专利名称：：改良Cry3的方法、改良Cry3、质粒及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种增强苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质Cry3对玉米根虫(D/a6raf/cav/rp/erav/rg(/^a)的杀虫能力的方法，以及利用这种方法获得的改良Cry3、所用质粒，及其在制备转基因抗虫玉米中的应用。(二)
背景技术：
：玉米根虫是一种最具有破坏性的玉米害虫。在美国，3种重要种分别为西方玉米才艮虫(￡).v/rpy^rav/rgi/^a)、北方玉米才艮虫(D.wwfec/7w/wwctoto/cwar<i/)和南方玉米才艮虫(D.wm/ec/wpwwctoto/7cmwc//)。西方玉米才艮虫和北方玉米根虫是美国玉米栽培中的首要害虫。玉米根虫通过取食植物根部引起植物严重损伤。这种损伤表现在增加玉米倒伏，减少玉米产量和生物量而改变植物的营养含量。玉米根虫的取食还间接影响植物病原生物的侵入，幼虫对根的损伤，使植物病原细菌、真菌等微生物可以更容易侵入到植物中。玉米根虫成虫在夏末玉米田中非常活跃，它们取食叶耳，叶丝和花粉，干扰了玉米的正常授粉。苏云金芽孢杆菌(5ac/〃wsAwW"g/e"^)最早于1902年在日本国发现，1911年在德国再次被发现并得鉴定，是一种格兰氏阳性细菌。在它的孢子形成过程中，合成出大量的杀虫结晶包涵体(insecticidalcrystallineinclusions),其中的晶体蛋白质(crystallineprotein,Cry)是由叫啦文cr-内毒素(a-endotoxins)的原毒素亚基(protoxinsubunit)组成的。大多数的苏云金芽孢杆菌菌抹都会产生一系列的CT-内毒素，它对许多昆虫都具有特异的毒性，古文这种蛋白质又叫啦夂杀虫晶体蛋白(insecticidalcrystalprotein，ICP),或苏云会芽孢杆菌毒蛋白(Bttoxin)。此外，苏云金芽孢杆菌在生长及芽孢形成期间，还能分泌一些外毒素，叫做苏云金毒素或P-外毒素((3-exotoxin),同样也具有抑制幼虫生长的能力苏云金芽孢杆菌CSac/〃wsf/mn>7g/e"w、，价)5-内毒素Cry3有杀曱虫的活性。Cry3A蛋白对科罗拉多马铃薯曱虫(afecemZ/weato)有很好的杀虫活性，但对D/Wraaca属的曱虫没有杀虫活性(Johnsonetal.,1993,J.Econ.Entomol.86:330333)。根据Slaney等所述(1992，InsectBiochem.Molec.Biol.22:918),Cry3A蛋白对科罗拉多马铃薯曱虫的杀虫活性是南方玉米才艮虫(D.腦(iec/w/wwctoto/zcwani/)的200(M咅。而且，Cry3A蛋白对西方玉米根虫有很小的或者没有杀虫活性。同样，Cry3B对西方玉米根虫有比较低的杀虫能力，但是杀虫活性仍然不够理想。由于S-内毒素杀虫机理的了解，改造S-内毒素使其更有杀虫活性成为了可能。Li等人1991年确定Cry3A的三维结构时，改造S-内毒素更成就为一种可能。Cry3A蛋白具有3个结构域N-端的l-290个氨基酸是第一个结构域，由7个a螺旋组成；第二个结构域从291-500个氨基酸，包含3个卩折叠；C-端的501-644个氨基酸是第三个结构域，是一个(3-折叠。基于这种结构，提出了一个关于S-内毒素结构和功能关系的一个假说。这个假说一般来说是结构域I是在昆虫肠膜形成穿孔的主要因素(GazitandShai,1993,Appl.Environ.Microbiol.57:28162820),结构域II是和肠膜受体结合的主要部分(GazitandShai，1993,Appl.Environ.Microbiol.57:28162820),而结构域III有调节离子通道活性的功能(Chenetal.,1993,PNAS90:90419045),最有可能和蛋白的稳定性有关(Lietal.1991,supra)。VanRie等人1997年通过随机替换一个Cry3A蛋白质中在溶解性方面有重要作用的氨基酸(接近结构域II的丙胺酸)来改造Oj3A这几个随机替换中有几个限制了结构域II对受体的结合，增加了西方玉米根虫的活性。然而，其他研究显示在Cry3」结构域n中有的丙胺酸的替换破坏了受体结合能力，引起结构的不稳定(WuandDean，1996，J.Mol.Biol.255:628640)。English等人1999年报道Cry3Bb中的氨基酸替代引起了其对南方玉米才艮虫和西方的杀虫活性的增加(Intl.Pat.Appl.Publ.No.WO99/31248)。然而，在35个Cry3Bb的突变中，只有3个主要在结构域II以及结构域II和I的交界处的突变可以对西方玉米根虫有杀虫活性。而且，在对西方玉米根虫相同生物测定中野生型的Cry3Bb毒性的区别远大于突变Cry3Bb和野生型Cry3Bb的区别。因此，Cry3Bb突变体毒性的提高仅限于南方玉米才艮虫。Cry3A的另外一种改良是在Cry3A的氨基酸107117插入一个Cathpsin-G的位点而增加了对西方玉米根虫的杀虫能力(美国专利USPat.7030295;USPat.7230167)。改造的Cry3A毒素可以形成一个蛋白酶G的识别位点，据说改造后位于107-115个氨基酸之间的蛋白酶Cathpsin-G的识别位点可以改变0_yW毒素的杀虫能力。这样改造过的Cry3A对西方玉米才艮虫(D.Wrgz/erav,>gz/era)的杀虫能力比原Cry3A更高。但是目前还没有一种对西方玉米根虫(D.v//^/eravz>g^ra)有理想杀虫活性的S-内毒素(包括Cry3A,Cry3B，Cry3C,Cry7A,Cry8A,Cry8B,andCry8C)可以用来发展优秀的转基因玉米来控制玉米根虫对作物的危害。
