtscc tttagcgscc stagcggcta cacctsitscc 121 attggctgg1; ttcgtcaggc gccaggaaaa gaacgtgaat ttgtggcgcg tatttactgg 181 agcagcggca atacctatta tgcgrmsnns gtgrmsnnsn nsttcgcgat ctcgagagac 241 attgccaaga acacggtaga tcttacgstg aacaacctgg agcccgaaga cacagccgtg 301 tattattgcg cggctcggga tggcattccg accagccgta gcgtggaaag ctacaattac 361 tggggccagg gcacccaggt gaccgtcagc tctgcggccg c
SEQ ID No. 33
FAISRDIAKNTVDLTMN肌EPEDTAVYYCAARDGIPTSRSVESYNYWGQGTQVTVSSAA
然后将连接产物转化到大肠杆菌TGI,测定所得到的克隆数量， 通过限制性分析和DNA测序对许多克隆进行检验。对于下列表面展 示文库噬菌体制备的步骤而言，如在实施例2中所描述的那样遵照标 准实验方案。特异性结合克隆的淘选、选择和鉴定步骤基本上如实施 例3、 4和5中所描述的来进行。
实施例7:其中对三个环(AB、 EF和C"D环)进行随机化的文库的实
66例
使用实施例2中所描述的在AB环和EF环上具有随机化残基的 文库作为模板用于PCR，其中使用与实施例6中的相同的引物对SEQ ID No, 30 (esynmu4)和SEQ ID No, 26 (3esyn2)以及SEQ ID No. 31 (3esynmu5)和SEQ ID No. 27 (3esynl)。用于文库构建、特异性结合克 隆的克隆、淘选、选择和鉴定的随后步骤与实施例2、 3、 4和5中所 描述的基本相同。
实施例8:在一个、二个和三个结构环中具有随机化M酸位置的可 变结构域文库的比较
将文库用于以各种抗原进行的淘选。 鸡蛋溶菌酶作为抗原
进行3轮淘选。通过每孔加入200ial下列溶液，用鸡蛋溶菌酶包 被Maxisorp 96孑L板，
PBS，和下列浓度的溶解的鸡蛋溶菌酶(HEL): 第一轮淘选2mg/mlHEL 第二轮淘选lmg/mlHEL 第三轮淘选lmg/mlHEL
37°C孵育1小时，随后用每孔200 [il的2y。奶粉(M-PBS)室温封 闭1小时。
然后通过加入100 (il噬菌体悬浮液和100 |il 4。/。奶粉(M-PBS)，随 后于室温下振荡45分钟并静置90分钟进行孵育，允许表面展示噬菌 体文库与被结合的鸡蛋白溶菌酶进行反应。 按照以下洗去未结合的噬菌体颗粒 第一轮淘选10x300(ilT-PBS、 5x 300 pl PBS 第二轮淘选15x300(ilT画PBS、 10x300|ilPBS 第三轮淘选20x300 (xlT-PBS、 20 x 300 |il PBS 通过每孔加入200 pi 0.1 M甘氨酸(pH 2.2)并于室温振荡保温30 分钟洗脱被结合的噬菌体颗粒。随后加入60 ^ 2MTris碱中和噬菌体悬液，再通过将10 ml对数生长培养物与0.5 ml洗脱的噬菌体混合并 于37。C孵育30分钟，使其感染到大肠杆菌TG1细胞中。最后，将被 感染的细菌涂布于含有1%葡萄糖和100 i!g/ml氨千青霉素的TYE培 养基，于30。C保温过夜。 人血清白蛋白作抗原
将实施例2、 6和7的文库用于以上所描述的各轮淘选中。具体 而言，将噬菌体文库悬浮在结合緩沖液中(PBS、 1%卵清蛋白、0.005% 吐温20)并用直接固定在maxisorp板上的人血清白蛋白进行淘选(在 PBS中1(Vg/ml， 4。C过夜;用酪蛋白封闭剂(Pierce)封闭该板。两小 时后，通过反复的洗涤(PBS、 0.05。/。吐温20)除去未结合的噬菌体， 被结合的噬菌体用500mMKCl、 10mM HCl(pH2)进行洗脱。
完成每轮HSA特异的淘选之后，根据与TNFa的结合情况对得到 的克隆进行选择或检验。按照WO2004/041862的实施例1中所描述的 根据TNFa特异性进行选择和试验。 FcRn作为抗原
如WO02060919实施例6.2所描述的进行淘选。简言之，将噬菌 体文库重新悬浮于5 ml 20 mM MES(pH 6.0)/5%脱脂牛奶/0.05%吐温 20中，并加入(100pl的5 x 1012 PFU/ml/孔)到预先用l昭鼠类FcRn包 被的Maxisorp免疫板的20个孔内，用5%脱脂牛奶进行阻断。37 。C 孵育2小时之后，用20 mM MES(pH 6攀2%吐温20/0.3 M NaCl 洗涤孔10-30次，在100 plPBS (pH7.4)/孔中、于37。C下孵育30分 钟来洗脱噬菌体。如实施例3所描述，将噬菌体用于重新感染对数生 长期的大肠杆菌TG1。
完成每一轮针对FcRn的淘选之后，如以上所描述的，根据与TNFa 的结合情况对得到的克隆进行选择或检验。
Fc-y受体作为抗原
