一种长春瑞滨的分离提纯方法

专利名称：一种长春瑞滨的分离提纯方法
技术领域：
本发明属于化学制药及分离纯化方法，具体涉及一种长春瑞滨的分 离提纯方法。
背景技术：
长春瑞滨(vinorelbine,Naveibine， VRL )又名去甲长春(花)碱、异长春 (花)碱、去碳长春碱或去甲基脱水长春花碱等，1974年由法国学者Potier 首先合成。目前可以长春花中提取的长春碱或者文多灵与长春质碱等为 原料，经过化学半合成获得。长春瑞滨抗癌活性高，抗瘤谱广，经国外 临床研究，单药或联合用药治疗非小细胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌、恶性 淋巴瘤等，已显示突出的疗效。
夏德生于2003年在公开号CN1552715、名称为"长春瑞滨合成中间 体脱水长春碱的制备方法"；包俊敏于2003年在公开号CN1552716、名 称为"合成长春瑞滨的方法"；以及Potier 1981在US4305875的"Process for synthesizing vinblastine and leurosidine" ; Magnus在1993 US5220016 的"Synthesis of navelbine analogs"提出合成制备长春瑞滨的方法，但这 些方法基本上都是反复多次过硅胶柱或氧化铝柱技术再结合重结晶，使 产品品质达到要求。反复多次过柱耗时、耗大量有机溶剂，引起环境污 染；同时因硅胶或氧化铝的吸附能力较强，目标产物易发生不可逆吸附， 因而收率较低；填装好的硅胶柱一般很难重复使用，反复填柱不仅增加 了工人的劳动强度，原材料成本也相应较高。

发明内容
本发明提供一种长春瑞滨的分离提纯方法，解决现有方法成本高、 分离效率低的问题，用于较大规模的精制长春瑞滨。 本发明的一种长春瑞滨的分离提纯方法，包括
(1) 硅胶干柱分离步骤；将化学半合成的长春瑞滨粗品湿法上样于 硅胶干柱上，长春瑞滨粗品与硅胶的质量比为1/80 1/300，在常压下利 用压力差以展开剂下行展开，获得长春瑞滨干柱色谱中度分离品；展开 剂为甲醇与正己垸的混合液或者甲醇与二氯甲烷的混合液；
(2) 反相层析精制步骤；对中度分离品以d8填料为固定相，以甲醇 与水的混合液为流动相，进行中低压反相层析；
(3) 结晶步骤；对反相层析的正组分减压蒸馏至干，加入浓度为 60% 80°/。的甲醇，冷冻结晶获得98.5%的精制长春瑞滨，达到医药原料 药要求。
所述的分离提纯方法，其特征在于，所述硅胶干柱分离步骤中-所述硅胶干柱为填装有硅胶基填料、高径比5:1 20:1的装置，硅胶 基填料由硅胶和硅藻土组成，硅藻土与硅胶的质量百分比为10% 20%; 硅胶粒径为30um 80um，硅胶活性为n III级；
所述硅胶干柱的填装过程为将硅胶基填料与等体积的有机溶剂混 合成为悬浊液，倒入塞有玻璃棉和两通活塞的空心PVC柱，硅胶基填料 不断沉积，溶剂经过玻璃棉流出，控制溶剂的流出速度，使硅胶基填料 表面始终被溶剂覆盖，直到填装到所需要高度；所述有机溶剂为正己烷、 石油醚、正戊烷中的一种。
所述的分离提纯方法，其特征在于，所述硅胶干柱分离步骤中
所述展开剂的体积比为甲醇正己垸=90: 10 98:2，或者甲醇二氯甲烷=80:20~95:5;