发明内容本发明针对控制玉米根虫的需要,提供了一种增强苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质Cry3对玉米根虫的杀虫能力的方法，以及利用这种方法获得的改良Cry3、所用质粒，及其在制备转基因抗虫玉米中的应用。本发明采用的技术方案是一种增强苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质Cry3对玉米根虫的杀虫能力的方法，所述方法为对Cry3的N端第140位氨基S臾序列进行改变，所述结构改变为删除和/或插入至少一个多肽片段，所述多肽片段长度为140个氨基酸，所述Cry3为Cry3A或Cry3B。经过改变的Cry3可以通过昆虫生物测定来确定和选择增强了对玉米根虫的杀虫能力的改良Cry3。Cry3是一种苏云金芽孢杆菌晶体杀虫蛋白质，其在Bt中有二种不同的分子形式。一种是比较长的分子；另一种是同样有活性的比较短的分子，例如本发明涉及的599个氨基酸残基的Cry3A(SEQIDNo:1)。本发明要点在于通过将Cry3的N端第140位氨基酸序列改变，从而增强了其对玉米根虫的杀虫活性。Bt的晶体杀虫蛋白质的N-端氨基酸序列对杀虫活性有重要影响。删除和插入一个多肽可能可以改变杀虫活性，特别是改变杀虫语。特别是为了达到获得或者增强了对玉米根曱虫(D.v/，/eraW，/era)的杀虫能力，Cry3的N-端的132氨基酸序列可以被全部或者部分删除，也可以在氨基酸3033之间插入一个氨基酸或者多肽。通过生物测定，可以选择获得或者增强了对玉米根曱虫(Z).W^^raWrg^ra)杀虫能力的改良Cry3杀虫蛋白质。一个蛋白质在很多情况下增加或者减少N-端一个或者几个氨基酸通常对蛋白质的功能没有大的改变是已经知道的知识。因此，Cry3杀虫蛋白质在N-端删除的多肽序列的长度可能是可变的，它可以是32个氨基酸残基，更长或者更短。同样，Cry3A杀虫蛋白质在N-端的插入的位置和序列也可能是可变的。6Cry3基因目前有3个种类，分别是Cry3A(M22472:Herrnstadtetal.，1987;J02978:Sekaretal.,1987),Cry3B(X17123"Sicketal.,1990;M89794:Donovanetal.,1992),和Cry3C(X59797:Lambertetal.，1992)。它们的氨基酸序列的相同性相当高，例如Cry3Aal和Cry3Bbl的氨基酸序列相同性是68%，并且它们的杀虫能力也相似。Cry3B同样可以通过N-端删除一个多肽而获得或者增强对玉米才艮曱虫(D.v/rg^ravzVg^ra)的杀虫能力。例如在Cry3B的N-端删除32个氨基酸多肽(SEQIDNO:4)。Cry3B同样可以通过N-端插入的氨基酸而获得的改良了的Cry3B(SEQIDNO:5).具体的，所述方法可为在Cry3的N端第3033位氨基酸中插入至少一个多肽片段。为了获得改良的Cry3杀虫蛋白质而需要在N-端插入氨基酸的序列和长度可能是可变的。这些氨基酸的序列的插入有助其N-端氨基酸多肽在目标昆虫中肠中被昆虫中肠蛋白酶切除。所述方法为删除Cry3的N端第132位氨基酸中至少一个多肽片段。在N端删除的多肽序列的长度是可变的，可以是34个氨基酸残基，也可以更短，也可删除不连续的多个多肽片段。优选的所述方法为将Cry3的N端第3233位氨基酸Val-Val替换为Gly-Pro-Gly-Lys。本发明还涉及利用本发明方法获得的一种改良Cry3。优选的，所述改良Cry3为Cry3A,具有SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示的氨基酸序列，这种改良Cry3A对西方玉米根虫和北方玉米根虫的杀虫能力要远远高于天然Cry3A。优选的，所述改良Cry3为Cry3B,具有SEQIDNO.4或SEQIDNO.5所示的氨基酸序列，这种改良Cry3B对南方玉米根虫的杀虫能力要远远高于天然Cry3B。上述改良的Cry3蛋白质，可用于控制害虫。本发明还涉及含有编码SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示的Cry3A蛋白质的核苷S臾序列的质粒。以及含有编码SEQIDNO.4或SEQIDNO.5所示的Cry3B蛋白质的核苷酸序列的质粒。本发明方法可应用于制备转基因抗虫玉米。具体的，所述应用为将前述含有编码改良Cry3的核苷酸的质粒转化玉米细胞，获得转基因抗虫玉米。具体的，所述转基因抗虫玉米的获得包括下列步骤l)获得编码改良Cry3蛋白的核苦酸序列(优选为SEQIDNO:7或SEQIDNO:8的序列)；2)将这个核苦酸序列和一个启动子和一个终止子功能性地连接而形成一个能够在植物中表达的人工基因；启动子可以选择玉米泛素(Ubiqutin-1)启动子(ChristensenandQuail,TransgenicRes.，1996，5:213-8)，水稻actin启动子，或者是玉米根特异性表达启动子等；3)这个基因被克隆到转化载体，转化玉米细胞并且进一步获得转基因玉米。转基因的方法为基因枪方法、农杆菌介导方法，花粉管导入方法，或者其他方法。