专利名称：：Ob-fold作为支架用于工程化新的特异性结合物的制作方法OB-FOLD作为支架用于工程化新的特异性结合物本发明属于蛋白质工程领域。特别地，本发明提供了用于获得特异性结合选自大量配体家族的靶的稳定分子的手段。大多数天然蛋白质不适于治疗或甚至生物技术应用。蛋白质工程的挑战是限定有效和广泛的设计新的或改良的具有所需特性的蛋白质的方法。在耙定特性中，高特异性和亲和性识别配体是非常重要的。对于许多应用，抗体己被使用，这是由于它们特别适合于结合不同种类的配体如蛋白质，肽，核酸，糖等。但是由于分子复杂性和/或稳定性不足，通常抗体或它们的衍生物片段制备困难且昂贵。由于这些原因，最近己发展了使用经组合突变/选择方法工程化的支架蛋白质替代抗体的方法。目的是当去除抗体的缺陷时维持它们的有利特性。已报道该策略的成功应用(Binzetal.,2005;MathonetandFastrez,2004)，其中绝大多数的耙是蛋白质和特别地小有机化合物。本发明的目的是提供用于工程化能很好适用于医学或生物技术应用和能够与多种靶特异性和高亲和力结合的分子的工具，所述靶选自核酸，蛋白质，碳水化合物或任何其他生物学分子。为此，本发明检验假设，即命名为寡核苷酸/寡糖结合折叠区(OB-fold)的一个特殊蛋白质结构可通过其结合面的残基的随机化而修饰，同时至少部分保留亲代蛋白质的有利生物物理学特性(即高稳定性和折叠效率)。由Murzin(Murzin,1993)首先描述的寡核苷酸/寡糖结合折叠区(OB-fold)在所有界中发现并在20个染色体调査中排名为第28个最具代表性的折叠(Qianeta1.，2001)。这个折叠，顶上带有一个两性分子a-螺旋的5链P-桶，似乎适于多种序列。OB-fold呈现一个(3-折叠结合面，其在可被识别的化合物类型上赋予显著的多样性，所述化合物是ssDNA、dsDNA、RNA、寡糖、蛋白质、金属离子和催化底物。来自不同蛋白质的几个OB-fold的研究显示结合核心总是位于结合面的相同位置(Arcus，2002)。Sac7d具有OB-fold拓扑结构(图la)(Agbacketa1.,1998;Gaoetal.，1998;Robinsonetal.,1998;Suetal.，2000)。它属于来自超嗜热古细菌嗜酸热硫化叶菌(5W/o/o6ws的一类小染色体蛋白质。当在DNA中诱导尖锐扭结(sharpkink)时，Sac7d结合双链DNA，不具有任何特定序列优选性(Robinsonetal.,1998)。认为在热硫化叶菌高生长温度时在DNA螺旋稳定化上发挥作用。(最佳为85。C)。Sac7d非常稳定。它耐热并在Tm91°C解折叠，在PH0到IO之间保持天然折叠，当变性剂中点浓度2.8M时，盐酸胍诱导的变性可逆性发生(McCraryetal.,1996)。与抗体相反，它的分子组织非常简单。Sac7d是66个氨基酸、只有一个结构域(即OB-fold)和不具有二硫键的小单体蛋白质(McAfeeetal.，1995)。已经发现Sac7d的几个截短形式(McAfeeetal.，1995)。培养瓶培养大肠杆菌可实现过度生产水平达到可溶性蛋白质10-15mg/l(EdmondsonandShriver,2001)。Sac7d和其来自硫磺矿硫化叶菌(5W/o/o6ws^//"ton'cw)的相近同系物Sso7d的结构研究显示两个蛋白质核心是重叠的并主要经由16个残基形成的扭曲区域结合DNA小沟(Agbacketal.,1998;Gaoetal.，1998;Robinsonetal.,1998)。本发明人已尝试了经体外蛋白质定向进化改变Sac7d的结合特异性的可能性，其引入参与配体结合的大量残基的随机突变，之后选择与给定靶结合的变体。更准确地，本发明人己构建了大约3><1012变体的大文库，其相当于随机取代Sac7d结合面的11个残基。这个文库已被用于经核糖体展示选择能够结合限定蛋白质靶的变体。获得3个蛋白质靶的结合物池(pool),其亲和力在几百纳摩尔范围。在另一个方法中，本发明人扩大了潜在的结合区域达到13和14个残基。这些新文库被用于选择前述的靶之一(PulD-N)和获得亲和力在皮摩尔范围的特异性结合物。因此令人惊奇地，本发明人证明普通DNA结合物(Sac7d)可进化为具有高特异性和亲和力的特异性蛋白质结合物。这个证明提供了证据，即可以从Sac7d或其他OB-fold衍生出对于实质上任何类型配基的结合物，例如通过使用以下更详细描述的方法。因此，本发明的第一方面是OB-fold蛋白质作为起始分子用于通过组合突变/选择方法获得特异性结合靶、特别是起始OB-fold蛋白质不结合的耙即与用作起始分子的OB-fold蛋白质的耙不同的耙的分子的应用。在下文中，起始OB-fold蛋白质的靶将被称为"天然靶"，然而选择步骤中使用的靶将被指定为"感兴趣的靶"。在一个优选的实施方案中，感兴趣的靶子有不同于天然靶的化学性质(例如蛋白质比/核酸，和金属离子或糖比/蛋白质)。因此，本发明的一个特别方面是天然结合核酸的OB-fold蛋白质作为起始分子用于通过组合突变/选择方法获得特异性结合不同于核酸的靶(例如蛋白质)的分子的应用。天然结合蛋白质的OB-fold蛋白质作为起始分子用于通过组合突变/选择方法获得特异性结合非蛋白质靶(例如核酸)的分子的应用也是本发明的一部分。依据本发明，短语"OB-fold蛋白质"被指定为任何多肽，其包含或由具有OB-fold拓扑结构的结构域组成，如(Murzin,1993)和(Arcus,2002)所述。这个拓扑结构相当于在一个末端顶部有一个两性分子a-螺旋的5链P桶的构造。谈到CATH蛋白质结构分类(Pearletal.,2003)，OB-fold拓扑结构相当于2.40.50折叠家族(CATH数据库版本3.0.0:ReleasedMay2006)。这样的OB-fold蛋白质可以是天然蛋白质(即具有与天然蛋白质相同序列的分离纯化或重组的蛋白质)或工程化的蛋白质(例如天然蛋白质的片段或包含来自第一个蛋白质的OB-fold结构域和来自另一个蛋白质的另一部分的融合蛋白)。依据本发明可使用的OB-fold蛋白质的非限定性实例是Sac7d，Sso7d，SEB的N末端结构域(Papageorgiouetal.，1998)，志贺样毒素lie(PDB2bosa)的链A，人嗜中性粒细胞活化肽-2(NAP-2，PDBltvxA)，棕色固氮菌G4zoto6a"wW"e/aw&7)的钼结合蛋白质(modg)(PDBlh9j)，SPE-C的N末端结构域(Rousseletal.，1997)，大肠杆菌(Eco")志贺样毒素的B5亚基，Cdcl3(Mitton-Fryetal.，2002)，人Y-box蛋白质YB-1的冷休克DNA结合结构域(Kloksetal.，2002)，大肠杆菌无机焦磷酸酶EPPase(Samyginaetal.，2001)，或任何列于(Arcus,2002)文章表3的蛋白质例如lkrs(赖氨酰-tRNA合成酶LysS，大肠杆菌)、lcOaA(Asp-tRNA合成酶，大肠杆菌)、lb8aA(Asp-tRNA合成酶，Pybcb^araera&)、llylA(赖氨酰-tRNA合成酶LysU，大肠杆菌)、lquqA(复制蛋白质A，32kDa亚基，人)、lquqB(复制蛋白质A，14kDa亚基，人)、ljmcA(复制蛋白质A，70kDa亚基(RPA70)片段，人)、lotc(端粒-末端-结合蛋白质，O."ova),3ullA(线粒体ssDNA-结合蛋白质，人)、lprtF(百日咳毒素S5亚基，百日咳杆菌(及pw加^))、lbcpD(百日咳毒素S5亚基(ATP结合)，百日咳杆菌)、3chbD(霍乱毒素，霍乱弧菌(KC77o/erae))、ltiiD(热敏感毒素，大肠杆菌)、2bosA(志贺样毒素-l/志贺毒素，B-五聚体，大肠杆菌)、lbr9(TIMP-2,人)、lan8(超抗原SPE-C，化脓性链球菌(5^yoge"es))、3seb(超抗原SPE，金黄色葡萄球菌(S.awmw))、law7A(中毒休克综合征毒素，金黄色葡萄球菌)、ljmc(主要冷休克蛋白质，大肠杆菌)、lbkb(起始转录因子5a,/!"era//^/"w)、lsro(PNPase的SlRNA-结合结构域，大肠杆菌)、ld7qA(起始转录因子l，elFla,人)、lah9(起始转录因子1,IF1，大肠杆菌)、lb9mA(Mo-依赖性转录调控物ModE,大肠杆菌)、lckmA(RNA鸟苷酸转移酶，小球藻病毒，PBCV-1)、la0i(ATP-依赖性DNA连接酶，噬菌体T7)、lsnc(葡萄球菌核酶，金黄色葡萄球菌)、lhjp(DNA解旋酶RuvA亚基，N末端结构域，大肠杆菌)、lpfsA(基因V蛋白质，假单胞菌噬菌体pf3)、lgvp(基因V蛋白质，丝状噬菌体(fl,M13))、lgpc(基因32蛋白质(gp32)核心，噬菌体T4)、lwgjA(无机焦磷酸酶，酿酒酵母OS.cev&^))和2prd(无机焦磷酸酶，嗜热栖热菌(7^ermopMw))。注意的是毒素来源的OB-fold结构域可被用作起始分子，甚至目的是去除毒性，因此在它们结合位点的突变和因此它们结合特异性的改变可完全去除它们的毒性。作为以下实验部分更详细的例证，组合突变/选择方法包括获得相当于起始OB-fold蛋白质的大量选择的残基的随机化(特别地，大量涉及蛋白质与其天然配体结合的残基的随机化)的组合文库，之后是在所述文库选择有所需特性的变体。因此，本发明的另一个目的是组合文库，其相当于OB-fold蛋白质与其天然配体的结合面的5到32、优选8到20、和更优选11到16个残基的随机化，可能与缺失1到4个残基和/或插入1到50残基组合。当然，在此"OB-fold蛋白质的结合面"甚至在有多个结合不同配体的结构域的蛋白质的情况中是指OB-fold结构域和结合这个结构域的配体之间的界面。在科学文献中技术员将发现鉴定涉及OB-fold蛋白质与其天然配体结合的残基的必要信息，所述残基通常位于OB-fold的(3链p3、134和P5和环1、3和4中(图lb和2)。采用来自嗜酸热硫化叶菌的Sac7d或其同系物(图4)例如来自硫磺矿硫化叶菌的Sso7dSso7d可获得本发明的特定组合文库。当然，获得的文库有Sac7d的截短形式，如(McAfeeetal.,1995)所述，也是本发明的一部分。使用网址衡-Blast2(http:〃www.ebi.ac.uk/blast2/index.html)(Lopezetal"2003)、T匿COFFEE(http:〃www.ch.embnet.org/software/TCoffee.html)(Notredameetal.