如在Berntzen等(2006) Protein Eng Des Sel 19:121-128中所描述的 一样，针对Fc-yRI 、 Fc-yRIIA和Fc-yRIIA重组融合蛋白进行淘选。完成每一轮针对Fc-受体的淘选之后，如以上所描述的，根据与 TNFa的结合情况对克隆进行选择或检验。 实施例9:
该实施例证明了向抗体片段引入新的功能或额外结合特异性的 可能性。用作修饰起始点的分子是鼠类单链抗体片段sFv 26-10(Huston 等(1988) Proc Natl Acad Sci USA. 85:5879-5883)。用随机氨基酸序列 对五个不同的文库进行构建，以修饰不同的结构环序列。 文库26-10-1: (SEQIDNO.34)
RFSGXXXXFSGSGSGTDFTLK工SXXXXXXXGIYFCSQTTHVPPTE"GGGTKLE工KR
文库26-10-2: (SEQ ID NO. 35)
RFSGXXXXFSGSGSGTDFTIiKISXXXXXXXGIYFCSQTTHVPPTFGGGTKIjEIKR
文库26-10-3: (SEQ ID NO. 36)
RFSGXVPDRFSGSGSGTDFTljiaSXXXXXXXGIYFCSQTTHVPPTFGGGTKIjEIKR
文库26-10-4: (SEQ ID NO. 3 7)
文库26-10-5: (SEQ ID NO. 3 8)
RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGIYFCSGTTHVPPTFGGGTKIjEIKR
通过序列反向翻译制备文库，其中随机化的氨基酸位置由核苦三
联体NNK所编码。文库26-10-1基因(SEQIDNO. 39)
说明书第64/74页
GACCTTCGGTGGTGGTACCAAACTGGAAATCAAACGT
文库26-10-2基因(SEQIDNO.40)
GACCTTCGGTGGTGGTACCAAACTGGAAATCAAACGT
文库26-10-3基因:(SEQIDN0.41)
'GACCTTCGGTGGTGGTACCAAACTGGAAATCAAACGT
文库26-10-4基因(SEQ ID NO. 42)CGTTCCGCCGACCTTCGGTGGTGGTACCAAACTGGAAATCAAACGT
文库26-10-5基因(SEQIDN0.43)
GACCTTCGGTGGTGGTACCAAACTGGAAATCAAACGT
用化学合成的寡核苷酸对各个基因进行组装，并以所有必要的连 接将其克隆到上述用于噬菌体表面展示的噬菌体展示载体中，以实现
前导肽、sFv变体和噬菌体外壳蛋白m的在同一读码框内翻译。
如实施例8所描述，根据与人血清白蛋白、溶菌酶、FcRn和Fcy 受体结合的结合情况对噬菌体展示文库进行选择。
或者将所述基因与载体pRDV连接，方法类似于在Binz等(2005) Nat Biotechnol. 22:575-582中所描述的，并按照在Schaffitzel等(1999) J Immunol Methods 231:119-135中描述的方法根据人血清白蛋白、Fc-受体和溶菌酶来进;f于淘选。
实施例10:
特异于HIV肽ELDKWA的人抗体2F5用作随机化结构环的支架并表达为scFv。如在实施例9中所描述的那样来进行表达和噬菌体展 示载体构建。从而完成噬菌体选择。
野生型scFv序列和相应文库如图5-8所示。 实施例ll: Fab文库，其中恒定结构域的结构环被随机化
为了从免疫球蛋白结构域文库中选择其中位于结构环的残基被 随机化的特异性结合分子，可应用各种形式。可使用单结构域如VL、 VH、 CH1、 CH2、 CH3、 CH4或CL结构域，可使用由CH2和CH3 结构域组成的Fc片段(包括或不包括铰链区域或其组成部分)，可使用 Fv或单链Fv片段，可使用完整抗体或免疫球蛋白结构域其它组合。 特别受关注的、用于选择特异性结合分子的一种形式是Fab片段，它 是两条链(即抗体的VL-CL部分和VH-CH1部分)的异源二聚体。Fab 片段已被认识很长时间，可通过木瓜蛋白酶水解IgG产生，也可在很 大范围内的不同的表达系统中重组产生，如大肠杆菌(Escherichia coli)、 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、 巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、昆虫细月包或哺乳动物细月包。