这些方法是已有的技术(Hieietal.(1994)ThePlantJournal6:271-282;Ishidaetal.(1996)NatureBiotechnology14:745-750;AyresandPark(1994)CriticalReviewsinPlantScience13:219-239;BommineniandJauhar(1997)Maydica42:107-120)。本发明的有益效果主要体现在提供了一种通过对Cry3的N端第1~40位氨基酸序列改变，增强Cry3(c^^to///"e户rate/"3)对玉米根虫的杀虫能力的方法，利用这种方法获得的改良Cry3蛋白导入玉米细胞获得的转基因抗虫玉米，对玉米根虫有较好的杀虫能力。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此本发明实施例所使用分子生物学的方法均为已知的技术。在Ausubel编写的JohnWileyandSons,>司出片反的CurrentProtocolsinMolecularBiology,;f口J.Sambrook等纟扁写ColdSpringHarborLaboratoryPress(2001)出版的MolecularCloning:ALabortoryManual,3rdED.等文献均有详细的说明。实施例1:构建改造的基因经过玉米密码子优化的Cry3A改良基因co^4-32G尸GK(SEQIDNO:3)是设计后由上海生工(上海)合成。天然Cry3A蛋白质的氨基酸序列和Cry3A-32G尸G《的差别在氨基酸32-36之间，天然Cry3A是ValVal(32-33)而Cry3A-32GPGK是GlyProGlyLys(32-36)。改良基因co^J-32G尸GiOl克隆在pUC57载体中BamHl和Sac1位点之间，质粒命名为pUC57-cry3A-32GPGK。玉米密码子优化的Cry3A天然基因和N-端删除的基因是利用co;14-32GP(7K作为模板通过PCR而获得的。pET28a载体的改造pET28a中表达蛋白质时N-端的His和T7多肽标记的删除。从上海生工(上海)合成以下引物Del-His陽T7-F:5，CTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGDel-His-T7-R:5，GATCCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTT将这2个引物配制成10uM的浓度并等量混合，72。C反应10分钟，作为Linker,命名为Del-His-T7-Linker。使用Xbal和BamHl对pET28a载体进行酶切回收，然后和Del-His-T7-Linker做连接，并转化入克隆菌抹TG1中，酶切和测序鉴定，获得了删除了表达蛋白质时N-端的His和T7多肽标记的pET28a改造载体，命名为pET28a-Del-His-T7。1、Cry3A改良基因(co^4-32G尸C^T)表达载体的构建使用BamHl和Sacl这2种酶分别酶切pUC57-cry3A-32GPGK和pET28a-Del-His-T7载体,凝胶回收，获得1.8kb的cry3A-32GPGK和5.3kb的pET28a-Del-His-T7载体，并将2个片段连接，转入克隆菌抹TG1中，酶切和测序鉴定获得pET28a-del-His-T7-cry3A-32GPGK,并将其转入表达菌抹BL21star(Invi加gen)。2.天然Cry3A基因(crj^4-^")基因的构建天然Cry3A基因co^^-syn基因是从co^4-32GPGK通过PCR获得的。从上海生工(上海)合成以下引物cry3-VVG-F:cry3画VVG-R:5，-GGAAGCCCACCACGCCGAGGAGGTCGCCCACCACGG.以pUC57-co^4-32GPGK为模板分别用cry3-VVG-F和通用引物M13(-20)5,GTAAAACGACGGCCAGT,以及cry3-VVG-R和通用引物，M13(-26)5'CAGGAAACAGCTATGAC，进行PCR扩增反应。然后混合以上述2个PCR^应的产物为模板，利用通用引物M13(-20)和M13(-26)为引物进行PCR扩增反应，得到一条1.8kb的PCR产物条带。将这个1.8kb的10PCR产物条带进行克隆，获得含有质粒pMD20-co^4-^"的TGl菌抹。酶切和测序鉴定说明获得的质粒pMD20-c77^-s，是正确的。用BamHl和Sacl这2种酶分别酶切pMD20-c^y3is，和pET28a-Del-His-T7载体,凝胶回收，获得1.8kb的coA5J-w"和5.3kb的pET28a-Del-His-T7载体，并将2个片段连接，转入克隆菌林TG1中，经过酶切和测序鉴定获得pET28a-Del-His-T7-codJ-矽"，并将此质粒转入表达菌抹BL21star中。3.Cry3A改良基因co;丄4-^/W基因的构建从上海生工(上海)合成以下引物cry3-del34:5,TGAGGATCCATGGGCTTCCCGTTCGGCGGCGCCCTCGT.以pUC57-c^^4-32GPGK为模板使用cry3-del34和通用引物M13(-20)进行PCR扩增反应，得到一条1.7kb的PCR产物条带。将这个1.7kb的PCR产物条带进行克隆。经过酶切和测序鉴定后，获得含有质粒pMD20-co;M-t/e/34的TG1菌抹。