，2000)禾口DALIlite(http:〃www.ebi.ac.uk/DaliLite/)(HolmandPark,2000)将OB-fold结构域的几个序列和3D结构叠加，本发明人己确定可被修饰以获得本发明文库的位置。作为参照，SEQIDNO:1的Sac7d的序列，可以随机化的残基如下V2,K3，K5，K7，Y8，K9,G10，E14，T17,K21,K22,W24,V26，G27,K28，M29，S31，T33，D36，N37，G38，K39，T40,R42,A44，S46,E47，K48,D49,A50和P51。仍以Sac7d作为参考，可被缺失的残基是A59，R60,A61和E64。使用网址DALI(http:〃www.ebi.ac.uk/dali/Interactive.html)(HolmandSander,1998),10个蛋白质或OB-fold结构域(包括Sac7d)的3D结构的叠加揭示这种蛋白质带有不同大小的环，其极可能涉及配体结合(见图2)。这个观察与先前发表的数据一致(Arcus,2002)。因为Sac7d是带有最短环的蛋白质之一，在所述环中可方便的完成随机插入以便获得特别适宜某种配体家族结合的文库。在环3可方便地进行1到15个氨基酸残基的插入(如图lb和2确定)，例如在Sac7d的25到30位残基区域、优选在27到28位残基之间插入，可在环4内进行1到15个氨基酸残基的插入(如图lb和2确定)，例如在Sac7d的35到40位残基区域、优选在37到38位残基之间插入，及可在环1内进行1到20个氨基酸残基的插入(如图lb和2确定)，例如在Sac7d的7到12位残基区域、优选在9到10位残基之间插入。为了避免任何不确定，本文确定图la和2中确定的环3、4和1分别相当于由ArcusCswpra)在综述中确定的环1、2和4。依据本发明一个特定实施方案，组合文库相当于Sac7d选自K7，Y8，K9，K21，K22,W24，V26,K28,M29,S31，T33，K39，T40,R42,A44，S46，E47和K48之中的11，12，13,14，15,16,17或18个残基、例如选自K7，Y8，K9,K21，K22，W24，V26,K28,M29,S31，T33，K39，T40，R42，A44和S46的11，12,13,14，15或16个残基的随机化。在以上实施方案的一个优选组合文库中，随机化的残基包含至少Sac7d的残基K7,Y8，K9，W24,V26,M29，S31，T33,R42,A44和S46。这个实施方案中以及以下实验部分称为"文库ll"的特异文库相当于Sac7d的残基K7，Y8，K9，W24,V26，M29，S31，T33,R42,A44和S46的随机化。在这个实施方案的其他组合文库中，选自K21、K22和T40的Sac7d的1个、2个或3个额外的残基也是随机化的。也在实验部分描述的本发明的2个其他优选文库是"文库13"和"文库14"，文库13相当于Sac7d的K7，Y8，K9,K21，K22，W24,V26,M29,S31，T33，R42,A44和S46残基的随机化，文库14相当于Sac7d的K7,Y8,K9，K21，K22，W24,V26,M29，S31，T33,T40,R42，A44和S46残基的随机化。当然，经随机化Sso7d的11，12,13,14，15或16残基获得的组合文库也是本发明的一部分，所述残基选自位于与如上所列位置等价位置上的残基。使用RSCB蛋白质数据库(Bermanetal.,2000)中的Sso7d(链A)的文件(lbf4A)并与Sac7d比较3D结构(图3a)可确定所述等价位置Sac7d:78921222426282931333940424446lbf4A:78921222426282931334041434547也可使用Sac7d的其他蛋白质同系物获得上述组合文库。在下表中揭示了这种蛋白质的实例。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>列于表1中的Sac7d同系物的OB-fold结构域的排列对比示于图4。使用志贺样毒素IIe(PDBlr4pB)获得本发明的其他特定组合文库，例如通过随机化ll，12,13,14，15或16个残基，所述残基选自位于与Sac7d的上述位置等价位置的残基，所述等价位置如下(图3b):Sac7d:78921222426282931333940424446lr4pB:605958910121417182022XX272931通过随机化人嗜中性粒细胞活化肽-2(NAP-2，PDBltvxA)的11，12,13,14,15或16个残基获得本发明的其他特定组合文库的其他实例，其中所述残基选自位于与Sac7d的上述位置等价位置的残基。经比较所述蛋白质与Sac7d(图3c)的3D结构获得的这些等价位置如下Sac7d:78921222426282931333940424446ltvxA:25262740414345545557596163656769使用棕色固氮菌的钼结合蛋白质(modg)(PDBlh9j)仍可获得本发明的其他特定组合文库，例如随机化选自位于与Sac7d的上述位置等价位置上的残基的11，12，13,14,15或16个残基，其中所述等价位置(图3d)如下Sac7d:78921222426282931333940424446lh9jA:6061628687899193949698105106108110112本发明也涉及上述组合文库用于工程化特异性结合靶的分子的应用。在本发明中，如果分子与靶的结合的信号与噪音比率高于10，则被认为是耙的"特异"结合物。使用本发明组合文库工程化的结合物分子优选以高亲和力结合其靶(也称为"感兴趣的靶")，即例如当靶是肽或蛋白质时，亲和力超过10nM，且当靶是碳水化合物分子时，亲和力超过lpM。本发明的另一个目的是工程化特异性结合靶的分子的方法，包括在如上述的组合文库中选择特异性结合所述靶的所述OB-fold蛋白质的变体的步骤。在此"变体"是指属于文库的蛋白质，即来源于起始OB-fold蛋白质通过在其结合位点突变而衍生的蛋白质。正如上述所提及，本发明的兴趣之一是其能够工程化特异性结合感兴趣的靶的分子，且关于这个靶无实质性限制。例如，感兴趣的靶可以是肽，蛋白质，寡糖，脂质，脂肽，碳水化合物(例如糖)，单链DNA，双链DNA，RNA。有趣地是，感兴趣的耙可以是限于一些原子或甚至仅仅一个原子的天然或合成的小分子。这种小分子实例包括任何类型的半抗原(即仅当与大载体附着时可引发免疫应答的小分子)，维生素，或金属离子。可被用作靶的分子的广泛多样性是特别有趣的，因为结合这些靶的OB-fold蛋白质可被用于抗体己知的相同应用，或不同应用。例如，本发明获得的并与金属离子结合的OB-fold蛋白质可被用于生物除污过程，例如从复杂材料如土壤或被污染的水中去除重金属。技术人员可使用本领域任何技术进行本发明方法的选择步骤和/或进行筛选步骤以获得有所需特性的蛋白质。选择技术可以是例如噬菌体展示(Smith,1985)，mRNA展示(Wilsonetal.，2001)，细菌展示(Georgiouetal.，1997)，酵母展示(BoderandWittrup,1997)或核糖体展示(HanesandPluckthun,1997)。为进行选择步骤，核糖体展示是特别有利的，因为其完全在体外进行并因此绕开许多体内系统的局限性(特别是关于文库大小)(HeandTaussig,2002;Schaffitzeletal.,1999)。在以下实验部分同时在He和Taussig(2002)以及Schaffitzel的(1999)的文章中或在其他文章和手册中技术员将发现进行核糖体展示的方案。在本发明方法的一个优选实施方案中，通过核糖体展示进行2，3,4或5轮选择。如实验部分所描述，本发明方法也可包括进一步的分离步骤和鉴定一个或几个特异性结合感兴趣靶的分子的步骤。例如，如下进行分离和鉴定步骤(i)用核糖体展示选择的池中的mRNA被逆转录并经PCR扩增，并且将所得的DNA克隆进入表达载体；(ii)细菌(例如感受态DH5oc)被所述表达载体(包含所述DNA)转化并且生长单克隆；和(iii)检测从所述细菌克隆提取的蛋白质与靶的结合和/或其他生物学特性(例如稳定性等)。然后，生长表达最好特性蛋白质的克隆以制备大量蛋白质。通过测序表达载体的相关部分确定工程化蛋白质的编码序列，并且编码这个蛋白质的基因也可被用于进一步工程化蛋白质。确实，使用通过本发明方法获得的结合物构建多功能蛋白质是有利的，该蛋白质具有至少一个靶向部分和另一个具有催化，荧光，酶促和任何其他活性的部分。例如这可以通过构建融合蛋白质实现，所述融合蛋白质包含作为第一部分的分离和鉴定的分子和至少第二部分。这第二部分可方便地选自酶，标记物或报道蛋白(如PhoA,GFP等)，治疗蛋白质等。依据本发明方法的一个变化，几个结合物连接到一起(或者在一个融合蛋白中或通过非共价连接)以构建具有多结合特异性的融合体或复合物。本发明的其他目的是经上述方法获得的蛋白质。特别地，特异性结合PulD并具有选自SEQIDNO:2-8的序列的蛋白质是本发明的一部分，SEQIDNO:47的GarA-结合物也是。随后的图例和实施例进一步阐述本发明。图1:a)图示野生型Sac7d与双链DNA(PDBcodelazp)复合。b)参与DNA结合的残基。凹面区域以浅灰色残基定义，平面区域用中等灰色和深灰色。结合区域间界限的残基是中等灰色。图2:多种OB-fold结构域的环1、3和4的图示。用于进行这个叠加的RSCBPBD结构文件如下_lazp(即Sac7d),ltvxA，ldokA,lbqq,lcsp,3seb，lbr9,2bosA,lbf4A和lquqB。为图像清晰，仅显示Sac7d结构。图3:图示和叠加Sac7d和a)Sso7d(结构文件lbf4);b)志贺样毒素lie(结构文件:2bosa);c)人嗜中性粒细胞活化肽-2(NAP-2,结构文件ltvxA);d)棕色固氮菌的钼结合蛋白质(modg)(结构文件lh9j)。注意对于包含不同于OB-fold结构域的额外结构域的蛋白质，仅OB-fold结构域在图中显示。使用DALI和DALILite服务器获得结构叠加。在下表2中显示蛋白质序列，它们的编号在NCBI文件中。名称文件ref.