所述下行展开的过程为将展开剂从硅胶干柱顶加入，在常压下利 用压力差下行展开，当展开剂流至硅胶干柱底部时，停止加入展开剂； 将富含长春瑞滨的硅胶干柱段切割刮出，用100%三氯甲垸于摇床上振荡 洗脱10 20分钟，重复洗脱2 3次，将所获的三氯甲烷溶液于30。C 50 。C减压蒸干，回收溶剂，残渣即为中度分离品，.所述富含长春瑞滨的硅 胶干柱段是参照相同展开剂条件下硅胶薄层实验得到的长春瑞滨的比移 值R燕定。
所述的分离提纯方法，其特征在于，所述反相层析精制步骤中
固定相为<:18填料，粒径为20 50um，填装成高径比为20: 1 60: 1 的层析柱；
所述流动相中甲醇与水的体积比为60:40 90: 10; 所述中低压反相层析过程为将所述中度分离品从层析柱顶加入，
中度分离品中所含长春瑞滨的质量与C^填料的质量比为0.01 0.02: 1;
层析柱压力为5 40bar;所述流动相流速为2 10ml/min，用分部收集器 收集液，硅胶薄层检测洗脱流分，将富含长春瑞滨的流分合并成为反相 层析的正组分。
所述的分离提纯方法，其特征在于，所述结晶步骤过程为 对反相层析的正组分，于3(TC 5(TC减压蒸馏至干，再加入浓度为
60% 80%的甲醇，40。C 60。C下充分溶解，趁热过滤，将滤液放置到O
。C 6。C冷冻结晶，晶体即为98.5%的精制长舂瑞滨。
目前反相C^填料在分离天然药物单体成分中占重要作用，该类填料 能将多个结构相似的长春花类生物碱得以很好的分离。但由于高效能、商品化的该类填料价格较贵，还需要消耗大量色谱纯的有机溶剂作为流 动相，因而运行成本较高。如果直接使用反应后的粗提物，易造成填料 变性、失效。所以在利用反相ds填料精制长春瑞滨之前，对合成的瑞滨 粗品有必要先进行初分离。干柱硅胶色谱能够较好的初步分离长春瑞滨 粗产品，而且分离速度快，节省溶剂，操作简便。
本发明首先用正相干柱柱色谱将合成的瑞滨粗品快速纯化，将长舂 瑞滨与绝大部分反应中间产物、长春碱衍生物、以及极性杂质分离，获
得初步纯化的长春瑞滨，纯度可达到70%以上；然后用反相ds柱色谱进
一步纯化，除去难以分离的瑞滨结构类似物，获得较高纯度的长春瑞滨，
两步柱分离的总回收率达75%以上；最后经过一步结晶，可使长春瑞滨的 纯度达到98.5%、单一杂质小于0.1%，其品质达到医药原料药要求。
本发明适合工业化生产，先用干柱柱色谱对长春瑞滨粗品进行初步 分离，可以大大减少粗品引起的精制填料ds变性、失效，降低精分填料 成本。所用干柱填料为市售的层析硅胶，硅胶为无机物，无污染无毒， 用后可再生反复利用。干柱柱色谱所用的柱装置为自制的两通活塞的空 心PVC柱，此种柱装置较好的解决了干柱展层结束之后硅胶取出困难的 问题，操作简单。干柱层析能将长春瑞滨与绝大部分反应中间产物、长 春碱衍生物、以及极性杂质分离，并且操作流程快速简便，省时省工， 节约洗脱溶剂。
所用反相C,8柱色谱能有效除去难以分离的长春瑞滨结构类似物，所
用(318填料，对分离物质无强保留，分离效率高，可方便的反复利用，对 产品亦无毒无污染。所涉及溶剂皆为市售分析纯，工业上都可以回收再 利用。
本发明操作简便、溶剂用量省、生产成本低、分离效率高、回收率 高，制得的长春瑞滨纯度在98.5%以上，分离总回收率达60%以上，适合 于较大规模的工业化生产。
具体实施方式
实施例l
