检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物的荧光探针及其合成方法和用途的制作方法

专利名称：检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物的荧光探针及其合成方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物、尤其涉及检测 谷胱甘肽还原酶的荧光探针及其合成方法和用途。
背景技术：
大量研究表明全血谷胱甘肽还原酶活性系数(BGRAC)是评价机体维生 素B2营养状况特异而灵敏的指标，它不仅能反映维生素在体内的代谢利用情 况、贮存的边缘缺乏状态。且不受其它营养不良的影响。全血谷胱甘肽还原 酶担负着调节体内氧化性谷胱甘肽和还原性谷胱甘肽的重要任务。目前，谷胱甘肽还原酶的分析测定一般是利用其还原性及其与某些有机 试剂发生反应后，用电化学、分光光度法、化学发光法、催化动力学方法及 荧光方法进行分析测定，这些方法操作复杂、灵敏度不高并且选择性较差。现代医学研究也表明，体液中某种氨基酸浓度的异常变化也是导致众多 疾病产生的根源，如血液中同型半胱氨酸(Hcy)升高会促进动脉粥样硬化，进 而与缺血性心、脑血管疾病密切相关，目前侦测同型半胱氨酸在血液中浓度 的变化是诊断此类疾病危险性的一个独立参考因子，因此准确地检测体液中 同型半胱氨酸的含量已成为控制疾病发展的重要因素之一。目前使用的检测 方法繁琐且检测速度较慢，发展一种方便、灵敏、快速的检测手段是非常必 要的。目前，半胱氨酸的分析测定一般是利用其还原性及其与某些有机试剂发 生反应后，用电化学、分光光度法、化学发光法、催化动力学方法及荧光方 法进行分析测定，这些方法操作复杂、灵敏度不高并且选择性较差。光化学传感器是近年来迅速发展起来的一个新的科学问题，它的出现显 然和超分子科学的进展诸如分子组装、主客体化学、非共价相互作用、氢键 作用、疏水作用等以及光诱导电子转移(PET)过程、分子内共扼的电荷转移化 合物结构及其发光特性等研究密切相关它的发展也和许多科学技术领域诸 如生物化学、临床医学、药物化学以及环境科学中提出的大量实际问题密切 相关。由于上述种种原因，有力的推动了光化学传感器的研究进展。光化学传感器按其信号检测方法的不同，主要分为荧光探针(Fluorescent probe)又 称为荧光化学传感器(Fluorescent Chemosensor)和比色化学传感器 (Colorimetric Chemosensor)。荧光探针主要是依靠荧光信号为检测手段，通常 有荧光的增强、猝灭或者发光波长的移动，而比色化学传感器主要是借助于 色调的变化，通过肉眼观察就可以检测，方便实际应用。用于对外来物种进 行检测的荧光探针的设计和研究，是近年来受到广泛关注的一个科学问题。 荧光探针的检测过程主要是通过器件接受体(Receptor)部分对外来物种(包括 阳离子，阴离子及中性分子等)的选择性接纳，然后经不同的作用机制，如 光诱导电子转移(PET)或能量转移、金属一探针前体电荷转移(MLCT)、分子内 电荷转移(ICT)，再通过器件的信号报告部分给出有关器件在接纳物种过程中 的信息变化。荧光探针由于其有选择性好、灵敏度高、响应时间快等优点， 在微量化学物种的检测方面得到了很好的应用。香豆素类化合物因其较大的摩尔消光系数和高的荧光量子产率，已作为 荧光标记物在生物技术方面有一定的应用，但把它作为直接用来识别特定客 体的化学传感分子的例子还很少见报道。本研究组报道了基于香豆素安替比 林Schiff碱在乙腈中对Zn"选择性识别的化学传感分子。这类传感分子的设计 原理是，金属离子通过与接受体的配位作用，诱导了刚性结构的形成。阻止 了安替比林Schiff碱的异构化作用，从而使荧光量子产率大大增强，根据这 个过程实现对Zn2+的选择性识别。