来源序列Sac7dlazpNCBI:AAA80315iEJOC(SEQIDNo:1)Sso7dlbf4NCBI:P39476JO:(SEQIDNo:28)毒素IIelr4pbNCBI:CAA90631MKKMFMAVLFALVSVNAMAADCAiCGKXBFSK(SEQIDNo:29)NAP-2ltvxANCBI:CAG33086MSIiRLjDTTPSCNSARPUiALQVKLIjIjSIiljLTALASSTKGQTKRNLAKGKEESLiDSDIjYAEIJESAD(SEQIDNo:30)modglh9jNCBI:CAA，38MKISARNVFKGTVSALKEGAVNAEVDILLGGGDKLAAWTLESARSLQLAAGKEWAVVKAPASASAVTXASNVXI/GVPA(SEQIDNo:31)表2:已被用于获得图3显示的叠加的蛋白质序列。斜1本的序列片段相当于结构文件中有效使用的序列以确定可方便地被随机突变的位置。所述突变位置是粗体。图4:几个Sac7d同系物的OB-fold结构域排列。图5:编码Sac7d的突变序列的基因合成。文库11的随机化的位置以黑色标记。文库14的额外的随机化的位置以灰色标记。使用的寡核苷酸由细箭头指示(它们的序列见文章)。大箭头指示Sac7d编码序列(无C-terTolA接头)。图6:a)文库11经4轮筛选后，检测抗DnaK，PulD-N和GarA的RIA(放射性免疫测定)。当甲硫氨酸35S存在时体外翻译选择池并检测与固定于ELISA板的DnaK，PulD-N或GarA的结合。冲洗并使用0.1M三乙醇胺洗脱之后，使用(3计数器评估结合物的量。使用浓度为lpM和10pM的游离蛋白质预保温翻译池平行进行竞争。b)第4轮后筛选抗-PlulD-N结合物。c)ELISA检测6个抗PulD-N结合物的结合特异性。比较结合物和固化的DnaK,PulD-N，GarA和BSA之间的相互作用。图7:文库ll、13和14经5轮筛选之后检测抗PulD-N的RIA。当甲硫氨酸35S存在时体外翻译选择池并检测与固定于ELISA板的DnaK,PulD-N，GarA或BSA结合。冲洗并使用0.1M三乙醇胺洗脱之后，使用(3计数器评估结合物的量。使用浓度为lnM，10nM,100nM，1000nM的游离PuiD-N预保温翻译池平行进行竞争。使用BSA作为结合池的阴性对照(无竞争完成)。图8:8个选择的抗PulD-N的结合物的序列。野生型Sac7d的序列示于图顶端。野生型Sac7d和结合物共同的残基由点标记。计划取代的位置为高亮的灰色。图9:表达和纯化分析8个选择的结合物。蛋白质上样于15%SDS-PAGE并用考马氏亮蓝染色。a)30°C表达后大肠杆菌粗提物。使用0.5mMIPTG诱导19小时后收集细胞并在上样缓冲液中裂解。b)粗提物的可溶性级分之后纯化结合物。c)一步IMAC(固定化金属离子亲和层析)纯化大肠杆菌粗提物可溶性级分之后纯化的结合物。所有上样的样品相当于13^1液体培养物。图10:使用SPR(表面等离子体共振)分析确定克隆6的亲和力。a)使用BIAcore之后的结合动力学。生物素化PulD-N被固定于(250RU)链霉抗生物素芯片上并注入50nM，25nM，12.5nM，6.25nM，3.13nM和1.56nM的克隆6。无固化PulD-N的流动池(cell)被用于控制非特异性结合的出现并将来自池的信号减去以获得检测池的信号。采用整体适宜程序使用BIAevaluation软件分析数据。b)使用竞争BIAcore也检测平衡时的亲和力。两种方法测定的参数在表3中报道。Ul^经差示扫描量热法确定Sac7d的野生型和变体重组蛋白的热稳定性。在rC/min，蛋白质浓度200ng/ml于含有300mMNaCl的50mMMES缓冲液pH5.6中报道野生型Sac7d，克隆40，克隆33和克隆6的过剩热吸收。对于每一个蛋白质样品，实验的额外热容量曲线(粗线)经非线性回归最佳拟合为非双态模型(细线)。在表4中给出生成的热力学参数。图12:a)使用克隆6-碱性磷酸酶融合物，用大肠杆菌粗提取物混合的PulD-N的检测的Western印迹。b)使用固定于柱上的克隆6—步纯化PulD-N。含PulD-N的大肠杆菌提取物的可溶性级分注入用HBS缓冲液pH7.0平衡的柱上。洗涤后，使用甘氨酸-盐酸缓冲液将pH降到2.5。级分在15。/。SDS-PAGE上分析并用考马氏亮蓝染色。CE:细胞提取物；PulD-N:纯化蛋白质作为标记物；级分酸性pH变化后从柱子洗脱的级分；FT:流经。图13:Sac7*40,Sac7*33和Sac7*6与分离的细胞包膜和PulD十二聚体(PulDD)和PulD单体(PulDM)的结合。(A)生成PulD和PulS或PulD-CS和PulS的PAP105菌株的递增量的细胞包膜与Sac7*40-GFP保温，然后使用SDS和GFP抗体免疫印迹分析膜级分。(B)使用3个Sac7*-PhoA嵌合体和抗PhoA抗体，同一菌株指示量的细胞包膜蛋白质的Far-Western印迹。图14:未经或经过IPTG诱导的Sac7-PhoA嵌合体的制备和它们对于带有pCHAP231的细胞包膜蛋白酶缺陷株PAP5198的分泌和PulD多聚化的作用。(A)(采用PhoA抗体)免疫印迹测定相同量细胞提取物的Sac7-PhoA水平。(B)使用PulD抗体，对苯酚处理和未处理的细胞提取物免疫印迹检测的分泌水平(°/。)和PulD十二聚体(PulDD)和单体(PulDM)的存在。箭头指示无苯酚处理检测的PulDM。S表示Sac7d-PhoA。(C)和(B)—样，但是无IPTG诱导。图15显示:对得自ARNms的ADNc进行的PCR，在第4个循环中洗脱(见图19，RT-PCR阶段)。图16:5个抗PKnG和抗溶菌酶选择循环之后进行竞争性放射性免疫图17:5个选择循环之后获得的抗溶菌酶(A)，抗PknG(B)和抗GarA(C)克隆的ELISA筛选。图18:5个选择循环之后获得的抗溶菌酶克隆序列。图19:GarA结合物和Sac7d的排列对比。图20:抗Fc片段的第4轮选择之后的竞争性ELISA。Mli^图示一轮核糖体展示选择。实施例采用下述材料和方法获得以下实验数据。材料和方法普通分子生物学选择的突变体的克隆和表达载体是pQE30，购自Qiagen(Germany)。编码野生型Sac7d的DNA的合成使用以下6个寡核苷酸采用装配PCR产生野生型Sac7d的DNA序列SCI(SEQIDNo:9:GAAACTCCTAGGTATTGTGCTGACGACCCCGATCGCGATCTCTAGCTTTGCGGTGAAAGTGAAATT),SC2(SEQIDNo:10:GATCTTGCTGGTGTCCACTTCTTTTTCTTCGCCTTTATATTTAAATTTCACTTTCACCGCAAAGCTAG)，SC3(SEQIDNo:11:GAAGTGGACACCAGCAAGATCAAGAAAGTTTGGCGTGTGGGCAAAATGGTGAGCTTTACCTACGACGACAACGGCAAG)，SC4(SEQIDNo:12:CTCTTTCGGGGCATSC5(SEQIDNo:13:GAGAAAGATGCCCCGAAAGAGTTATTAGATATGTTAGCGCGTGCGGAAAGCTTCAACCA)，SC6(SEQIDNo:14:TGGTGGTTGAAGCTTTCCGCACG)。纯化的PCR产物作为第二次PCR扩增的模板并使用以下两个引物SC07(SEQIDNo:15:ATTAATGGTACCGGATCCGTGAAAGTGAAATTTAAATATAAAG)和SC08(SEQIDNo:16:ATAABamHI和Hindlll限制性位点将PCR产物克隆入pQe30表达载体。带有所需序列的克隆被用于随后表达。组合文库的制备与以与核糖体展示相容的形式制备3个文库11、13、14的方案是相同的。主要经基因合成和PCR装配步骤构建文库。用联合使用编码NNS三联体(其中N=A,C，T或G和S=C或G)的4个标准和3个简并寡核苷酸的一步PCR获得DNA产物，其包括核糖体展示必须的5'-侧翼区并获得Sac7d的随机化基因。对于文库14，使用以下寡核苷酸:T7C(SEQIDNo:17:ATACGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTC)，SDA—MRGS(SEQIDNo:18:AGACCACAACGGTTTCCCTCTAGAAACACCATCACGGATCCGTCAAGGTGAAATTC)，SClib2(SEQIDNo:20:GGATCCGTCAAGGTGAAATTC丽SNNS丽SGGCGAAGAAAAAGAAGTGGACACTAGTAAGATC),SClib3(SEQIDNo:21:CTTGCCGTTGTCGTCGTAS丽AAASNNCACS丽TTTGCCSNNACGS丽AACS丽S丽GATCTTACTAGTGTCCACTTC)，SClib4(SEQIDNo:22:TAATAACTCTTTCGGGGCATCTTTCTCSNNCACSNNGCCS丽GCCS丽CTTGCCGTTGTCGTCGTA)，SClib5(SEQIDNo:23:CCATATAAAGCTTTTTCTCGCGTTCCGCACGCGCTAACATATCTAATAACTCTTTCGGGGCATC)。位置相当于Sac7d中的残基21、22和40或残基40的编码野生型三联体而不是NNS三联体的引物被分别用于构建文库11和13。为了将展示在核糖体上的蛋白质能更接近潜在配体，蛋白质需要与接头融合。这个接头的序列相当于大肠杆菌蛋白质TolA的一部分，在质粒pRDV载体内编码(Binzetal.，2004a)，使用引物SClink(SEQIDNo:24:(SEGIDNo:25:CCGCACACCAGTAAGGTGTGCGGTTTCAGTTGCCGCTTTCTTTCT)(后者编码核糖体展示必须的3，-侧翼区)PCR扩增。最终使用tolAk和T7B(SEQIDNo:25:ATACGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGG)引物通过PCR装配将文库与tolA接头组装。最终装配的产物相当于Sac7d文库，后者带有如上所述的用于核糖体展示选择必须的所有5，-禾卩3'-区域(Hanesetal.，1998;Schaffitzeletal.,1999)。核糖体展示选择循环对于选择实验，使用生物素化靶蛋白质。