为本领域已知的是，表面展示系统如噬菌体展示、酵母展示和其 它系统如核糖体展示等可用于从大文库中富集和选择特异性结合分 子如的Fab片段(例如见Hoogenboom HR、 Griffiths AD、 Johnson KS、 Chiswell DJ、 Hudson P、 Winter G.在丝状噬菌体表面上的多亚基蛋白 用于展示抗体(Fab)重链和轻链的方法(Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage:methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains). Nucleic Acids Res. 1991 Aug 11; 19 (15): 4133-7.; Kang AS， Barbas CF, Janda KD, Benkovic SJ, Lerner RA.通过 在噬菌体表面组装组合的抗体Fab文库连接识别功能和复制功能 (Linkage of recognition and replication ftinctions by assembling combinatorial antibody Fab libraries along phage surfaces). Proc Natl Acad Sci USA. 1991 May 15; 88 (10) : 4363-6.; Kang X， Yang BA， Hu Y, Zhao H, Xiong W, Yang Y, Si B, Zhu Q.通过噬菌体展示制备针对 重症急性呼吸道综合症冠状病毒的人综合Fab分子(Humanneutralizing Fab molecules against severe acute respiratory syndrome coronavirus generated by phage display). Clin Vaccine Immunol. 2006 Aug; 13 (8) : 953-7. ; Weaver-Feldhaus JM, Lou J, Coleman JR， Siegel RW, Marks JD, Feldhaus MJ.用于制备组合Fab文库和表面展示的酵 母杂合(Yeast mating for combinatorial Fab library generation and surface display). FEBS Lett. 2004 Apr 23; 564 (1-2): 24-34.)。
例如，如果将噬菌体展示系统应用于展示Fab片段(例如Fab片段 文库)，那么可将该Fab片段中的一条链例如VH-CHl链与例如噬菌体
Mi3的蛋白m表达为融合蛋白从而使该链展示在噬菌体表面上，而将
另一条链VL-CL以可溶的形式表达并与表面锚定的VH-CH1链形成 天然异源二聚体。在一个典型的Fab表面展示文库中，存在不同的 VH和VL序列，通常可以来源于鼠或人供体，但通过体外的方法如 定点诱变也可产生多样性。不同的结合位点因此而产生，通过使用合 适的展示或其它富集或选择方法，可从这样的通过由VH和VL形成 的结合位点与它们的结合配偶体结合的文库中分离出特异性结合克 隆。
生成的Fab片段通过其VH和VL形成的天然结合位点与一个靶 标结合，通过由它们结构环形成的结合位点与另一个靶目标结合(或与 同样的靶标第二次结合)。为了获得这样的工程改造Fab片段，首先制 备Fab文库，其中结构环的残基被随机化残基置换。还可进行额外残 基的插入。可用这种方法工程改造的结构环可以是VH或VL的C-末端环("底"环)，或者是CHI或CL结构域的N-末端("顶"环)或C-末 端("底"环)。结构域与在任何这些位置上的改造结构环的不同组合也 是可能的。可用于选择特异性结合结构域的一种形式是作为单结构 域、作为Fv或单链Fv片段，或如下所详述的作为Fab片段。
分别编码与人Her2结合的抗体4D5 (Cho HS， Mason K， Ramyar KX, Stanley AM, Gabelli SB, Denney DW Jr, Leahy DJ.单独的或与赫 赛汀Fab复合的HER2胞外区的结构(Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab). Nature.2003 Feb 13; 421 ( 6924 ): 756-60)的VH-CH1和VL-CL的基因用于该 实施例。构建由所述基因的4D5 VL-CL编码部分构成的合成基因，使 其5'端侧翼带有Ncol位点，用于插入到与噬菌粒载体pHENl所含 的pe旧信号序列在同一个读码框内(Hoogenboom HR, Griffiths AD， Johnson KS, Chiswell DJ, Hudson P, Winter G.在丝状噬菌体表面上的 多亚基蛋白用于展示抗体(Fab)重链和轻链的方法(Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light chains). Nucleic Acids Res. 1991 Aug 11; 19 (15) :4133-7),后接终止密码子。在从VL到CL之间 的序列过度位置中，包含唯一的BsiWI限制位点，其与位于VL-CL 编码基因终止密码子下游的唯一 Ascl限制位点结合，随后用于以含有 随机化结构环的文库插入物来置换野生型CL序列。其前面是取自 Carter等.(Carter P, Kelley RF, Rodrigues ML, Snedecor B, Covarrubias M, Velligan MD, Wong WL， Rowland AM, Kotts CE， Carver ME等，二 价人源化抗体片段的高水平大肠杆菌表达和制备(High level Escherichia coli expression and production of a bivalent humanized antibody fragment). Biotechnology (N Y). 