(1) 取40g 、粒径50pm的III级活化硅胶，并添加4g的硅藻土 (硅 藻土与硅胶的质量百分比为10%)，加入等体积的正己垸搅拌混合成为悬 浊液，倒入塞有玻璃棉和两通活塞、直径为2.6 cm的享心PVC柱，硅胶基 填料不断沉积，溶剂经过玻璃棉流出，控制溶剂的流出速度，使硅胶基 填料表面始终被溶剂覆盖，直到填料全部转入PVC柱，柱高13cm (柱高 径比为5: 1 );取0.5g合成得到的长春瑞滨粗品(长春瑞滨纯度25%， HPLC 检测)，长春瑞滨粗品与硅胶的质量比为1/80，用0.5mL甲醇溶解上样， 在常压条件下，采用甲醇正己垸二90:10 (V/V)溶剂作为展开剂，下 行展开，直到溶剂展至柱底，停止展层；参照薄层实验得到的长春瑞滨 的Rff直，将富含长春瑞滨的硅胶干柱段刮出，然后100%三氯甲烷浸泡振 荡洗脱2次，每次20分钟，将所获的三氯甲烷溶液于30。C减压蒸干，得 到中度分离的长春瑞滨147mg (长春瑞滨纯度72%， HPLC检测)。
(2) 取粒径50um的反相d8填料10.58g，甲醇充分浸泡，脱气后， 湿法装到直径为0.55 cm的耐压玻璃柱，柱高33cm，高径比为60: 1;将 步骤(1)得到的147mg中度分离产物用0.5mL甲醇与水组成的流动相溶 解后上柱，中度分离品中所含长春瑞滨的质量与ds填料的质量比为 0.01:1;以甲醇与水(90:10， V/V)的混合液作为流动相，5 bar柱压下洗 脱，流速约为2 mL/min，分部收集器分段收集流出液，用薄板层析跟踪 检测，合并富含长春瑞滨的正组分。
(3) 对步骤(2)的正组分4(TC减压蒸馏至干，得到101mg产物(长 春瑞滨纯度95%， HPLC检测)；将产物以1.5mL60。/。的甲醇在60。C热溶 解，4'C冰箱冷冻结晶，结晶后得到长春瑞滨97mg(长春瑞滨纯度98.50/0, HPLC检测)。实施例2
(1) 取80g 、粒径30ym的II级活化硅胶，并添加16g的硅藻土(硅 藻土与硅胶的质量百分比为20%)，加入等体积的石油醚搅拌混合成为悬 浊液，倒入塞有玻璃棉和两通活塞、直径为2.0cm的空心PVC柱，硅胶基 填料不断沉积，溶剂经过玻璃棉流出，控制溶剂的流出速度，使硅胶基 填料表面始终被溶剂覆盖，直到填料全部转入PVC柱，柱高40cm(柱高 径比为20: 1);取0.5g合成得到的长春瑞滨粗品(长春瑞滨纯度27%， HPLC检测)，长春瑞滨粗品与硅胶的质量比为1/160，用0.5 mL甲醇溶 解上样，在常压条件下，采用甲醇二氯甲烷=95:5 (V/V)溶剂作为展 开剂，下行展开，直到溶剂展至柱底，停止展层；参照薄层实验得到的 长春瑞滨的Rff直，将富含长春瑞滨的硅胶干柱段刮出，然后100%三氯甲 烷浸泡振荡洗脱3次，每次10分钟，将所获的三氯甲烷溶液于40。C减压 蒸干，得到中度分离的长春瑞滨143 mg(长春瑞滨纯度80。/c)， HPLC检测)。
(2) 取粒径20um的反相ds填料5.72 g，甲醇充分浸泡，脱气后， 湿法装到直径为0.75 cm的耐压玻璃柱，柱高15cm，高径比为20: 1;将 步骤(1)得到的143mg中度分离产物用0.5mL甲醇与水组成的流动相溶
解后上柱，中度分离品中所含长春瑞滨的质量与<:18填料的质量比为
0.02:1;以甲醇与水(60:40， V/V)的混合液作为流动相，10 bar柱压下 洗脱，流速约为4 mL/min，分部收集器分段收集流出液，用薄板层析跟 踪检测，合并富含长春瑞滨的正组分。
(3) 对步骤(2)的正组分50。C减压蒸馏至干，得到lllmg产物(长 春瑞滨纯度96%， HPLC检测)；将产物以2.0mL80。/。的甲醇在4(TC热溶 解，O'C冰箱冷冻结晶，结晶后得到长春瑞滨110mg(长春瑞滨纯度98.50/0， HPLC检测)。实施例3