通过将10pMDnaK、GarA或PulD-N溶液与超过20倍摩尔浓度的于PBS中的磺基琥珀酰亚胺基-6-(生物素氨基)-己酸酯(Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin,Pierce)冰上保温1小时进行生物素化。生物素化蛋白质使用Pierce的平衡于TBS中的蛋白质脱盐离心柱进行缓冲液交换。使用HABA化验(Sigma)确定生物素化的程度为每个蛋白质分子2到3个生物素分子。生物素化的靶蛋白质结合到固定于Maxisorp板(Nunc)内的neutmvidin上，并在4°C按有一些修改的(Binzetal.,2004b)描述经核糖体展示进行选择。简要地，每轮选择后，洗脱的mRNA逆转录为cDNA并使用引物SDA一MRGS和SClib5扩增。PCR产物在NuclespinExtractII柱(Macherey-Nagel)脱盐并用于与TolAlinkerDNA片段的PCR装配(见上)。这个生成的全长核糖体展示构建体具有新加入的5'-和3'-侧翼区以最小化在处理过程中由于mRNA末端降解而导致的克隆丢失。RT-PCR循环数是35个循环(第1轮)，30个循环(第2轮)，30个循环(第3轮)，25个循环(第4轮)。在第5轮，如上描述使用解离速率选择法增加选择压力(Jermutusetal.,2001)。为了这个选择，加入10nM生物素化PulD-N至第4轮池的停止的翻译物中。混合物在4°C平衡lh并加入非生物素化PulD-N至终浓度达到10pM(超过生物素化PulD-N1000倍过量)。4。C振荡保温2h后，与生物素化PulD-N结合的三元复合物(mRNA-核糖体-结合物)在4。C被3(^1链霉抗生物素包被的磁珠(Roche)捕获15min。洗珠并且分离mRNA用于第一次4轮循环。在第5轮这种选择时，RT-PCR循环数是35。经监测每轮RT-PCR产物的量检査选择进程。分析选择的池和分离的克隆4轮或5轮之后，如(Hanesetal.,1998)等描述使用Maxisorp板内直接包被的靶蛋白质和从lnM到10pM无靶蛋白质作为竞争物采用RIA(放射免疫分析)测试选择的池。使用BamHI和HindIII限制性位点将来自选择的池的RT-PCR产物克隆入pQE30载体并将产生的连接产物用于转化大肠杆菌DH5oc菌株。从培养皿挑选出克隆接种每孔含1.5mlLB培养基(100pg/ml氨苄青霉素，1%葡萄糖)的深孔板。250rpm摇动、37°C过夜培养，从这个主平板每孔内取出0.2ml接种另一个每孔含有1.3ml2YT培养基(100pg/ml氨苄青霉素)的深孔板。然后平板在37°C保温lh，250rpm摇动。加入0.5mMIPTG诱导表达并在30°C保温4h，摇动(250rpm)。离心(2250g)沉淀细胞并去除上清。每孔使用50plBugBuster(Novagen)提取蛋白质，250rpm摇动30min，然后加入250^1TBSpH7.4(20mMTris-HCl，150mMNaCl)。离心(2500g)沉淀细胞碎片。对于ELISA(酶联免疫吸附实验)筛选，使用lOOpl每种上清液检测与包被在Maxisorp板内的靶蛋白质的结合。使用只从结合物中检测RGS-(His)6-tag而不从靶蛋白质中检测(His)6-tag的RGSHis抗体HRP缀合物(Qiagen)和Roche的BM-Blue底物进行检测。所有保温步骤在TBSpH7.4，含0.1%Tween20的缓冲液中进行。阳性克隆用标准测序技术测序。采用SPR(表面等离子体共振)制备用于筛选的蛋白质基于结合物从PulD-N解离的时间进行筛选，在5ml规模培养中表达克隆(大肠杆菌DH5oc菌株)。500^1深孔内过夜预培养物(LB培养基，lOOpg/ml氨苄青霉素，1%葡萄糖，37。C)接种在深孔板中的4.5ml培养基(2YT，100pg/ml氨节青霉素，37°C)。当OD6(K)=1.0时加入0.5mMIPTG诱导表达并在30。C(250rpm)保温培养物19h。离心(2500g)收集细胞，在含有25mM咪唑，BugBuster和Benzonase(Novagen)的0.5mlTBSpH7.4中重悬细胞而在深孔中提取蛋白质。4。C振荡lh后，离心深孔板沉淀细胞碎片。上清液在含有lOOnlNi-FastFlowChelatingSepharose(GeneralElectric)的微离心柱上纯化，柱用含有20mM咪唑的TBSpH7.4平衡。使用上样缓冲液洗Resin4次并用400plTBSpH7.4和250mM咪唑洗脱纯化的蛋白质。蛋白质制备以及结合物和野生型Sac7d的纯化对于Biacore和微量热实验，结合物在1L规模的DH5a大肠杆菌菌株中表达并如下述纯化。使用50ml过夜预培养物(LB培养基，100^ig/ml氨苄青霉氣1%葡萄糖,37。C)接种1L培养基(2YT,100ng/ml氨苄青霉氣37°C)。当OD6oQ=1.0时加入0.5mMIPTG诱导表达并在30°C保温19h(250rpm)。离心收集细胞并在30ml含有25mM咪唑的TBSpH7.4中在30°C重悬细胞。使用AvestinEmulsiflex匀浆器裂解细胞并经离心去除细胞碎片。使用含有25mM咪唑的TBSpH7.4平衡的5mlHiTrap螯合柱纯化蛋白质。使用TBSpH7.4和250mM咪唑洗脱。经大小排阻层析在已用HBSpH7.0(20mMHEPES,150mMNaCl)平衡的Superdex7526/60凝胶过滤柱(GEHealthcare)上进一步纯化蛋白质。在SMART系统(GEHealthcare)中使用HBSpH7.0平衡的Superdex753.2/20柱分析凝胶过滤(60pl/min，50^1样品注入)。BPTI(6.5kDa)，核糖核酸酶A(14.6kDa)，胰凝乳蛋白酶原A(20.3kDa)，卵白蛋白(46.7kDa)和白蛋白(62.9kDa)用作凝胶过滤的标准分子量。表面等离子体共振在25°C使用BIAcore2000设备测量SPR。如用于核糖体展示选择制备生物素化PulD并固定在SA-chip的流动池上。用于动力学检测和抑制检测的固定的生物素化PulD-N的密度分别是200RU和800RU(饱和芯片)。NaCl，0.05%Tween20)。使用以运行缓冲液稀释到1/20的微IMAC纯化的蛋白质(见上)、之后注入以60pl/min流动速率进行动力学检测而根据解离速率进行结合物的筛选和分类。使用以lnM到50nM浓度范围注入的大小排阻层析纯化的蛋白质进行确定亲和力的动力学检测。在5nM结合物浓度和以浓度范围从0.2nM到20nM的不同浓度PulD-N作为竞争物以流速25^il/min按如上述(Ostermeieretal.，1995)完成抑制检测。确定结合相的传感器图的斜率并对PulD-N的浓度作图。使用BIAeval软件(BIAcore)完成数据评估。微量热实验如前所述使用MicroCalVP-DSC热量计进行差示扫描量热法(Hibleetal.,2005)。Sac7d重组野生型和变体的原液在50mMMES缓冲液中(pH5.6300mMNaCl)中4°C透析过夜。然后蛋白质样品在同样的缓冲液中稀释到200pg/ml，在真空中脱气10min，轻柔振荡，加入热量计池(0.5ml)。参考池加入同样的缓冲液。在恒定外部压力25psi下，样品原地保留以避免泡沫形成并达到130°C的蒸发作用，25°C平衡25min，以恒定加热速率1deg./min加热，并且使用16秒滤波器收集数据。由生产厂商提供的Origin7TM软件(Plotnikovetal.，1997)分析数据。从热容函数减去两个基线，缓冲液参照温度记录图和标准化至解折叠转换进程的浓度之后计算出的化学基线之后获得过剩热容函数(Cp，过剩)。每个蛋白质样品的解折叠转换的热力学参数是假定非双状态模型的过剩热容曲线的非线性3参数(7^，A//eal，A/7vH)回归的结果。碱性磷酸酶融合体的构建编码结合物的基因经PCR扩增，使用引物SCPhoAF(SEQIDNo:26:ATTAATGGTACCGGATCCGTGAAGGTGAAATTC)和SCPhoAR(SEQIDNo:27:ATAATTGAGCTCTAAGCTTTTTTTCACGCTCCGCAC)和Phusion聚合酶在5'-和3'-末端分别导入Kpnl和Sacl。PCR产物用Kpnl和Sacl消化并克隆进入pQUANTagen载体(Qbiogene)。因此碱性磷酸酶融合到结合物C末端。使用大肠杆菌DH5oc菌株和厂商说明书进行碱性磷酸酶活性克隆筛选和周质提取。简要地，在LB板上筛选碱性磷酸酶活性的阳性克隆(100pg/ml氨苄青霉素，4ng/ml5-溴-4-氯-3』引哚基-磷酸盐)。使用8ml过夜预培养物(LB培养基，100ng/ml氨苄青霉素，37。C)接种400ml培养基(2YT培养基，100pg/ml氨苄青霉素，lg磷酸氢二钾pH7.5，37°C)。当0D6。。大约0.7时加入0.5mMIPTG完成tac启动子的诱导并在30°C连续生长4h。离心沉淀细胞并重悬于40mlTSE缓冲液(30mMTris-HClpH8.0,蔗糖20%，0.5mMEDTA，0.1mg/ml溶菌酶)。4。C悬浮保温20min，温和搅动完成溶菌酶休克。4°C在20000g离心30min去除细胞碎片并且上清液经存于-20。C前用0.45pm膜过滤。使用碱性磷酸酶融合体的Western印迹离心不含任何表达载体的10ml大肠杆菌菌株DH5ot过夜培养物(LB培养基，37。C)沉淀细胞。细胞沉淀重悬在lmlTBS(1XBugBuster和1^1Benzonase)。室温裂解细胞30min并且悬液在20000g离心5min去除细胞碎片。然后上清液用于纯化PulD-N的连续稀释。用恒定体积的上清液和相当于0.4ng到400ng可变量的纯化PulD-N制备样品，5^1样品加载到SDS凝胶上。电泳后，蛋白质从SDS凝胶转到硝酸纤维素膜上(Hybond-Cextra,0.45pm,GeneralElectric)。使用于TBST(20mMTris-HCl，150mMNaCl，pH7.5，0.1%Tween20)的5%奶粉封闭。然后膜与用TBST奶稀释1到15倍的融合体的可溶性周质提取液保温lh，轻柔搅动。洗膜后，使用在反应缓冲液(100mMTris-HClpH9.5，lOOmMNaCl,5mMMgCl2)中稀释的沉淀底物NBT/BCIP(AP缀合物底物试剂盒,Biorad)完成检测。