使用BamHl和Sacl同时酶切pMD20-codJ-t/e/34和pET28a-Del-His-T7载体，凝胶回收1.7kb的co^J-d/e/M和5.3kb的pET28a-Del-His-T7载体，并将这2个片段连接，转入克隆菌株TG1中，经过酶切和测序鉴定获得pET28a-Del-His-T7-co^4-^/3^,并将质粒转入表达菌抹BL21star中。实施例2:cry^及其改良基因在￡.co//中的表达用含有pET28a-Del陽His画T7-cry3A画32GPGK,pET28a-Del-His-T7-cr;;3^扁^"以及pET28a-Del-His-T7-cry3A-del34质粒的五.co//表达菌抹BL21star分别在LB培养基平版(含20ng/mL卡那霉素)上以划单菌落的方式涂板，并进行以下步骤诱导表达(1)使用无菌牙签在平板上挑取23mm直径的单菌落，接种至1000ml锥形瓶中的200ml液体LB培养基中(含20ng/mL卡那霉素)；(2)将锥形瓶于37。C恒温摇床中，以250转/分的速度培养5-8小时，直至菌液的OD600值达到0.6;(3)在锥形瓶中加入终浓度为lmM的IPTG，诱导表达35小时；(4)诱导完毕后，将菌液从锥形瓶移至3个100ml的无菌离心管中，以4°C，10000rmp的程序离心3分钟，去除上清；(5)在每个离心管中加入70ml的10mMPBS，重悬细胞，并以4。C，10,000rmp的程序离心3分钟，去除上清，清洗残留LB;(6)在每个离心管中加入10ml的10mMPBS,重悬细胞，以250W的功率，破碎2秒，间隔时间8秒，超声破碎时间5分钟的程序超声波破碎细胞。(7)将离心管以4。C,10000rmp的程序离心10分钟，去除上清，收集包涵体；在每个离心管中各加入2ml的10mMPBS，重悬包涵体，于-80。C保存,供杀虫活性测定用。实施例3:co^4及其改良基因的生物测定crj^4改良毒素对西方玉米根虫和北方玉米根虫的杀虫活性进行了昆虫生物测定。在生物测定中在人工饲料添加本发明在大肠杆菌表达的co^4改良毒素，然后对昆虫饲喂。500ml的表达培样品和500ml的熔化祠料相混合(Marroneetai.(1985)J.ofEconomicEntomology78:290293)。熔化铜料被分装到培养板小孔中，其凝固后在培养板每个小孔的饲料上放入20头玉米根虫幼虫。培养板置于30。C环境中，6天后记录昆虫的死亡12率。co^4改良毒素(Cry3A-32GPGK和Cry3A-de134)可以引起西方玉米冲艮虫和北方玉米根虫70%100%的死亡率，而野生型Cry3A(cry3A-syn)只有0%-20%的死亡率。实施例4:T-DNA转化质粒的构建1、Cry3A改良基因c^^U2G^G^的T-DNA转化质粒构建利用PCR的方法从玉米中扩增获得玉米泛素(ZmUbi-l)启动子。引物分另'J是ZmUbiF(5,-GCGAAGCTTGCATGCCTACAGTGCAGCGTGACCCGGTCGTGC(在5，设计有Hind3酶切位点)ZmUbiRCAG,5'设计有BamHl酶切位点)。利用BamHl和Sacl酶切pUC57-cry3A-32GPGK、Hind3和Sacl酶切pCAMBIAL1300载体，以及Hind3和BamHl酶切ZmUbi-l启动子，凝胶回收，获得1.8kb的co^4-32GPGK、8.9kb的pCAMBIAU300载体以及1.9kb的ZmUbi-l启动子，并将3个片段连接，转入克隆菌抹TG1中，酶切和测序鉴定获得含有质粒pCAMBIAL1300-Ubi-co;3J-32G尸GX的菌抹。2、Cry3A改良基因co^4-cfe/W的T-DNA转化质粒构建用BamHl和Sacl酶切pET28a画Del画His隱T7-codJ-^/W、Hind3和Sacl酶切pCAMBIAL13OO载体以及使用Hind3和BamH1酶切上述ZmUbi-1启动子，凝胶回收1.7kb的co^4-t/e/M、8.9kb的pCAMBIAL1300载体以及1.9kb的ZmUbi-l启动子，并将3个片段连接，转入克隆菌抹TG1中，酶切和测序鉴定获得含有质粒pCAMBIAL1300-Ubi-co;3J^/e/34的菌抹。实施例5:转基因抗虫玉米的获得将pCAMBIAL1300-Ubi-cry3A-32GPGK和pCAMBIAL1300-Ubi-cry3A匪de134用电击方法导入^graZwcfen'wmf讓e/ac/醋(LAB4404)。取授粉后810天的Hi-2玉米穗。收集所有的未成熟胚(大小为1.01.5mm)。将含有T-DNA载体的农杆菌与未成熟胚共培育共培养23天(22°C)。转移未成熟胚到愈伤诱导培养基上(含200mg/L的Timentin杀农杆菌)，28。C暗培养10-14天。将所有的愈伤转到带有50ng/mL潮霉素的筛选培养基上，28。C暗培养23周。转移所有的组织到新鲜潮霉素的筛选培养基上，28。C暗培养23周。然后，转移所有筛选后成活的胚性组织到再生培养基上，28。C暗培养1014天，每皿一个^K系。转移胚性组织到新鲜的再生培养基上，26。C光照培养1014天。转移所有发育完全的植抹到生根培养基上，26。C光照培养直到根发育完全。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。