(1) 取400g 、粒径80iim的ni级活化硅胶，并添加40g的硅藻土(硅 藻土与硅胶的质量百分比为10%)，加入等体积的石油醚搅拌混合成为悬 浊液，倒入塞有玻璃棉和两通活塞、直径为4.3 cm的空心PVC柱，硅胶基 填料不断沉积，溶剂经过玻璃棉流出，控制溶剂的流出速度，使硅胶基 填料表面始终被溶剂覆盖，直到填料全部转入PVC柱，柱高43 cm (柱高 径比为10: 1);取5.0g合成得到的长春瑞滨粗品(长春瑞滨纯度28%， HPLC检测)，长春瑞滨粗品与硅胶的质量比为1/80，用1.0mL甲醇溶解 上样，在常压条件下，采用甲醇正己烷二98:2 (V/V)溶剂作为展开剂， 下行展开，直到溶剂展至柱底，停止展层；参照薄层实验得到的长春瑞 滨的Rff直，将富含长春瑞滨的硅胶干柱段刮出，然后100%三氯甲烷浸泡 振荡洗脱3次，每次15分钟，将所获的三氯甲垸溶液于45。C减压蒸干， 得到中度分离的长春瑞滨1.59g (长春瑞滨纯度75%， HPLC检测)。
(2) 取粒径30um的反相ds填料79.5 g，甲醇充分浸泡，脱气后， 湿法装到直径为1.45 cm的耐压玻璃柱，柱高58cm，高径比为40: 1;将 步骤(1)得到的1.59 g中度分离产物用l.O mL甲醇与水组成的流动相溶 解后上柱，中度分离品中所含长春瑞滨的质量与ds填料的质量比为 0.015:1;以甲醇与水(80:20， V/V)的混合液作为流动相，40 bar柱压下 洗脱，流速约为10mL/min，分部收集器分段收集流出液，用薄板层析跟 踪检测，合并富含长春瑞滨的正组分。
(3) 对步骤(2)的正组分5(TC减压蒸馏至干，得到1.14g产物(长 春瑞滨纯度94%， HPLC检测)；将产物以5.0mL70Q/。的甲醇在60'C热溶 解，6"C冰箱冷冻结晶，结晶后得到长春瑞滨1.09g(长春瑞滨纯度98.3M， HPLC检测)。实施例4
(1) 取600 g 、粒径50 u m的m级活化硅胶，并添加90 g的硅藻土 (硅 藻土与硅胶的质量百分比为15%)，加入等体积的正戊烷搅拌混合成为悬 浊液，倒入塞有玻璃棉和两通活塞、直径为4.0cm的空心PVC柱，硅胶基 填料不断沉积，溶剂经过玻璃棉流出，控制溶剂的流出速度，使硅胶基 填料表面始终被溶剂覆盖，直到填料全部转入PVC柱，柱高80cm (柱高 径比为20: 1);取2.0 g合成得到的长春瑞滨粗品(长春瑞滨纯度30%， HPLC检测)，长春瑞滨粗品与硅胶的质量比为1/300，用1.0mL甲醇溶 解上样，在常压条件下，采用甲醇二氯甲烷二80:20 (V/V)溶剂作为 展开剂，下行展开，直到溶剂展至柱底，停止展层；参照薄层实验得到 的长春瑞滨的R箱，将富含长春瑞滨的硅胶干柱段刮出，然后100%三氯 甲烷浸泡振荡洗脱2次，每次20分钟，将所获的三氯甲烷溶液于30。C减 压蒸干，得到中度分离的长春瑞滨615mg (长春瑞滨纯度78%， HPLC检
(2) 取粒径50um的反相d8填料24.0 g，甲醇充分浸泡，脱气后， 湿法装到直径为0.85 cm的耐压玻璃柱，柱高51 cm，高径比为60: 1;将 步骤(1)得到的615mg中度分离产物用0.5mL甲醇与水组成的流动相溶
解后上柱，中度分离品中所含长春瑞滨的质量与Qs填料的质量比为
0.02:1;以甲醇与水(85:15， V/V)的混合液作为流动相，20 bar柱压下 洗脱，流速约为6 mL/min，分部收集器分段收集流出液，用薄板层析跟 踪检测，合并富含长春瑞滨的正组分。