GFP(绿色荧光蛋白)融合体的构建和表达编码结合物的基因经BamHI和HindIII位点克隆入含有eGFP基因和编码柔性肽接头KLGSAGSAAGSGEF(SEQIDNo:32)的区域的pQE30衍生质粒(pFP3000)。这导致与在N末端的MRGS(His)6tag的N-ter-结合物-接头-eGFP-C-ter融合体。通过DNA测序检测各个克隆的序列。在与仅有结合物的同样条件下完成结合物-GFP融合体的表达和纯化(即用IMAC和大小排阻层析步骤)。膜级分的分离和与40-eGFP嵌合体的相互作用研究带有质粒pCHAP3671(pulD)禾卩pCHAP580(pulS)(Guilvoutetal.,1999)或质粒pCHAP3711(pulD-CS)(Guilvoutetal.，2006)和pCHAP580的大肠杆菌K-12菌株PAP105(Guilvoutetal.,1999)被用于膜囊泡的分离。培养物在含有适当抗生素(100^g/ml氨苄青霉素，25pg/ml氯霉素)的LB培养基(Miller，1992)中30°C强通风生长到对数生长期(0060():0.9-1.1)。细胞高压破碎并再溶于Tris50mMpH7.5，NaCl150mM达到终浓度450pg/ml之后离心(180000xg，30min)分离膜级分。不同数量的膜囊泡与70pmo1纯化的40-eGFP融合蛋白质室温保温lh。离心(80000xg，20min)后使用同样的缓冲液洗沉淀，再次离心并在相同体积中重悬。每个样品的蛋白质经SDS-PAGE分离并转移到硝酸纤维素膜上。使用GFP—抗采用免疫印迹方法进行40-eGFP融合蛋白质的检测。使用固化的克隆6结合物进行亲和层析使用0.2M碳酸盐缓冲液pH8.3(0.5MNaCl)透析17毫克IMAC纯化的克隆6并注入已预先使用6mllmMHCl冲洗的lmlHiTrapNHS-活化的HP柱(GeneralElectric)。室温固定30分钟。洗柱并用0.5M乙醇胺(0.5MNaCl,pH8.3)和0.1M醋酸盐(0.5MNaCl，pH8.3)室温去活化任何残留的活性基团30min后，柱用TBSpH8.0(20mMTris,500mMNaCl)平衡并准备用于纯化。使用用质粒pCHAP3702(Chamietal.，2005)转化的大肠杆菌菌株BL21(DE3)表达PulD-N蛋白质。50ml过夜预培养物(LB培养基，100|ig/ml氨苄青霉素，1%葡萄糖,37。C)用于接种1L培养基(2YT,100Mg/ml氨苄青霉素，37°C)。当OD600=1.0时添加l.OmMIPTG诱导表达并在30°C(250rpm)保温培养物4h。离心收集细胞并重悬于30mlTBSpH8.0。使用AvestinEmulsiflex匀浆器裂解细胞并经离心去除细胞碎片。1.5ml这种可溶级分以0.5ml/min流速注入NHS-克隆6固化柱。使用40ml运行缓冲液洗掉非特异性蛋白质，使用lOOmM甘氨酸缓冲液(pH2.5，250mMNaCl)洗脱具有酸性pH改变的PulD-N。将级分上样于SDS凝胶来检测洗脱的蛋白质的纯度。Far-Western印迹如前制备大肠杆菌PAP105+/-PulD(pCHAP3671;(Guilvoutetal.,1999))或PulD-CS(pCHAP3711;(Guilvoutetal.，2006))以及PulS(pCHAP580;(Daefleretal.，1997))的外膜。重悬膜并贮存于含有10%蔗糖和O.lmg/ml蛋白酶抑制剂Pefabloc(Interchim，Montl叫on,France)的50mMTris-HCl，pH7.5中，并进行SDS/PAGE和转移到硝酸纤维素片上，然后封闭并与菌株生产的Sac7-PhoA嵌合体的周质(渗透压休克)提取物保温。洗后，通过抗PhoA抗体，辣根过氧化物酶偶联的二抗和化学发光法检测结合的PhoA。分泌使用空载体或编码Sac7-PhoA嵌合体的质粒转化菌株PAP7232(Hardieetal.,1996)。转化株在含有0.4%麦芽糖(诱导产生支链淀粉酶和其分泌系统，包括PulD)和lmMIPTG的培养基中生长以诱导Sac7-PhoA产生。如(d'Enfertetal.，1989)所述检测分泌水平并表示为与裂解细胞内检测到的酶活性(100%)相比在整个细胞内检测的酶活性的量。使用PulD和PhoA抗体免疫印迹检测细胞提取物。为分析Sac7-PhoA嵌合体对于高水平制备PulD的作用，使用侧翼Pstl位点扩增zeocin抗性基因并插入到相应质粒的W"M基因中独特的Pstl位点。重组质粒和pCHAP231(d'Enfertetal.，1987)—起转化进入包膜蛋白酶缺陷菌株PAP5198(&g尺ompr，/^)。如上用或不用IPTG诱导来分析支链淀粉酶分泌和PulD(预先使用或不使用苯酚处理)水平。结果实施例1:第一代文库的设计(文库11)研究使用Sac7d作为支架以获得不同配体的结合物的可能性的首要关键一步是通过随机化可能的结合区域同时保持亲代Sac7d蛋白质的稳定性和可溶性来设计文库。Sac7d-DNA复合物的几个三维结构已知(Agbacketal.,1998;EdmondsonandShriver,2001;Gaoetal.,1998;McAfeeetal"1995;McCraryetal"1996;Robinsonetal"1998;Suetal"2000)(图la)。依据这些结构，Sac7d与DNA小沟的结合包括与DNA非常匹配(形状和电荷)的结合表面区域。这个结合区域由16个残基组成(K7，Y8，K9,K21，K22，W24，V26，K28，M29，S31,T33，K39,T40,R42，A44,S46)(图lb)。这个结合区域的目测显示它是扭曲的并包含2种几何形状一个轻缓的凹面(K7,Y8,K9，W24,V26,K28,M29,S31,T33，R42,A44，S46)和另一个基本上平的面(K21,K22,W24,T33，K39，T40,R42)。这两个面共用残基W24,T33和R42。大约Sac7d序列的四分之一参与DNA结合。虽然所有这些残基暴露于表面，25%的Sac7d序列的大量随机诱变对于获得的突变体的折叠和稳定性可能是引人注目的。第一步，本发明者决定从诱变计划中排除K28和K39，因为这两个残基不完全朝向结合面。排除他们的第二个原因是由于用于引物退火重叠部分的减少(见下)，将不能如下描述经一步PCR产生文库。我们也假定结合区域的凹面侧的几何学可与球状蛋白质的球形匹配良好，或至少其能容纳它们暴露环的结合。因此，取代策略集中在Sac7d的这个区域的ll个残基上(K7，Y8，K9,W24,V26,M29，S31，T33,R42，A44,S46)。编码Sac7d的基因非常短(大约200碱基对)。因此，经一步PCR可获得相当于随机取代所述11个残基的文库。使用三个简并寡核苷酸(NNS方案)和3个标准寡核苷酸的混合物完成这个实验。随机化位置的密码子经代表所有氨基酸的NNS三联体编码。对于这种诱变策略，理论的多样性是大约3.2x1016(3211)，其超出实验室实现的我们文库多样性的大约4个数量级。当然，依据用于产生核糖体展示构建的PCR装配产物的量，文库估计的上限大约是3.0"012变体。40个随机克隆测序确定观测的残基频率与所预测的类似(数据未显示)。无任何移码或缺失的正确克隆的百分率大约是50%。因此，"功能性"多样性被认为满意并且文库被用于选择。实施例2:使用文库11进行核糖体展示选择3个蛋白质被选作靶DnaK，GarA(都来自结核杆菌(Myco6acfen'wm^^wcm/o^)和PulD的N末端结构域(来自产酸克雷伯氏菌(尺/&15&/&Ox_yto0)。PulD是外膜蛋白质，其不能保持在无离子去垢剂的溶液中。因此使用可溶性单体片段。这个片段命名为PulD-N，相当于PulD的N末端区域。选择这些靶是因为特异性和avid结合物是研究DnaK,GarA和PulD的有用工具。此外这些蛋白质用于结构研究的结晶是困难的。如用抗体片段相同的方法将识别这些蛋白质的结合物用于共结晶实验(Ostermeieretal.，1995)。包被neutmvidin的ELISA板用于固定生物素化蛋白质并进行选择。4轮选择后，发现所有3个靶的特异性结合物的富集(图6a)。在所有情况中，依据RIA，超过50%的结合池被10pM游离靶所抑制。经ELISA进一步评估结合池以用PulD-N选择，使用BamHI和HindIII限制性位点将来自选择的池的RT-PCR产物克隆入pQE30载体(Qiagen)。产生的连接产物被用于转化大肠杆菌菌株DH5a。从培养皿随机挑选96个克隆并接种于每孔含有1.5mlLB培养基(10(^g/ml氨苄青霉素，1%葡萄糖)的深孔板中。37°C，250rpm过夜培养后，从这个主板的每孔取0.2ml接种另一每孔含有1.3ml2YT培养基(100pg/ml氨苄青霉素)的深孔板。然后板在37°C，250rpm保温lh。加入0.5mMIPTG诱导表达并在30°C，250rpm保温4h。离心(2250g)沉淀细胞并去除上清液。每孔使用5(^1BugBuster(Novagen)在250rpm摇动30min提取蛋白质，然后加入250WTBSpH7.4(20mMTris-HCl，150mMNaCl)。离心(2500g)沉淀细胞碎片。对于ELISA筛选，使用lOOpl每种上清液测试包被在Maxisorp板上的PulD-N或BSA的结合。使用只从结合物中检测RGS-(HiS)6-tag而不从靶蛋白质中检测(His)6-tag的RGSHis抗体HRP缀合物(Qiagen)和Roche的BM-Blue底物进行检测。所有保温步骤在TBSpH7.4含0.1%Tween20中进行。在OD340nm检测所有克隆的PulD-N和BSA结合。计算每个克隆的BSA结合值与PulD-N值的比率。第4轮大约92%的克隆观察到超过10的信噪比(图6b)。通过ELISA检测来自PulD-N选择(第4轮)的6个纯化克隆对DnaK,GarA，PulD-N和BSA的结合。如图6c所示，结合特异于PulD-N。来自第4轮的28个克隆测序显示序列的高多样性；确实未发现一条序列指示可使用更高选择压力。而且，在任意所有ll个随机位置(数据未显示)未发现野生型残基。IMAC(固定金属离子亲和性层析)纯化9个克隆后评估的平均表达产量大约是70mg/L培养物(30。C保温4h)。结合物可被浓縮至少达到45mg/ml。总之这些结果建议Sac7d的结合区域对取代是高度耐受的并且选择的变体保持满意的生物物理学特性。