在本发明中，我们设计合成了基于香豆素检 测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物的荧光探针，与前人的工作相比(1. Yong Guo， Shijun Shao, Jian Xu, Yanping Shi and Shengxiang Jiang.A specific colorimetric cysteine sensing probe based on pyrromethane—TCNQ assembly丄饥2004. 45. 6477 6柳.2. Weihua Wang, Oleksandr Rusin， Xiangyang Xu, Kyu Kwang Kim，Jorge O. Escobedo, Sayo O. Fakayode, Kristin A. Fletcher, Mark Lowry，Corin M. Schowalter, Candace M. Lawrence, Frank R. Fronczek,Isiah M. Warner, and Robert M. Strongin Detection of Homocysteine andCysteine. Jj肌CTze附.& c.2005， 127, 15949 15958.)，其有这样的优点 荧光探针分子对谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物有识别作用时，不仅 使吸收和荧光的强度有较大的增强，而且会使溶液出现由颜色的变化，这一 过程可方便的实现肉眼检测。发明内容本发明的目的之一在于克服现有荧光探针的性能和结构上的不足之处， 提供一种性能优良的检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物的荧光探14针。本发明的目的之二是提供用于合成检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基 化合物的荧光探针的探针前体。本发明的目的之三是提供用于合成检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基 化合物的荧光探针的探针前体的合成方法。本发明的目的之四是提供检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物荧 光探针的合成方法。本发明的目的之五是提供谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物荧光探 针的用途。用于合成本发明的检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物的荧光探针的探针前体具有以下结构(n)>R5，^\上述式(I)或式(II)中的&或R2分别或者同时为烷基、取代垸基或芳基； R3为氢、烷基、垸氧基、胺基或芳基；R4为氢、烷基、垸氧基、芳基、硝基15本发明的检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物的荧光探针具有以 下结构(I)或卤素；Rs为氢、烷基、垸氧基、胺基、芳基、硝基或卤素；X为硝酸根、 硫酸根、磷酸根、高氯酸根、硫氰酸根或卤素。所述的R,、 R2、 R3、 R4或R5中的垸基为1至50个碳原子的垸基或3 至50个碳原子的环烷基；所述的Ri或R2中的取代烷基为芳基取代的1至50个碳原子的垸基、 "-羟基取代的1至50个碳原子的烷基、"-羧基取代的1至50个碳原子的烷 基或co-酯基取代的1至50个碳原子的烷基；所述的Ri、 R2、 R3、 R4或Rs中的芳基为邻、对、间位1至50个碳原 子的垸基苯基，邻、对、间位卤代苯基，邻、对、间位1至50个碳原子取代 或未取代的烷氧基苯基或邻、对、间位胺基苯基；所述的R3、 R4或R5中的烷氧基为l至50个碳原子的垸氧基；所述的R3或R5中的胺基选自1至50个碳原子的烷基胺基，或选自"-羟基烷基胺基，"-羧基烷基胺基，"-酯基烷基胺基，芳基胺基，二烷基胺基， 二 ("-羟基烷基)胺基，二 ("-羧基烷基)胺基，二 (co-酯基烷基)胺基， 二芳胺基及季铵盐基中的一种；其中烷基是1至12个碳原子；所述的R4、 R5或X中的卤素为氟、氯、溴或碘。