1992 Feb; 10 (2) : 163-7)的含 有核糖体结合位点的序列(Shine-Dalgamo序列)，后接编码热稳定肠毒 素II(stII)信号序列的基因片段，该基因片段与编码抗体4D5的部分 的VH-CH1融合在同一个读码框中，随后是用于框内插入到载体 pHENl的Notl位点。该二顺反子结构导致一方面表达VL-CL(其蛋白 质序列在SEQ ID No. 44给出)和另一方面表达融合到噬菌体M13蛋白 质III的被pHENl编码的VH-CHl(其蛋白质序列在SEQ ID No. 45中给 出)。这里所描述的4D5Fab展示载体的完整序列在SEQIDNo.46中 作为核苷酸序列给出。
为了构建其结构环中的残基被随机化的CL结构域文库，制备编 码人K恒定结构域(CL)的合成基因，其中某些密码子被简并密码子例 如NNB (IUPAC编码，其中N代表C、 G、 T和A; B代表T、 C和 G)置换。将额外的残基插入到序列中也是可能的。在该实施例中，分别将3、 4、或5个残基插入到残基127和128之间，而对残基182-185 和187-189进行随机化(Kabat编号方式)。得到的基因的序列作为核苷 酸序列在SEQIDNo.47、 48和49中给出(127和128之间分别有3、 4或5个插入)，作为氨基酸序列在SEQ ID No, 50、 51和52中给出(字 母X代表20个天然编码的氨基酸的任何一个)。这些核普序列包括用 于克隆到SEQ ID No. 46的5'端的BsiWI位点和3'端的AscI位点。
为了构建噬菌体展示文库，用限制性酶BsiWI和AscI酶切Fab 4D5展示载体(SEQ ID No. 46)，用制备性琼脂糖凝胶电泳制备大的片 段。除去对应于编码野生型CL基因的小片段。如上所述的将文库混 合物插入(SEQ ID Nos. 47-49),同样用BsiWI和AscI酶切并连接到纯 化的载体片段中。将连接混合物用例如电穿孔转化到合适的大肠杆菌 菌林如TGl,产生大量单菌落(例如108、 109或更多)。收集经转化的 细菌并用辅助噬菌体(例如M13K07)释放噬菌体颗粒。用标准程序制 备噬菌体颗粒并将其用于文库的淘选。
针对给定的靶标来淘选文库，产生不但与Her2结合(由于结合位 点由抗体4D5的VH和VL形成)而且与对它们针对性选择的靶标结 合的Fab片段。
在该实施例中，描述了 Fab展示文库的设计、制备和使用，其中 CL结构域的结构环是被修饰的。以相似的方式，可制备和使用在其 它结构域如CH1、 VH或VL结构域的结构环中被随机化的文库。序列
SEQ ID No. 44
5 10 15 20 25 30
1MKYI>PTAAAG!>IiAAQPAMADIQMTQSP
31SSSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQ
61KPGKAPK!>ISASFIiYsGVPSRFsGsRSG
91TDFTTISSIiQPEDFATYYCQQHYTTpPTF
121GQGTKVEIKRTVAAPSVFIfPPSDEQKSG
151TASVVC:lIiNFYPREAKVQWKVDNA:lQSGN
181SQESVTEQDSKDSTYSI*SsTI*T1>SKDEK
211HKvYACevTHQG]jSSPvTksfnRGEc
SEQ ID No. 45
5 10 15 20 25 30
1MKKNIAFIiIjASMFVFSITAYAEVQVES
31GGGVQPGGSIjRIiSCAAsGFNIKDTY工HWV
61RQAPGKGEWVAR工YPTGYTRYADSVKGR
91FTISADTsKNTAQNSIjRAEDTAVYCS
121RWGGDGFYAMDYWGQGTIiVTVSSASTKGPS
151VFPIiAPSSKSTSGGTAALGCIjVKDFPEPV
181TVSWNSGATSGVHTE1PAVliQsSGIiYSSs
211VVTVPSSS;lGTQTY工CNVNHKpSNTKVDKK
241VEPKScAAAEQKIi工SEEDNGAA@TVESC
271akphtensftnvwkddkt]jdryanegcw
301NtGVVVCTGDETQCYGTWVP工GIiAIPENE
331gggsegggsegggsegggTkppeygdtpip
361GYTYiNPIjDGTYPPGTEQNPANPNPSIjEES
391QPIjNTFMFQNNRFRMRQGATVTGTVTQG
421TDPVKTYYQYTPVSSKAMYDAYWNgKFRDC
451AFHSGF,■ NEDPFVCEYQGQSSDIiPQPPVNAG
4b1ggsgggsgggsegggsegggsegggseggg
511sgggsgsgdfdyekmanankgamteaden
541A;lQSDAKGKI;DSVAtdYGAA工DGFIGDVSG