但是，RIA的更详细分析显示来自第4轮的池中与结合物的平均亲和力为大约100nM并且经温和(2h)或更强烈(17h)的解离速率选择进行第5轮不能增加抗PulD-N池的平均亲和力(图7)。这种低亲和力在应用上是局限的，所述应用需要低纳摩尔解离常数。因此，本发明人决定尝试其他方法以获得更高的亲和力。实施例3:第二代文库文库13和14)的设计提高亲和力的一个直观方法是延伸结合区域并因此增加结合物和其配体之间相互作用的潜在数量。相应于11个残基的随机化的潜在的结合区域具有890人2溶剂可及表面。Sac7d对于ll个取代非常耐受，因此决定随机化2个或3个额外位置K21和K22(文库13)或K21,K^2和T40(文库l4)，它们分别相当于1130A2和1200A2。另一个说明可以是凹的结合区域不适于结合蛋白质和因此使用一个更平坦的表面可提高最终的亲和力。这2个新文库(每个3.0X1012变体)采用与文库11同样方法构建。文库14的70个随机克隆的测序确定观察到的残基频率与预测的相似，表示S、L和R氨基酸残基略低，P、N、Q和H氨基酸残基略高(数据未显示)。无任何移码突变或缺失的正确克隆的百分率大约是65%。因此，"功能性"多样性被认为是满意的并且文库被用于选择。实施例4:使用文库13和14用PulD-N作为靶蛋白进行核糖体展示选择使用这些文库和PulD-N作为靶蛋白质完成4轮选择。文库11，13，14经温和解离速率选择2小时以富集池中具有更低解离速率的结合物而平行完成第5轮选择。第5轮后池的放射免疫分析指示2个新文库的特异性PulD-N结合物的富集。在固化的BSA或neutravidin上不能检测结合。而且RIA显示10nM游离PulD-N足以抑制大约50%与文库13的结合信号，lOOnMPulD-N可同样水平抑制与文库11的结合信号。文库14甚至更好，lnM竞争物足以实现大约20%结合信号的明显抑制。因此，用文库14的设计对于平均亲和力至少增加了一个数量级。实施例5:文库14的抗-PulD-N的特性5丄遂獰游结合欽游分析表达浙錄众因为可以在得自文库14的池中发现最有希望的亲和力(第5轮)，分析这个文库的结合物池。富集的池被克隆进入表达质粒pQE30，使用大肠杆菌菌株DH5cc制备蛋白质。使用固化的PulD-N或BSA和大肠杆菌粗提物经ELISA方法分析48个单个克隆。对于所有克隆，检测相对于背景的显著特异性结合。因此，测序所有结合物以进一步分析。对于文库11观察到甚至在5轮选择后仍保持结合物的大量多样性(图8)。但是，依据它们的同源性大多数的克隆可被分为6个家族(数据未显示)。另外，在2个实验中发现2个同样的克隆，所有其他克隆是唯一的，提示选择收敛性(convergences发现在随机位置的残基具有非常不同的特性，带有脂肪族和芳香族侧链以及电荷或疏水侧链。在一些位置可观察到对于一些特殊残基的明显优先。例如，可大约半数的克隆中位置R42被酪氨酸占据，可能反映了它对于结合PulD-N的重要性。在所有可控的突变中，观察到天然残基非严格的保守性，包括3个与文库11比较被靶向的新位置(K21,K22和T40)。最后，在40个测序的克隆中在560(40x14)个残基中仅保留7个天然残基。因此，这些观察提示所述14个位置耙向了所有耐受的随机取代。结合物在30°C过夜生长的大肠杆菌细胞质中大量积累并经仅一步IMAC从1升摇瓶培养物中纯化为均质，产量直至达到200mg(图9)。蛋白质采用15%丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶电泳跑到它们预期分子量的位置。在标准的TBS缓冲液中纯化的结合物可被浓縮达到60mg/ml，其在4°C数月无沉淀并保持可溶。大小排阻层析显示研究的克隆6,39，40和41结合物是单体。如Sac7d，在这个化验中所有结合物比预期的更大(确定为11.5kDa而不是计算的9.1kDa)，可能是由于一个9个残基N末端标签的存在而导致球形的偏差。5.2.尸"/D-iV辦激條浙力为了确定最高亲和力克隆，使用48个克隆进行微表达和IMAC纯化。然后采用固化于链霉抗生物素包被的芯片上生物素化PulD-N通过SPR筛选这些纯化的蛋白质。在所有结合物化验中，在仅包被链霉抗生物素的空白面上未观察到明显结合，支持结合对于PulD-N是特异性的观点。依据解离阶段的分析，选择具有最慢解离速率的5个克隆用于通过SPR确定单价蛋白质的详细亲和力确定。经凝胶过滤进一步纯化这5个克隆，6，33，39，40和41。在不同浓度进行动力学分析和使用整体动力学拟合(globalkineticfit)进行动力学分析。发现所有PulD-N结合物的解离常数在皮摩尔或低纳摩尔范围内(图10a和表3)。克隆6和33具有最高的亲和力(分别是KD=130pM和190pM)。在高离子强度条件下(300mMNaCl)，缔合动力学稍稍减少(1.3倍)，指示这些缔合不是静电辅助的(数据未显示)。由竞争SPR分析确定这5个结合物的Kd值(图10b和表3)(Niebaeta1.，1996)。对照实验显示当检测野生型Sac7d与固化的PulD-N的结合时未发生结合，指示观察到的选择克隆的结合特性是新导入的功能所导致而不是预先存在的Sac7d与PulD-N亲和力的结果。克隆kon〖M-V']KD[nM〗aKD[nM]b%活性c61.91072.510-30.130.14±0.0390-100331.71073.21030.190.17±0.0390-100391.71078.61030.521.1±0.290-100402.31071.41020.600.9±0.290-100412.01071.21020.611.1±0.190-100表3:由表面等离子共振确定的解离常数总结。a:动力学分析获得的kd值.b:srp竞争实验获得的kd值.°:来自srp竞争实验分析。这些结合物的序列分析揭示不同情况(图8)。克隆6和33中的随机化位置是不同的，尽管事实是它们各自的Ko值在同一范歐130-M0pM)。相反，与克隆41一样，克隆40具有11/14随机化的残基，并具有相似的Kd值(-lnM)。克隆39与克隆6分享10/14随机化的残基，但具有低于7倍的亲和力。有趣地，发现在克隆39的C末端被截短4个残基但保留了与PulD-N结合的能力。这并不意外，正如Sac7d的几个截短形式也是存在的(McAfeeetal.，1995)。5.丄尸w/Z)-7V翁合激游稳定丝Sac7d是一个超热稳定性蛋白质，其在pH7.、7^91。C时解折叠，在更低的pH(McCraryetal.,1996)时蛋白质的热稳定性降低。经差示扫描量热法比较克隆6，33以及40和野生型Sac7d的热稳定性。为了确保蛋白质在低于DSC(125。C)极限高温下蛋白质完全展开，所有扫描使用pH5.6。发现克隆在变性温度68°C和83°C之间(图11和表4)是热稳定的。克隆40非常稳定，其rm值低于野生型(89.7。C)仅5.8°C，其后是克隆33(Arm=-10.5°C)，最不稳定的是克隆6(A7^-22.0。C)。但是克隆6的7^仍高于蛋白质数据库中蛋白质平均rm值8。C(Freire，2001)。DSC扫描是协同解折叠(cooperativeunfolding)的特征，指示虽然具有高突变负载(直至14个残基被突变，即21%的Sac7d突变)，Sac7d变体能够采用与野生型一样的折叠结构。克隆40和33的量热焓(每摩尔热改变，A//eal，)分别低于野生型(42.5kcal.mol")仅5.8和4.8kcal.mol-l(表4)。而且对于克隆40和克隆33，yff，van，tHoff焓与量热焓的比值(每协同解折叠单位的热改变)接近，并与野生型Sac7d的^l接近。这个观察强烈指示克隆40和克隆33的解折叠相当于折叠蛋白质单体的解折叠(表4)。克隆6呈现比野生型更低的量热焓(低18.10kcal,mor1)和更高的/比值(表4)。这些观察可能涉及在蛋白质较不稳定的酸性pH时克隆6蛋白部分解折叠(在pH7克隆6的rm是8°C以上；数据未显示)。总之这些现象显示克隆6，33和40最大限度保留野生型蛋白质的有利的热稳定性。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表4:Sac7d的wt和变体的热解折叠参数a:rm是土0,rC;b:Ai/cai是±0.3kcal.mor1，A//vH是±0.5kcal.mol";c:^=A//vH/A//cai5乂尸"/D-iV翁合激游特，丝这些PulD-N结合物特异性如何，和他们可被用于生物技术应用的哪个特异性是关键的？为回答这些问题，结合物6，33和40融合到大肠杆菌碱性磷酸酶的N末端(PhoA)。使用编码PhoA信号肽的pQUANTagen载体在菌株DH5a内将嵌合体(Sac7、PhoA)生产为周质蛋白。然后经渗透压休克从周质提取嵌合体并且采用PulD-N-或BSA-包被的小孔经ELISA分析它们的功能性。采用对硝基苯磷酸盐显色底物和分光光度法定量结合的融合体(数据未显示)。所有三个嵌合体都观察到高于背景的信号(信号/背景比例>10)。这显示嵌合体是1)在周质内输出，2)仍能特异性识别PulD-N和3)催化活性。因此这些融合体可用作一步法ELISA检测试剂。为了评价是否这些融合体能够在复杂的蛋白质混合物中区别PulD-N蛋白，例如在大肠杆菌粗提物中，我们将它们作为免疫印迹检测试剂。在这个实验中，收集和裂解过夜培养的无质粒的DH5oc。在每个试管中加入等分的粗提物和数量递减的纯化的PulD-N。SDS-PAGE和转移到硝酸纤维素膜后，在沉淀显色底物(NBT/BCIP)以低至1.5-3ng(图12a)的量无交叉反应性存在时使用结合物-PhoA嵌合体检测PulD-N。这支持了ELISA观察到的融合体的双重功能性(图12a)。当更大量的内源性蛋白质存在时完成低量PulD-N的检测，证明结合物6，33和40能够在几千种蛋白质中区别PulD-N并因此是高特异性的。为了进一步评价特异性，在lmlNHS-琼脂糖活化柱上经胺偶联反应将结合物6共价固定。相当于40ml的产生PulD-N的培养物的大肠杆菌粗提物可溶性级分注入柱。在加载，冲洗和洗脱(酸性pH改变)步骤时收集级分。SDS-PAGE分析这些级分显示柱能够捕获存在于粗提物中的PulD-N并且以高特异性完成这个捕获，因为在染色的SDS-PAGE胶上仅有一条可见的相当于PulD-N的条带(图12b)。