序列表SEQUENCELISTING<110〉浙江大学<120〉改良Cry3的方法、改良Cry3、质粒及其应用<130〉<160>15<170〉Patentlnversion3.4<210>1<211>597<212〉PRT〈213>Bacillusthuringiensis<400〉1MetThrAlaAspAsnAsnThrGluAlaLeuAspSerSerThrThrLys151015AspVallieGinLysGlylieSerValValGlyAspLeuLeuGlyVal202530ValGlyPhe35ProPheGlyGlyAla40LeuValSerPheTyr45ThrAsnPheLeuAsn50丁hrlieTrpProSer55GluAspProTrpLys60AlaPheMetGluGinValGluAlaLeuMetAspGin匕yslieAlaAspTyrAla匕ysAsn65707580LysAlaLeuAlaGlu85LeuGinGlyLeuGin90AsnAsnValGluAsp95TyrValSerAlaLeu100SerSerTrpGinLysAsnProValSerSer110ArgAsnProHisSer115GinGlyArglieZVrg120GluLeuPheSerGin125AlaGluSerHisPhe130ArgAsnSerMetPro135SerPheAlalieSer140Gly丁yrGluValLeuPheLeuThrThrTvrAlaGinAlaAlaAsnThrHisLeuPheLeu145155160LeuLysAspAlaGin165lieTyrGlyGluGlu170TrpGlyTyrGluLvs175GluAsplie八laGlu180PheTyrLysArgGin185LeuLysLeuThrGin190GluTyrThrAspHis195CysValLysTrpTyr200AsnValGlyLeuAsp205LysLeuArgG丄ySer210SerTyrGluSerTrp215ValAsnPhe/\snArg220丁yrArgArgGluMetThrLeuThrValLeuAspLeulieAlaLeuPheProleu丁yrAsp225230235240Vali\rgLeuTyrPro245LysGluValLysThr250GluLeuThr/VrgAsp255ValL,euThrAspPro260lieValGlyValAsn265AsnLeuArgGlyTyr270GlyThrThrPheSer275AsnlieGluAsnTyrlieArgLysProHis285LeuPheAspTyrLeuHisArglieGinPheHisThrArgPheGinProGlyTyr丁yr290295300G1yAsnAspSerPheAsn丁yrTrpSerGlyAsnTyrValSerThrArg310315320ProSerlieGlySerAsnAsplielieThrSerProPheTyrG1yAsn325330335LysSerSerGluProValGinAsnLeuGluPheAsnGlyGluLysVal340345350TyrArgAlaValAlaAsnThrAsnleuAlaValTrpProSerAlaVal355360365TyrSerGlyValThrLysValGluPheSerGinTyrAsnAspGinThr370375380AspGluAlaSerThrGinThrTyrAspSerLysArgAsnValGlyAla385390395400ValSerTrpAspSerlieAspGinLeuProProGluThrThrAspGlu405410415ProLeuGluLys420GlyTyrSerHisGin425LeuAsnTyrValMet430CysPheLeuMetGin435GlySerArgGlyThr440lieProValLeuThr445TrpThrHis<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>AspGluAlaSerThrGinThrTyr355360ValSerTrpAspSerlieAspGin370375ProLeuGlulysGlyTyrSerHis385390LeuMetGinGlySerArgGlyThr405LysSerValAspPhePheAsnMet420LeuProleuValLysAlaTyrLys435440AlaGlyProArgPheThrGlyGly45045SGlySerAlaAlaThrlieTyrVal465470LysTyrArgAlsArglieHisTyr485ThrLeuSerLeuAspAlaPro500ThrlieAsnLysGlyAspThrLeu515520SerPheSerThrProPheGluLeu530535ValThrGlyLeuSerAlaGlvAsp545550PhelieProValAsn565〈210>3〈211〉599<212>PRT<213〉Unknown序列表AspSerLysArgAsn365ValGlyAlaLeuProProGlu380ThrThrAspGluGinLeuAsn395TyrValMetCysPhe400liePro410ValLeuThrTrpThr415HislieAspSerLysLyslieThrGin425430LeuGinSerGlyAla445SerValValAsplielieGin460CysThrGluAsnThrProAsp475ValSerTyrSerGin480AlaSer490ThrSerGinlieThr495PhePheAsnGin