571ANGNGATGDFAGSNSQMAQVGDGDNSPIiM
601NNFRQYIjPSPQSVECRPYVGAGKYEFS
631IDCdKINIjFGVFAFIj:lYVATFMYVFSTFA
661IIiHKES
SEQ ID No.* 46
1 gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt 61 cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 121 tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 181 aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 241 ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg<formula>formula see original document page 77</formula>4021 ttacggtaca tgggttccta ttgggcttgc tatccctgaa aatgagggtg gtg,gctctga 4081 gggtggcggt tctgagggtg gcggttctga gggtggcggt actaaacctc ctgagtacgg 4141 tgatacacct attccgggct atacttatat caaccctctc gacggcactt atccgcctgg 4201 tactgagcaa aaccccgcta atcctaatcc ttctcttgag gagtctcagc ctcttaatac 4261 tttcatgttt cagaataata ggttccgaaa taggcagggt gcattaactg tttatacggg 4321 cactgttact caaggcactg accccgttaa aacttattac cagtacactc ctgtatcatc 4381 aaaagccatg tatgacgctt actggaacgg taaattcaga gactgcgctt tccattctgg 4"1 ctttaatgag gatccattcg tttgtgaata tcaaggccaa tcgtctgacc tgcctcaacc 4501 tcctgtcaat gctggcggcg gctctggtgg tggttctggt ggcggctctg agggtggcgg 4561 ctctgagggt ggcggttctg agggtggcgg ctctgagggt ggcggttccg gtggcggctc 4621 cggttccggt gattttgatt atgaaaaaat ggcaaacgct aataaggggg ctatgaccga 4681 aaatgccgat gaaaacgcgc tacagtctga cgctaaaggc aaacttgatt ctgtcgctac 4741 tgattacggt gctgctatcg atggtttcat tggtgacgtt tccggccttg ctaatggtaa 4801 tggtgctact ggtgattttg ctggctctaa ttcccaaatg gctcaajtcg gtgacggtga 4861 taattcacct ttaatgaata atttccgtca atatttacct tctttgcctc agtcggttga 4921 atgtcgccct tatgtctttg gcgctggtaa accatatgaa ttttctattg attgtgacaa 4981 aataaactta ttccgtggtg tctttgcgtt tcttttatat gttgccacct ttatgtatgt 5041 attttcgacg tttgctaaca tactgcataa ggagtcttaa taagaattca ctggccgtcg 5101 ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac 5161 atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac 5221 agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgcc tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt 5281 gcggtatttc acaccgcacg tcaaagcaac catagtacgc gccctgtagc ggcgcattaa 5341 gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc 5401 ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag 5461'ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca 5521 aaaaacttga tttgggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtt.tttc 5581 gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaac" 5641 cactcaaccc tatctcgggc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct 5701 attggttaaa aaatgagctg atttaacssa aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa 5761 cgtttacaat tttatggtgc actctcagta caatctgctc tgatgccgca tagttsagcc 5821 agccccgaca cccgccaaca cccgctgacg cgccctgacg ggcttgtctg ctcccggcat 5881 ccgcttacag acaagctgtg accgtctccg ggagctgcat gtgtcagagg ttttcaccgt 5941 catcaccgaa acgcgcga
SEQ ID No. 47
1 cgtacggtgg cggcgccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gcttaagtct
61 nnbrmbmibg gaactgcctc tgttgtgtgc ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc
121 aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc caatcgggta actcccagga gagtgtcaca
181 gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc ctcagcagca ccctgacgct gnnbnnbnnb
241 rmbtacrmbn nbrmbaaagt ctacgcctgc gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc
301 gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt taataaggcg cgcc
SEQ ID No. 48
1 cgtacggtgg cggcgccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gcttaagtct
61 nnbrmbrmbn nbggaactgc ctctgttgtg tgcctgctga ataacttcta tcccagagag
121 gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc
181 acagagcagg acagcaagga cagcacctac agcctcagca gcaccctgac gctgnnbrmb
241 nnbrmbtacn nbrmbrmbaa agtctacgcc tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctcg
301 cccgtcacaa agagcttcaa caggggsgag tgttaataag gcgcgcc
SEQ ID No. 4 9
1 cgtacgrgtgg cggcgccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gcttaagtct
61 ruibnnbmibn nbrmbggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga
121 gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt
181 gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct gacgctgrmb
241 nnbrmbnnbt acrmbrmbnn baaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc
301 tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgttaat aaggcgcgccSEQ ID No. 50
5 10 15 20 25' 30
1RTVAAPSVFIFPPSDEQ]jKSXXXGTASVVC
31nnfyprEakvQwkVdnAi<QsGNSQESVT
61eQdskDst-ys]jsst:lt:lxxxxyxxxkvyac