因此，再次确认结合物从几千种蛋白质中区别PulD-N的能力。实施例6:PulD-N结合物与十二聚体PulD的结合下一步，本发明人研究是否对于PulD-N具有最高亲和力的3个选择的Sac7d衍生物(结合物6，33和40)能够识别与整合进大肠杆菌外膜的全长PulD蛋白。全长PulD在膜内形成十二聚体(PulD-N是单体)(Chamietal.，2005)并且不能排除PulD多聚化影响每一个结合物识别的表位，因此阻止它们与天然PulD的结合。当递增量的含有PulD的大肠杆菌PAP105(pCHAP3671pCHAP580)膜与饱和量的GFP-标记结合物40或33混合时，离心后沉淀物中残留的结合物量相应增加(图13A)。GFP-标记结合物不与含有缺失N-结构域的PulD变体的PAP105(pCHAP3711pCHAP580)的膜一起沉积(Guilvoutetal.，2006)(图.13A)。因此，这些GFP-结合物嵌合体与膜的结合是PulD-N特异性的，并且尽管存在GFP标签，它们与天然十二聚体分泌素复合物结合。结合物6仅与含有PulD的膜微弱结合(数据未显示)。far-Western免疫印迹用于验证Sac7d衍生物与PulD十二聚体的结合。所有3个Sac7*-PhoA嵌合体与单体和十二聚体PulD特异性结合，但不与PulD-CS结合(图13B)。虽然这3个嵌合体与苯酚解离(单体；见(Hardieetal.，1996)的PulD均等结合(数据未显示)，对于十二聚体PulD它们始终呈现不同的表观亲和力，范围从高(结合物40)到低(结合物6)。实施例7:PulD-N结合物抑制支链淀粉酶分泌和防止PulD多聚化Sac7d或其衍生物位于PhoA信号肽和PhoA的催化部分之间的31Sac7*-PhoA嵌合体有效地输出到周质，如通过高PhoA活性和周质休克时释放所监测到的。编码Sac7、PhoA嵌合体的质粒转化进入大肠杆菌菌株PAP7232，其中/"/基因整合到染色体。IPTG诱导后所有3个嵌合体以相似量产生并被完全抑制支链淀粉酶分泌，但是输出的Sac7d-PhoA没有影响。而且，在制备任何Sac7、PhoA嵌合体的菌株中未检测到PulD十二聚体或单体(数据未显示)。为获得这些现象的更准确的信息并研究在制备嵌合体菌株中PulD的命运，在带有pCHAP231(以增加T2SS制备；见GuilvoutW"/.，2006)的包膜蛋白酶缺陷菌株PAP5198中制备它们。IPTG-诱导的Sac7*-PhoA生产水平抑制支链淀粉酶分泌>90%(图14A)。十二聚体PulD很不丰富，并且PulD单体比无嵌合体或带有Sac7d-PhoA的对照相应地更丰富(图14B箭头)，证明嵌合体防止PulD多聚化和经包膜蛋白酶导致PulD单体降解。用未诱导水平的Sac7*33-PhoA和Sac7*40-PhoA获得类似结果，但是当Sac7*6-PhoA以未诱导水平存在时，大量支链淀粉酶分泌(>50%)和PulD多聚化发生(图14C)。实施例8:与其他靶结合的Sac7d变体的筛选采用如上述同样技术使用最佳文库(文库14)获得特异于其他靶的结合物。通过集中于以下蛋白质的抗蛋白质核糖体展示进行选择PulDN1(26.8kDa)，NGF(13kDa),PknG(81.6kDa)，GarA(12kDa)和溶菌酶(14.3kDa)直至第5次循环。在第4次循环过程中，使用或不使用靶平行进行选择过程。图15显示4次选择循环之后，仅当靶存在时可获得PCR产物(泳道标记为"+")。这建议选择池富集对于每个检测的靶特异的克隆。为了进一步评估选择过程的成功，使用不同抑制浓度的靶蛋白质进行竞争性放射免疫分析(RIA)。这些RIA清晰显示明显富集抗PknG、抗溶菌酶和抗PulDNl选择，但是在NGF和GarA中未见富集，结果提示选择未足够收敛。图16显示对于抗PknG和抗溶菌酶变体的平均预期亲和力是1至U10nM。用于循环5的抗溶菌酶、抗PknG和抗GarA选择池依据ELISA方法经预备96孔微培养物和在30°CIPTG诱导克隆表达4h后使用细菌裂解上清液进行筛选。图17的结果清晰显示存在对于每个靶特异性的克隆。虽然不鼓励RIA检测GarA，使用ELISA方法仍可检测到显著比例的阳性克隆。分离和测序结合GarA的特定克隆。图19显示这个结合物序列REKDAPKELLDMLARAEREKKL，SEQIDNo:47)和Sac7d的排列对比。关于PknG，似乎明显比例的克隆结合BSA，其提示需要额外的选择循环以便于清除它们。进行抗PulDNl和抗NGF筛选。通过制备96孔微培养物采用Biacore对阳性抗溶菌酶克隆的检测最佳预期亲和力(长化合物解离时间(koff))进行选择和分类。然后测序选择的24个最佳克隆(图18)。优先序列如Lys—Bll克隆的序列是很明显的，因为其被显示了多次(尽管用相同氨基酸的不同密码子编码某些位置)。第4次循环的筛选揭示了更大的多样性(未示出)。在大肠杆菌中制备3个不同序列的克隆(Lys—B3，Lys一H4和Lys—H8)，经IMAC和流经分子筛大规模纯化。获得的制备水平大约分别是120，40和25mg/L培养物。获得和处理经Biacore确定的亲和力。现有(初步)数据指示亲和力数量级为15nM、3nM和25nM(分别是Lys—B3、Lys—H4禾口Lys—H8)。经微量热方法描述3个抗溶菌酶克隆(Lys一B3，Lys一H4和Lys—H8)特性以便于确定它们在溶液中的热稳定性和亲和力。其他选择获得的克隆也将被Biacore筛选和测序，并且经Biacore将更准确地确定某些克隆的亲和力。实施例9:结合人IgGFc片段的Sac7d变体的选择5U.&翁合激游透摔Bio-Rad使用磺基琥珀酰亚胺基-6-(生物素氨基)己酸酯(sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido)hexanoate)化学生物素化Bio画Rad提供的人IgGFc片段(MW:50kDa)。由HABA化验确定的生物素化程度大约是每个蛋白质分子2到3分子生物素。生物素化Fc结合Maxisorp板中(Nunc)固化的neutravidin或链霉抗生物素并经核糖体展示在4°C使用Sac7d衍生的文库进行选择(如上述)。进行4轮选择分离结合物。每轮交替使用33neutravidin和链霉抗生物素以避免非特异性结合物。9.2.选捧游^^泡游伊仿在一轮选择后，获得带有RGS-His6-tag的序列池(推测的结合物)。在体外使用大肠杆菌S30提取物翻译这个池并使用抗RGS-His6-tag-HRP缀合物检测其结合活性。检测选择池内针对被动固化Fc片段的结合活性，未观察到针对BSA，Neutmvidin和链霉抗生物素的结合信号(未显示)。这个结果提示结合物池可能是Fc片段特异性并且Neutravidin和链霉抗生物素对于结合活性可能无显著作用。也进行用这个翻译池的竞争ELISA以初步评估选择的结合物的平均亲和力。在这个实验中，翻译是与几个浓度的Fc片段预保温之后在Fc片段固化的ELISA板中保温。图20显示，20%和70%信号可分别被10nM和100nMFc抑制。这提示预期平均亲和力大约是几十nM。这个亲和力范围与观察到的PulD-N选择的相似。实施例10:技术自动化为了增加上述技术的潜力，核糖体展示选择方案(图21)转化为连续、同时和快速检测多种靶的自动化平台(仍使用文库14或任何其他文库，例如从不同于Sac7d的OB-fold蛋白质开始)。为此目的已完全装备TecanGemini150机器人。这个工作站包括几个加热/冷却/搅拌模块，MJ研究热循环仪用于带有电动盖的自动化工作站，进行反应设置、RNA和DNA清除和用整体微板阅读器检测核酸浓度的所有必须附件。目的是根本不需手工干涉进行一轮选择。仅在每轮选择之间需要手工干涉如在每轮循环末更换许多塑料物品。经核糖体展示(图21)进行的手动选择是反复的(需要5轮以富集结合物)、挑剔的(许多转录、翻译、PCR、RT-PCR步骤)和因此仅几个靶就很耗时和甚至一个试验者对于超过4个靶时难于管理。因此，使用机器人进行选择具有很大的实际优势。机器人工作站(对PulD靶)选择方案确认之后，有可能在1或2周的时间内针对直至48个靶选择结合物。讨论本发明人研究了百万年来OB-fold折叠适于与广泛多样配体结合的进化过程的潜在益处，所述配体包括金属离子，糖，核酸(RNA、单链和双链DNA)和蛋白质。它们能够显示OB-fold家族成员经体外进化确实能够从DNA识别转换为蛋白质识别。这导致成功产生给定靶的高亲和力、高特异性结合物。观察到OB-fold结构是极化的，意味着在所有OB-fold蛋白质中结合面总是相同的(Arcus，2002)，使得能够设计保留野生型蛋白质的有利的生物物理特性的Sac7d变体文库。在经常参与配体结合的环l、3和4长度内不同OB-fold蛋白质可呈现大量变化(图lb和2)。虽然目前使用的大多数支架基于与抗体相似的柔性环的随机化(Binzetal.，2005)，本发明人决定保持天然Sac7d蛋白质的最初环的长度。首先他们假定结合区域的稍凹陷部分将最佳适于用作耙的蛋白质的球形。但是如上所报道，这个区域的残基的随机化不能获得好于纳摩尔的结合物。这个潜在的结合面相当于大约890A2的溶剂可及表面并在抗体-蛋白质缔合的典型的范围内(777±135A2)(JonesandThornton,1996)。因此，这个表面足以提供足够的相互作用能量以获得具有高亲和力的单体结合物。然后检测具有3个以上取代的潜在结合区域的扩展。使用核糖体展示成功完成几个不同靶的结合物的选择。与富集需要5到6轮的用完全合成的天然scFv文库的选择不同(Hanesetal.，2000)，用Sac7d文库在第3轮后已经观察到显著富集。这可以解释为与抗体比较Sac7d更有效的折叠，它既不需要二硫键形成以达到其天然状态也不需要两个连接的结构域具有功能性的正确缔合(如scFv片段)。高比率富集与描述的DARPin支架(Binzetal.，2004a)相似。最终，针对PulD-N的选择结果证明文库含足够的功能多样性提供能够识别同样靶蛋白质的不同结合物。这确认了本发明Sac7d文库的设计。透鄉齢激游歸针对PulD-N选择的单体结合物的特性显示使用Sac7d文库可获得皮摩尔亲和力。这些亲和力是使用不需要亲和力成熟步骤的支架蛋白获得的最高亲和力(综述，见(Hosseetal.，2006)和其中的参考文献)。