丁yr丁yrPheAspLys505510Thr丁yrAsnSerPhe525AsnLeuAlaSerGlyAsnAsn540LeuGinlieGly匕ysValTyr555lieAspLyslieGlu560〈400〉3MetiThrAlaAsp丄AspVallieGin20ProGlyLysGly35AsnPheLeuAsn50MetGluGinVal65LysAsnLysAlaAspTyrValSer100ArgAsnProHis115GluSerHisPhe130GluValLeuPhe145PheLeuLeuLysLysGluAsplie180GluTyrThrAsp195leuArgGlySer210ArgGluMetThr225TyrAspValArgAspValLeuThr260GlyThrThrPheAsnAsnThrGlu5LysGlylieSerPheProPheGly40ThrI丄eTrpPro55GluAlaLeuMet70LeuAlaGluLeu85AlaLeuSerSerSerGinGlyArg120ArgAsnSerMet135LeuThrThrTyr150AspAlaGinlie165AlaGluPhe丁yrHisCysValLysSerTyrGluSer215LeuThrValLeu230LeuTyrProLys245AspProlieValSerAsnlieGluAlaleuAspSer10ValValGlyAsp25GlyAlaLeuValSerGluAspPro60AspGinLyslie75GinGlvleuGin90TrpGinLysAsn105lieArgGluLeuProSerPheAla140AlaGinAlaAla155TyrG1yGluGlu17bLysArgGinLeu185TrpTyrAsnValTrpValAsnPhe220AspLeulieAla235GluValLysThr250GlyValAsnAsn265AsnTyrlieArgSerThrThrLys15LeuLeuGlyGly30SerPheTyrThr45TrpLysAlaPheAlaAspTyrAla80AsnAsnValGlu95Pl'oValSerSer110PheSerGinAla125lieSerGlyT>rAsnThrHisLeu160TrpGlyTyrGlu匕ysLeuThrGin190GlyLeuAspLys205AsnArgTyrArgLeuPheProLeu240GluLeuThrArg255LeuArgGlyTyr270LysProHisLeu人工合成<image>imageseeoriginaldocumentpage18</image>序列表180185190LeuThrValLeuAspleulieValLeuPheProPheTyrAspValArg1952002b5LeuTyrSer匕ysGlyValLysThrGluLeuThrArgAspliePheThr210215220AspProliePheThrLeuAsnAlaLeuGinGluTyrGlyProThrPhe225230235240SerSerlieGluAsnSerlieArg匕ysProHisLeuPheAspTyrLeu245250255ArgGlylieGluPheHisThrArgLeuArgProGlyTyrSerGlyLys260265270AspSerPheAsnTyrTrpSerGlyAsn丁yrValGluThrArgProSer275280285lieGlySerAsnAspThrlieThrSerProPheTyrGlyAspLysSer295300lieGluProlieGinLysLeuSerPheAspGlyGin匕ysValTyrArg305310315320ThrlieAlaAsnThrAsplieAlaAlaPheProAspGlytyslieTyr325330335PheGlyValThrLysValAspPheSerGinTyrAspAspGin!>ysAsn340345350GluThrSerThrGinThrTyrAspSerLysArg丁yrAsnGlyTyrLeu355360365GlyAlaGinAspSerlieAspGinLeuProProGluThrThrAspGlu370375380ProLeuGluLysAlaTyrSerHisGinLeuAsn丁yrAlaGluCysPhe385395400LeuMetGinAspArgArgGlyThr工leProPhePheThrTrpThrHis405410415ArgSerValAspPhePheAsnThrlieAspAlaGluLyslieThrGin420425430LeuProValValLysAlaTyrAlaLeuSerSerGlyAlaSerlielie435440445GluGlyProGlyPheThrGlyGlyAsnLeuLeuPheLeuLysGluSer450460SerAsnSerlieAla匕ysPheLysValThrLeuAsnSerAlaAlaLeu465470475480LeuGinArgTyrArgValArglieArgTyrAlaSerThrThrAsnLeu'485495ArgLeuPheValGinAsnSerAsnAsnAspPheLeuVallieTyrlie500505510AsnLysThrMetAsnlieAspGlyAspLeuThrTyrGinThrPheAsp515520525PheAlaThrSerAsnSerAsnMetGlyPheSerG1yAspThrAsnAsp530535PhelielieGlyAlaGluSerPheValSerAsnGluLyslieTyrlie545550555560AspLyslieGluPhelieProValGin565<210〉5〈211〉602<212〉PRT<213〉Unknown〈220〉<223〉人工合成〈400〉5MetThrAlaAspAsnSerThrGluValLeuAspSerSerThrValLys151015AspAlsValGlyThrGlylieSerValValGlyGin工lel>euGlyGly202530LysProPheAlaGlyAlaLeuThrSerPhe丁yrGinSerPheLeuAsn354045AlalieTrpProSerAspAlaAspProTrp匕ysAlaPheMetAlaGin505560ValGluValLeulieAspLys匕yslieGluGluTyrAlaLysSerLys65707580AlaLeuAlaGluLeuGinGlyLeuGinAsnAsnPheGluAspTyrVal859095AsnAlaLeuAspSerTrpLysLysAlaProValAsnLeuArgSerArg100105110ArgSerGinAspArglieArgGluLeuPheSerGinAlaGluSerHis115120125PheArgAsnSerMetProSerPheAlaValSerLvsPheGluValLeu130135PheLeuProThrTyrAlaGinAlaAlaAsnThrHisLeuLeuLeuLeu145150155160LysAspAlaGinValPheGlyGluGluTrpGlyTyrSerSerGluAsp165170175lieAlaGluPheTyrGinArgGinLeu匕ysLeuThrGinGin丁yrThr180185190AspHisCysValAsnTrpTyrAsnValGlyLeuAsnSerLeuArgGly195200205Ser丁hr丁yrAspAlaTrpValLysPheAsnArgPheArgArgGluMet210215220ThrLeuThrValLeuAspLeulieValLeuPheProPheTyrAspVal225230235240ArgLeuTyrSerLysGlyValLysThrGluLeuThrArgAspliePhe245250255ThrAspProliePheThrLeuAsnAlaLeuGinGluIyrGlyProThr260265270PheSerSerlieGluAsnSerlieArgLysProHisLeuPheAspTyr275280285LeuArgGlylieGluPheHisThrArgLeuArgProGly丁yrSerGly290295300LysAspSerPheAsnIyrTrpSerGlyAsn丁yrValGluThrArgPro305315320SerlieGlySerAsnAspThrlieThrSerProPheTyrGlyAsp!>ys325330335SerlieGluProlieGinLysLeuSerPheAspGlyGinLysValTyr340345ArgThrlieAlaAsnThrAsplieAlaAlaPheProAspGlyLyslie355360365TyrPheGlyValThrI,ysValAspPheSerGinTyrAspAspGinLys3703753^0AsnGluThrSerThrGinThrTyrAspSerLysArgTyrAsnGly丁yr385390395400LeuGlyAlaGinAspSerIleAspGinleuProProGluThrThrAsp405410415GluProLeuGluLysAlaTyrSerHisGinLeuAsnTyrAlaGluCys420425430PheLeuMetGinAspAi'gArgGlyThrlieProPhePheThrTrpThr435440445HisArgSerValAspPhePheAsnThrlieAspAlaGluLyslieThr450455460GinLeuProValValLysAlaTyrAlaLeuSerSerGlyAlaSerlie465475480lieGluGlyProGlyPhe丁hrGlyGlyAsnLeuI,enPheLeuLysGlu490SerSerAsnSerlieAlaLysPheLysValThrLeuAsnSerAlaAla500505510LeuLeuGinArgTyrArgValArglieArgTyrAlaSerThrThrAsn515520525LeuArgLeuPheValGinAsnSerAsnAsnAspPheLeuVallieTyr530535540lieAsnLysThrMetAsnlieAspGlyAspLeuThrTyrGinThrPhe545550555560AspPheAlaThrSerAsnSerAsnMetGlyPheSerGlyAspThrAsn565570575AspPhelielieGlyAlaGluSerPheValSerAsnGluLyslie丁yr580585lieAspLyslieGluPhelieProValGin595600<210〉6<2U〉1800〈212〉腿〈213