91evthQGsspvtksfNRGEc
SEQ工D No. 51
5 10 15 20 25 30
1rtvaapsvfifppsdeQIjksxxxxgtasvv
31C:lIiNNFYPREAKVQWKVDNAIjQsGNSQESV
61TEQDSKDSTYSIiSSTIjTIiXXXXXXXKVYA
91CEVTHQGIjSSPVTKSFNRGEc
SEQ工D No， 52
5 10 15 20 25 30
1RtVAAPSVFIFPPSDEQIjKSXXXXXGTASV
31VC]jIjNNFYPREAKVQWKVDNAIjQsGNSQeS
61VTEQDSKDSTYSI>sST!■TIjXXXXYXXXKVY
91ACEVTHQGIiSSPVTKSFNRGec


图1: SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2的氨基酸序列的序列比对。 图2:编码抗TNF-a骆駝VHH结构域的合成基因的编码序列，
以及以一个字母的氨基酸代号来表示的翻译。用于克隆的限制性位点
在该核苷酸序列中用下划线表示。(插入的氨基酸没在该序列中给出。) 图3显示PCR反应和连接步骤的示意图。水平箭头显示PCR引
物的位置和方向，垂直线分别显示NcoI、 Xhol和NotI位点的位置(从
左到右)。
图4:用于构建实施例6中所述文库的PCR反应流程图。
图5: scFV 2F5野生型合成基因文库1 (VH-接头-VL)和翻译，2
个环^皮随^M匕。
图6: scFV 2F5野生型合成基因文库2 (VH-接头-VL)和翻译，2 个环被随机化
图7: scFV 2F5野生型合成基因文库3 (VH-接头-VL)和翻译，2 个环被随机化
图8: scFV2F5野生型合成基因和翻译(VH-接头-VL)
权利要求
1.一种方法，用于工程改造免疫球蛋白并测定其与抗原表位的结合情况，所述免疫球蛋白包括可变结构域和该免疫球蛋白的至少两个结构环中的至少一个修饰，其中未修饰的免疫球蛋白明显不与所述表位结合；所述方法包含以下步骤-提供编码包含至少两个结构环的免疫球蛋白的核酸，-修饰每个所述结构环的至少一个核苷酸残基，-将所述经修饰的核酸转移到表达系统中，-表达所述经修饰的免疫球蛋白，-使所表达的修饰免疫球蛋白与表位接触，并且-确定所述经修饰的免疫球蛋白是否与所述表位结合。
2. 权利要求1的方法，其中所述免疫球蛋白与至少两个不同的表 位特异性结合。
3. 权利要求1-2中任一项的方法，其特征在于所述免疫球蛋白来 源于人、骆驼或鼠。
4. 权利要求1-3中任一项的方法，其特征在于所述可变结构域选 自VH、 Vk、 VX、 VHH和它们的组合。
5. 权利要求1-4中任一项的方法，其特征在于所述VH、 Vk、 V人或VHH的环在氨基酸7-21、氨基酸25-39、氨基酸41-81、氨基酸 83-85、氨基酸89-103或氨基酸106-117中包含至少一个修饰，其中 所述结构域的氨基酸位置编号是根据IMGT的。
6. 权利要求1-4中任一项的方法，其特征在于所述来源于人的 VH或Vk或V人的环在氨基酸8-20、氨基酸44-50、氨基酸67-76和 氨基酸89-101，最优选氨基酸位置12-17、氨基酸位置45-50、氨基酸 位置69-75和氨基酸位置93-98内包含至少一个修饰，其中所述结构 域的氨基酸位置编号是根据IMGT的。
7. 权利要求1-4中任一项的方法，其特征在于所述来源于鼠的VH环在氨基酸6-20、氨基酸44-52、氨基酸67-76和氨基酸92-101 内包含至少一个修饰，其中所述结构域的氨基酸位置编号是根据 IMGT的。
8. 权利要求1-4中任一项的方法，其特征在于所述来源于駱駝 的VHH环在氨基酸7-18、氨基酸43-55、氨基酸68-75和氨基酸91-101 内包含至少一个修饰，其中所述结构域的氨基酸位置编号是根据 IMGT的。
9. 权利要求1-8中任一项的方法，其特征在于所述经修饰的免 疫球蛋白进一 步与 一 个或多个经修饰的免疫球蛋白或与未修饰免疫 球蛋白或其组成部分组合，得到组合免疫球蛋白。
10. 权利要求9的方法，其特征在于用重组技术组合所述免疫球 蛋白。
11. 权利要求1-10中任一项的方法，其特征在于对核酸的至少 一个核苦酸的修饰导致由所述核酸编码的免疫球蛋白的一个或多个 氨基酸的取代、缺失和/或插入。
12. 权利要求l-ll中任一项的方法，其特征在于每个所述结构环 的至少 一个氨基酸被定点随机突变所修饰。
13. 权利要求12的方法，其特征在于经随机修饰的核酸分子包含 至少一个具有序列5 ' -NNS-3 ' 、 5' -NNN- 3'或5' - NNK-3'的核苷酸重 复单位。
14. 免疫球蛋白用于制备免疫球蛋白文库的用途，所述免疫球蛋 白通过权利要求1-13中任一项的方法获得。
15. 包含至少IO个免疫球蛋白的文库，所述免疫球蛋白通过权利 要求1-13中任一项的方法获得且在至少两个结构环上具有修饰。
16. 权利要求15的文库，其特征在于含有在至少2个结构环上 具有至少4个氨基酸位置突变的免疫球蛋白。