结合动力学也是显著的，缔合率大约是21(^M".s"，使得PulD-N结合物属于蛋白质-蛋白质相互作用的扩散限制缔合率上限范围(GabdoullineandWade,1997)。缔合率似乎不是静电辅助的。因此，无需构象改变，高缔合率可解释为结合物"预先形成的(preformed)"形状与靶几何学匹配。获得的高亲和力与非常高的特异性相关。本发明人已显示无论环境(context)(大肠杆菌粗提物或膜)和方法(免疫印迹或亲和层析)如何，所有检测的结合物能够在几千种其他蛋白质中区别靶。这个严格的特异性可能与防止对不同靶的微小适应性的支架刚性有关。而且在ELISA化验中所有几十种筛选的结合物显示均是靶特异性的，指示应用的选择压力足以去除粘性分子。变体重组蛋白的产量(达到200mg/l大肠杆菌培养物)比报道的Sac7d的(大约10-15mg/l)高很多。诱导野生型^^基因表达后数小时发生的裂解可解释这个不同。这个毒性可能是由于Sac7d结合到大肠杆菌染色体诱导的调控途径的干扰，因为Sac7d是一个通用DNA结合蛋白质。变体未见这个局限性，提示变体确实丢失了它们的DNA结合特性。比较3个变体与嗜热生物的几个其他蛋白质(Kahsaietal.，2005)的热力学稳定性以及结合物的热稳定性与野生型Sac7d的相近。克隆6，分析的最不稳定的克隆，仍保留在pH5.6时rm大约68°C、Tm低于pH7.0时的8°C的热稳定蛋白质。因此，看来尽管从克隆到克隆观察到可变的Tm值，上述整体文库设计组合应用极端生物来源的蛋白质导致生成具有所需识别特性的非常稳定的蛋白质。支縦微分鹏沐鹏合微谢鄉检测的所有3个Sac7*-PhoA嵌合体结合单体全长PulD。Sac7*40-PhoA和Sac7*33-Ph0A很好地结合十二聚体PulD，指示它们的表位保持着可接近性。相反，Sac7+6-PhoA仅微弱结合PulD十二聚体，但在体外对PulD匪N具有最高的亲和力，指示其表位部分掩蔽多聚化和不同于Sac7*40和Sac7*33识别的。ITC竞争实验指示Sac7*6和Sac7*40识别的表位是相同的或重叠的(数据未显示)。当与PhoA融合时，这两个结合物体内作用的不同提示它们的表位重叠。所有3个Sac7*-PhoA变体防止PulD多聚化和靶定的PulD单体被包膜蛋白酶降解，因此阻断支链淀粉酶分泌。早期证据指示N结构域不影响PulD多聚化(Guilvoutetal.,2006)。Sac7*-PhoA中的PhoA二聚化可产生空间位阻和随后的PulD单体错误定位。当生成的PulD水平增加和包膜蛋白酶失活时，制备Sac7*-Ph0A的菌株的分泌水平非常低(图14B)。低分泌可能是因为仅存在一些PulD十二聚体、通道闭塞或被结合的嵌合体掩蔽底物或另一个分泌组分(Possotetal.,2000)的必须相互作用位点(Shevchiketal.，1997)。减少Sac7*33或Sac7*40的水平(去除IPTG诱导)不能减少它们对于分泌或PulD多聚化的作用，但是在这样条件下Sac7g6-PhoA几乎没有作用(图14C)，即使它与其他嵌合体一样丰富时(图14A)。两个不同的情况可解释这个现象。首先，高度丰富的8^7*6-11(^几乎结合所有？1110单体并防止它们多聚化。但是，当Sac7+6-PhoA水平较低时，它不能与PulD单体-单体相互作用有效竞争，足够的多聚体装配允许有效的分泌。SaC7*6-PhoA对于十二聚体PulD明显更低的亲和力不足以防止分泌。第二，伴侣PulS与PulD单体的结合，它们正确耙定到外膜的一个先决条件(Guilvoutetal.，2006;Hardieetal.,1996)，防止Sac7*6-PhoA结合和允许正确多聚化。在这个情况下，产量依赖于哪个蛋白质首先结合PulD，PulS或Sac7*6-PhoA。两种情况支持事实即Sac7*6识别的表位强烈掩蔽PulD多聚化，提示它位于两个单体之间的界面。疆鹏激默鄉这些结合物保留了对抗体可选择支架所需的大部分非常有利的生物物理特性。它们的特性与先前建议的抗体的可选择物如affibodies(Nordetal.,1997)、纤连蛋白(Xuetal.,2002)或锚蛋白(Binzeta1.，2004a)比较。当然，它们在大肠杆菌(在细胞质或周质)中表达良好，稳定，可溶，能够高亲和力和高特异性识别蛋白质靶，它们可与不同报道蛋白质(PhoA和GFP)功能性融合。换言之，它们制备便宜，容易纯化和操作。这为大量生物技术应用大开方便之门。而且它们体积很小，比scFv或IgG分别小3倍或19倍，使它们在设计嵌合蛋白时成为理想的候选物，嵌合蛋白中需要结合模块同时维持合理37大小。连接几个不同特异性的结合物并因此构建具有多特异性的融合体也是可能的。小结合物如Sac7d的另一个优势是它们结合天然抗体或其片段空间上不可接近的隐藏的表位的潜在能力。需要注意的是结合物结合靶蛋白质的能力不限于高分子量靶。的确，除了那些关于PulD的，已获得的结果显示Sac7d发展的库允许分离特异性结合3个新靶的克隆，所述库覆盖大范围分子量(溶菌酶44.3kDa，GarA=17.3kDa，PknG=81.6kDa)。这些结合物在大肠杆菌内的表达是远远优于观察到的重组抗体片段的水平。由于缺少时间，没有基于长koff值(解离速率选择)选择获得的亲和力是nM数量级。这个选择步骤是必须的以便于获得亚纳摩尔亲和力，并已经完成。为说明PulD结合物的特异性如何，本发明人已证明它们可被用于开发检测试剂。例如，结合物与碱性磷酸酶的融合体可以完成一步法ELISA或Western印迹。另一个实例是使用GFP融合体体外检测，为体内细胞内定位铺平道路。也证明采用这些结合物可完成亲和层析和经一步纯化可将蛋白质纯化为均质。其他应用可以使用这些结合物，例如蛋白质芯片阵列、生物传感器或可开关的体内敲除。錄论使用OB-fold蛋白质获得能够高亲和力和非常好的特异性识别靶蛋白质的结合物的策略经上述结果已成功确认。出发点是Sac7d，一个普通DNA结合蛋白质。现在Sac7d和其衍生物能够识别2个结构上无关的配体家族DNA和蛋白质。因此，本发明人已体外再现OB-fold与给定靶的结合适应性，如自然界已经实现的那样。因此可以想象Sac7d也可适于其他已知OB-fold蛋白质配体例如单链DNA、RNA或糖。除了它们在功能性敲除实验中潜在的用途之外，这些结合物可被用于亲和层析，检测，体内定位实验等。的确，这些结合物有利的生物物理特性连同它们易于与不同报道蛋白质融合以及它们的小尺寸(分别比scFv和IgG小3和19倍)可促进这些应用。参考文献Agback,P"Baumann，H.，Knapp，S.，Ladenstein,R.,andHard,T.(1998).Architectureofnonspecificprotein-DNAinteractionsintheSso7d-DNAcomplex.NatStructBiol5，579-584.Arcus,V.(2002).OB-folddomains:asnapshotoftheevolutionofsequence,structureandfunction.CurrOpinStructBiol794-801.Be廳n，H.M.，Westbrook，J"Feng,Z.,Gilliland,G"Bhat,T.N.，Weissig，H.，Shindyalov,I,N.，andBourne,P.E.(2000).TheProteinDataBank.NucleicAcidsRes跟235-242.Binz，H.K.，Amstutz，P.,Kohl,A.,Stumpp，M.T.,Briand，C,,Forrer，R，Grutter,M.G.，andPluckthun,A.(2004a).High-affinitybindersselectedfromdesignedankyrinrepeatproteinlibraries.NatBiotechnol",575-582.Binz，H.K.，Amstutz，P"Kohl，A.,Stumpp，M.T.,Briand,C.,Forrer,P.,Grutter,M.G.，andPluckthun,A.(2004b).High-affinitybindersselectedfromdesignedankyrinrepeatproteinlibraries.NatBiotechnol22，575-582.Epub2004Apr2018.Binz,H.K.,Amstutz,P.,andPluckthun,A.(2005).Engineeringnovelbindingproteinsfromnonimmunoglobulindomains.NatBiotechnol23，1257-1268.Boder，E.T.,andWittrup,K.D.(1997).Yeastsurfacedisplayforscreeningcombinatorialpolypeptidelibraries.NatBiotechnol75，553-557.Chami，M.,Guilvout,I.，Gregorini,M.，Remigy,H.W"Muller，S，A.，Valerio,M.，Engel，A.，Pugsley，A.P"andBayan，N.(2005).StructuralinsightsintothesecretinPulDanditstrypsin-resistantcore.JBiolChem280,37732-37741.Daefl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治疗蛋白质和结合物。26.通过权利要求16-25任一项的方法获得的蛋白质，其特征在于其特异性结合PulD以及其序列筛选自SEQIDNos:2到8。27.通过权利要求16-25任一项的方法获得的蛋白质，其特征在于其特异性结合GarA以及其序列是SEQIDNo:47。全文摘要本发明涉及蛋白质工程领域，提供了获得特异性结合选自大量配体家族的靶的稳定分子的手段。特别地，本发明提供了通过用OB-fold蛋白质作为起始分子的组合突变/选择方法获得特异性结合感兴趣的靶的分子的方法。特别地，所述感兴趣的靶可以是用作起始分子的OB-fold蛋白质的天然靶的不同的化学性质形式。文档编号C07K14/195GK101652386SQ200780050902公开日2010年2月17日申请日期2007年12月4日优先权日2006年12月4日发明者F·佩科拉里,P·阿扎瑞申请人:巴斯德研究院;国立科学研究中心