(3) 对步骤(2)的正组分30。C减压蒸馏至干，得到455mg产物(长 春瑞滨纯度96%， HPLC检测)；将产物以2.0mL70G/。的甲醇在5(TC热溶 解，(TC冰箱冷冻结晶，结晶后得到长春瑞滨420 mg(长春瑞滨纯度98.6。/。， HPLC检测)。实施例5
(O取300g 、粒径80um的II级活化硅胶，并添加30g的硅藻土(硅 藻土与硅胶的质量百分比为10%)，加入等体积的正已烷搅拌混合成为悬 浊液，倒入塞有玻璃棉和两通活塞、直径为3.9cm的空心PVC柱，硅胶基 填料不断沉积，溶剂经过玻璃棉流出，控制溶剂的流出速度，使硅胶基 填料表面始终被溶剂覆盖，直到填料全部转入PVC柱，柱高39cm(柱高 径比为10: 1);取3.0 g合成得到的长春瑞滨粗品(长春瑞滨纯度30%， HPLC检测)(长春瑞滨粗品与硅胶的质量比为1/100)，用l.O mL甲醇 溶解上样，在常压条件下，采用甲醇二氯甲烷=80:20 (V/V)溶剂作 为展开剂，下行展开，直到溶剂展至柱底，停止展层；参照薄层实验得 到的长春瑞滨的Rf值，将富含长春瑞滨的硅胶干柱段刮出，然后100%三 氯甲烷浸泡振荡洗脱3次，每次10分钟，将所获的三氯甲烷溶液于50。C减 压蒸干，得到中度分离的长春瑞滨855 mg (长春瑞滨纯度72%， HPLC检
(2) 取粒径20um的反相d8填料61.56g，甲醇充分浸泡，脱气后， 湿法装到直径为1.3cm的耐压玻璃柱，柱高52cm，高径比为40: 1;将步 骤(1)得到的885mg中度分离产物用0.8mL甲醇与水组成的流动相溶解 后上柱，中度分离品中所含长春瑞滨的质量与C^填料的质量比为0.01:1; 以甲醇与水(70:30， V/V)的混合液作为流动相，40bar柱压下洗脱，流 速约为8 mL/min，分部收集器分段收集流出液，用薄板层析跟踪检测， 合并富含长春瑞滨的正组分。
(3) 对步骤(2)的正组分5(TC减压蒸馏至干，得到637mg产物(长 春瑞滨纯度95%， HPLC检测)；将产物以2.0mL80。/。的甲醇在4(TC热溶 解，4。C冰箱冷冻结晶，结晶后得到长春瑞滨584 mg(长春瑞滨纯度98.5。/c)， HPLC检测)。实施例6
(1) 同实施例5;
(2) 取粒径50lim的反相d8填料30.78g，甲醇充分浸泡，脱气后， 湿法装到直径为0.9cm的耐压玻璃柱，柱高54cm，高径比为60: 1;将步 骤(1)得到的885mg中度分离产物用0.8mL甲醇与水组成的流动相溶解 后上柱，中度分离品中所含长春瑞滨的质量与Q8填料的质量比为0.02:1; 以甲醇与水(70:30， V/V)的混合液作为流动相，30bar柱压下洗脱，流 速约为8 mL/min，分部收集器分段收集流出液，用薄板层析跟踪检测， 合并富含长春瑞滨的正组分。
(3) 对步骤(2)的正组分40。C减压蒸馏至干，得到617mg产物(长 春瑞滨纯度91%， HPLC检测)；将产物以3.0mL60。/。的甲醇在4(TC热溶 解，4。C冰箱冷冻结晶，结晶后得到长春瑞滨544 mg(长春瑞滨纯度98.0。/。， HPLC检测)。
权利要求
1. 一种长春瑞滨的分离提纯方法，包括(1)硅胶干柱分离步骤；将化学半合成的长春瑞滨粗品湿法上样于硅胶干柱上，长春瑞滨粗品与硅胶的质量比为1/80～1/300，在常压下利用压力差以展开剂下行展开，获得长春瑞滨干柱色谱中度分离品；展开剂为甲醇与正己烷的混合液或者甲醇与二氯甲烷的混合液；(2)反相层析精制步骤；对中度分离品以C18填料为固定相，以甲醇与水的混合液为流动相，进行中低压反相层析；(3)结晶步骤；对反相层析的正组分减压蒸馏至干，加入浓度为60％～80％的甲醇，冷冻结晶获得98.5％的精制长春瑞滨。