17. 权利要求15-16中任何一项的文库，其特征在于包含至少 10个免疫球蛋白且所述免疫球蛋白含有在结构环中具有修饰的可变结构域。
18. 权利要求15-17中任何一项的文库，其特征在于包含具有 至少2个修饰的可变结构域的免疫球蛋白，所述修饰的可变结构域中 的每 一 个的结构环上具有至少 一 个修饰。
19. 权利要求15-18中任何一项的文库，其特征在于包含在至 少两个结构环上具有至少4个修饰的免疫球蛋白。
20. 权利要求15-19中任何一项的文库，其特征在于包含至少 10个含有经修饰的单链免疫球蛋白的免疫球蛋白，在每个单链免疫球 蛋白的结构环上具有至少两个修饰。
21. 权利要求15-20中任何一项的文库，其特征在于包含至少 10个含有经修饰的VHH结构域的免疫球蛋白，在每个VHH结构域 的结构环上具有至少两个修饰。
22. 权利要求15-21中任何一项的文库，其特征在于包含至少 10个含有经修饰的人抗体的免疫球蛋白，在每个人抗体的结构环区上 具有至少两个修饰。
23. 权利要求15-22中任何一项的文库，其特征在于包含至少 10个含有经修饰的Fab片段的免疫球蛋白，在每个Fab片段的结构环 区上具有至少两个修饰。
24. 权利要求15-23中任何一项的文库，其特征在于包含选自 VH、 Vk、 VX和VHH的免疫球蛋白。
25. 根据权利要求1-13中任何一项的方法可得到的经修饰的免疫点。
26. 权利要求25的经修饰的免疫球蛋白，其中所述抗原是人血清 白蛋白。
27. 权利要求26的经修饰的免疫球蛋白，其中所述抗原是Fc受体。
28. 特异性结合和/或检测分子的方法，包含以下步骤(a) 使权利要求15-24中任何一项的修饰免疫球蛋白的文库或通 过权利要求1-13中任何一项的方法可得到的修饰免疫球蛋白的文库 与含有所述分子的试样接触，并且任选地(b) ;险测特异性免疫球蛋白/分子复合体的潜在形成情况。
29. 特异性分离与分子结合的经修饰的免疫球蛋白的方法，包含 以下步骤(a) 使权利要求15-24中任何一项的修饰免疫球蛋白的文库或通 过权利要求1-13中任何一项的方法可得到的修饰免疫球蛋白的文库 与含有所述分子的样品接触，(b) 分离形成的特异的修饰免疫球蛋白/分子复合体，并且(c) .任选从所述复合体分离修饰的免疫球蛋白。
30. 结合配偶体试剂盒，其含有(a) 权利要求15-24中任何一项的修饰免疫球蛋白的文库或通过 权利要求1-13中任何一项的方法可得到的修饰免疫球蛋白的文库，和(b) 含有抗原表位的结合分子。
31. 权利要求30的试剂盒的结合分子的用途，其用于从权利要求 15-24中任何一项的文库中选择修饰的免疫球蛋白。
32. 变体可变结构域多肽，其包含至少两个经修饰的结构环，其 中每个修饰结构环的至少一个氨基酸选自色氨酸、酪氨酸、苯丙氨 酸、组氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、曱硫氨酸、丙氨酸和天冬酰胺。
33. 权利要求32的变体可变结构域多肽，其特征在于至少一个 修饰结构环包含至少两个所述氨基酸。
34. 权利要求32-33中任何一项的变体可变结构域多肽，其特征 在于它是来源于人或人源化的变体可变结构域多肽，并且在位置12 -17、 45-50、 (69-75和93-98中的任何一个包含至少一个酪氨酸，和/ 或在位置12-17、 45-50、 69、 71-75, 93-94和96-98中的任何一个包含 至少一个色氨酸，和/或在位置12-17、 46、 47、 49、 50、 69-74和93-98 中的任何一个包含至少一个组氨酸，和/或在位置12-17、 45-47、 49、(50、 70-73、 75、 94-96和98中的任何一个包含至少一个天冬酰胺，和 /或在位置12-17、 46-50、 69-71、 73-75、 93、 95、 96-98中的任何一 个包含至少一个曱^^u氨酸，和/或在位置13、 71、 75、 94、 95和98中 的任何一个包含至少一个丝氨酸，和/或在位置12、 14-17、 45-50、 69、 (70、 72-75、 93和96-98中的任何一个包含至少一个异亮氨酸，和/或 在位置15、 46、 48、 70-73、 75、 93、 95和98中的任何一个包含至少 一个苯丙氨酸。
全文摘要
本发明涉及工程改造免疫球蛋白以及测定所述免疫球蛋白与抗原表位结合的方法、由该方法制备的免疫球蛋白、和免疫球蛋白文库，所述免疫球蛋白包含可变结构域和在该免疫球蛋白的至少两个结构环中的至少一个修饰，其中未修饰的免疫球蛋白明显不与所述表位结合，所述方法包含以下步骤提供编码包含至少两个结构环的免疫球蛋白的核酸，修饰每个所述结构环的至少一个核苷残基，将所述经修饰的核酸转移到表达系统中，表达所述经修饰的免疫球蛋白，使所表达的修饰免疫球蛋白与表位接触，并且测定所述修饰免疫球蛋白是否与所述表位结合。
文档编号C07K16/10GK101528775SQ200780032857
公开日2009年9月9日 申请日期2007年7月5日 优先权日2006年7月5日
发明者F·鲁克, G·希姆勒, G·雷德尔 申请人:F-星生物科技研究和发展有限责任公司