〉Bacillusthuringiensis〈400〉6atgaccgccgac&acaacaccgaggccctcgactcctccaccaccaaggacgtgatccag60aagggcatctccgtggtgggcgacctcctcggcgtggtgggcttcccgttcggcggcgcc120ctcgtgtccttctacaccaacttcctcaacaccatctggccgtccgaggacccgtggaag180gccttcatggagcaggtggaggccctcatggsccagaagstcgccgactacgccaagaac24020aaggccctcgccgagcttcagggcctccagaacaacgtggaggactacgtgtccgccctc300tcctcctggcag朋gaacccggtgtcctcccgcaacccgcactcccsgggccgcatccgc360gagctgttctcccaggccgagtcccacttccgcaactccatgccgtccttcgccatctcc420ggctacgaggtgctcttcctcaccacctacgcccaggccgccaacEicccscctcttcctc480ctcaaggacgcggcgaggagtggggctacgcatcgccgag540ttctacaagcgccagctcaagctcacccaggagtacaccgsccactgcgtgaagtggtac600犯cgtgggcctcgacaeigctccgcggctcctcctacgagtcctgggtg犯cttcaaccgc660taccgccgcgagatgaccctcaccgtgctcgacctcatcgccctcttcccgctctacgac720gtgcgcctctacccgaaggaggtgaagaccgaactcacccgcgacgtgctcaccgacccg780自gtgggcgtgaacaacctccgcggctacggcaccaccttctccaacatcgagaactac840atccgcaagccgcacctcttcgactacctccaccgcatccagttccacacccgcttccag900ccgggctactacggcaacgactccttcaactactggtccggcaactacgtgtccacccgc960ccgtccatcggctccaacgacatcatcac.ctccccgttctacggcaacaagtcctccgag1020ccggtgc卿acctcgagttcaacggcgsgaaggtgtaccgcgccgtggc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gcttgcatgcctacagtgcagcgtgacccggtcgtgc<210〉15<211>46<212〉DNA<213>Unknown<220〉<223〉人工序列<400〉15gtgggatcctctagagtcgacctgcagaagtaacaccaaacaacag462权利要求1.一种增强苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白质Cry3对玉米根虫(Diabroticavirgiferavirgifera)的杀虫能力的方法，所述方法为对Cry3的N端第1～40位氨基酸序列进行删除和/或插入至少一个多肽片段，所述多肽片段长度为1～40个氨基酸，所述Cry3为Cry3A或Cry3B。2.如一又利要求1所述的方法，其特征在于所述方法为在Cry3的N端第3033位氨基酸中插入至少一个多肽片段。3.如权利要求l所述的方法，其特征在于所述方法为删除Cry3的N端第132位氨基酸多肽片段。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法为将Cry3的N端第3233位氨基酸替换为Gly-Pro-Gly-Lys。5.—种按照如权利要求1所述方法获得的改良Cry3。6.如权利要求5所述的改良Cry3，所述Cry3为Cry3A,具有SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示的氨基酸序列。7.如权利要求5所述的改良Cry3,所述Cry3为Cry3B,具有SEQIDN0.4或SEQIDN0.5所示的氨基酸序列。8.含有编码如权利要求5所述Cry3蛋白质的核苷酸序列的质粒。9.如权利要8所述的质粒在制备转基因抗虫玉米中的应用。10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述应用为将所述质粒转化玉米细胞，获得转基因抗虫玉米。全文摘要本发明提供了一种增强Cry3(crystallineprotein3)对玉米根虫的杀虫能力的方法，所述方法为对Cry3的N端第1～50位氨基酸序列进行结构改良，所述结构改良为删除和/或插入至少一个多肽片段，所述多肽片段长度为1～50个氨基酸，所述Cry3为Cry3A或Cry3B。本发明的有益效果主要体现在提供了一种增强Cry3(crystallineprotein3)对玉米根虫的杀虫能力的方法，利用这种方法获得的改良Cry3蛋白的转基因抗虫玉米，对玉米根虫有较好的杀虫能力。文档编号C07K1/107GK101492490SQ20081005937公开日2009年7月29日申请日期2008年1月24日优先权日2008年1月24日发明者军方,沈志成申请人:浙江大学