2. 如权利要求l所述的分离提纯方法，其特征在于，所述硅胶干柱 分离步骤中所述硅胶干柱为填装有硅胶基填料、高径比5:1 20:1的装置，硅胶 基填料由硅胶和硅藻土组成，硅藻土与硅胶的质量百分比为10% 20%; 硅胶粒径为30um 80um，硅胶活性为II III级；所述硅胶干柱的填装过程为将硅胶基填料与等体积的有机溶剂混合成为悬浊液，倒入塞有玻璃棉和两通活塞的空心PVC柱，硅胶基填料 不断沉积，溶剂经过玻璃棉流出，控制溶剂的流出速度，使硅胶基填料 表面始终被溶剂覆盖，直到填装到所需要高度；所述有机溶剂为正己烷、 石油醚、正戊垸中的一种。
3. 如权利要求l所述的分离提纯方法，其特征在于，所述硅胶干柱 分离步骤中所述展开剂的体积比为甲醇正己烷=90: 10 98:2，或者甲醇二氯甲烷=80: 20-95: 5;所述下行展开的过程为将展开剂从硅胶干柱顶加入，在常压下利 用压力差下行展开，当展开剂流至硅胶干柱底部时，停止加入展开剂； 将富含长春瑞滨的硅胶干柱段切割刮出，用100%三氯甲烷于摇床上振荡洗脱10 20分钟，重复洗脱2 3次，将所获的三氯甲垸溶液于3(TC 50 'C减压蒸干，回收溶剂，残渣即为中度分离品；所述富含长春瑞滨的硅 胶干柱段是参照相同展开剂条件下硅胶薄层实验得到的长春瑞滨的比移 值R満定。
4. 如权利要求l所述的分离提纯方法，其特征在于，所述反相层析 精制步骤中-固定相为Cw填料，粒径为20 50um，填装成高径比为20: 1 60: 1 的层析柱；所述流动相中甲醇与水的体积比为60:40 90: 10; 所述中低压反相层析过程为将所述中度分离品从层析柱顶加入，中度分离品中所含长春瑞滨的质量与C,8填料的质量比为0.01 0.02: 1;层析柱压力为5 40bar;所述流动相流速为2 10ml/min，用分部收集器 收集液，硅胶薄层检测洗脱流分，将富含长春瑞滨的流分合并成为反相 层析的正组分。
5. 如权利要求l所述的分离提纯方法，其特征在于，所述结晶步骤 过程为-对反相层析的正组分，于3(TC 5(TC减压蒸馏至干，再加入浓度为 60% 80%的甲醇，4(TC 6(TC下充分溶解，趁热过滤，将滤液放置到O 。C 6。C冷冻结晶，晶体即为98.5%的精制长春瑞滨。
全文摘要
一种长春瑞滨的分离提纯方法，属于化学制药及分离纯化方法，解决现有方法成本高、分离效率低的问题，用于较大规模的精制长春瑞滨。本发明包括(1)硅胶干柱分离步骤；将化学半合成的长春瑞滨粗品湿法上样于硅胶干柱上，在常压下利用压力差以展开剂下行展开，获得长春瑞滨干柱色谱中度分离品；(2)反相层析精制步骤；对中度分离品以C₁₈填料为固定相，以甲醇与水的混合液为流动相，进行中低压反相层析；(3)结晶步骤；对反相层析的正组分减压蒸馏，加入甲醇，冷冻结晶获得98.5％的精制长春瑞滨。本发明操作简便、溶剂用量省、生产成本低、分离效率高、回收率高，制得的长春瑞滨纯度在98.5％以上，分离总回收率达60％以上，适合于较大规模的工业化生产。
文档编号C07D519/00GK101284841SQ20081004778
公开日2008年10月15日 申请日期2008年5月19日 优先权日2008年5月19日
发明者余龙江, 吴泽强, 硕 李, 茵 熊, 赵春芳 申请人:华中科技大学