所述的R,、R2中的1至50个碳原子的烷基分别或者同时选自甲基，乙基， 丙基，烯丙基，异丙基，丁基，异丁基，戊基，异戊基，己基，2—甲基戊基， 庚基，2—甲基己基，辛基，2—甲基庚基，壬基，2—甲基辛基，癸基，2— 甲基壬基，十一烷基，十二烷基，十三烷基，十四垸基及十五烷基中的一种；所述的R3、 R4或R5中的1至50个碳原子的烷基选自甲基，乙基，丙基， 异丙基，丁基，异丁基，叔丁基，戊基，异戊基，新戊基，叔戊基及己基中 的一种；所述的R卜R2中的3至50个碳原子的环烷基分别或者同时选自环丙垸基， 环丁烷基，环戊垸基，环己烷基及环庚烷基中的一种；所述的R" R4或R5中的3至50个碳原子的环烷基选自环丙烷基，环丁 烷基，环戊垸基，环己烷基及环庚烷基中的一种。所述的R,、R2中的芳基取代的1至50个碳原子的烷基分别或者同时选自 芳基甲基，芳基乙基，芳基丙基，芳基烯丙基，芳基异丙基，芳基丁基，芳 基异丁基，芳基戊基，芳基异戊基，芳基己基，2—甲基芳基戊基，芳基庚基， 2—甲基芳基己基，芳基辛基，芳基2—甲基庚基，芳基壬基，2—甲基芳基辛 基，芳基癸基，2—甲基芳基壬基，芳基十一烷基，芳基十二烷基，芳基十三基十五烷基中的一种；所述的R,、 R2中的"-羟基取代的1至50个碳原子的垸基分别或者同时 选自"-羟基甲基，o)-羟基乙基，co-羟基丙基，co-羟基异丙基，"-羟基丁基， "-羟基异丁基，"-羟基戊基，"-羟基异戊基，co-羟基己基，co-羟基-2—甲 基戊基，"-羟基庚基，"-羟基-2_甲基己基，"-羟基辛基，"-羟基庚基， "-羟基壬基，co-羟基-2—甲基辛基，co-羟基癸基，"-羟基-2—w-羟基甲基 壬基，"-羟基十一垸基，co-羟基十二烷基，co-羟基十三烷基，"-羟基十四 垸基及co -羟基十五烷基中的一种；所述的Rt、 R2中的"-羧基取代的1至50个碳原子的烷基分别或者同时 选自co-羧基甲基，co-羧基乙基，O)-羧基丙基，co-羧基异丙基，co-羧基丁基， "-羧基异丁基，co-羧基戊基，co-羧基异戊基，co-羧基己基，co-羧基-2—甲 基戊基，"-羧基庚基，o-羧基-2—甲基己基，co-羧基辛基，co-羧基庚基， "-羧基壬基，co-羧基-2—甲基辛基，o)-羧基癸基，co-羧基-2—"-羧基甲基 壬基，"-羧基十一垸基，co-羧基十二烷基，"-羧基十三烷基，"-羧基十四 烷基及"-羧基十五烷基中的一种；所述的R,、 R2中的"-酯基取代的1至50个碳原子的垸基分别或者同时选自"-酯基甲基，"-酯基乙基，"-酯基丙基，"-酯基异丙基，G)-酯基丁基，"-酯基异丁基，"-酯基戊基，"-酯基异戊基，"-酯基己基，"-酯基-2—甲 基戊基，"-酯基庚基，"-酯基-2_甲基己基，co-酯基辛基，"-酯基庚基， "-酯基壬基，"-酯基-2—甲基辛基，"-酯基癸基，"-酯基-2—"-酯基甲基 壬基，"-酯基十一烷基，co-酯基十二烷基，"-酯基十三烷基，w-酯基十四 垸基及"-酯基十五垸基中的一种。所述的R^ R2中的邻、对、间位1至50个碳原子的烷基苯基分别或者同 时是邻、对、间位取代甲基苄基，邻、对、间位取代乙基苄基，邻、对、间 位取代丙基苄基或邻、对、间位取代异丙基节基；所述的R,、 R2中的邻、对、间位卤代苯基分别或者同时是邻、对、间位 氟代苄基，邻、对、间位氯代苄基，邻、对、间位溴代苄基或邻、对、间位 碘代苄基；所述的Rt、 R2中的邻、对、间位1至50个碳原子取代的垸氧基苯基分别 或者同时是邻、对、间位取代甲氧苄基，邻、对、间位取代乙氧基节基或邻、 对、间位取代丙氧基苄基；所述的&、 R2中的邻、对、间位胺基苯基分别或者同时是邻、对、间位 取代甲胺基苄基，邻、对、间位取代乙胺基苄基或邻、对、间位取代丙胺基苄基；所述的R3中的邻、对、间位1至50个碳原子的烷基苯基选自邻、对、间 位甲基苯基，邻、对、间位乙基苯基，邻、对、间位丙基苯基及邻、对、间 位异丙基苯基中的一种；所述的R3中的邻、对、间位卤代苯基选自邻、对、间位氟代苯基，邻、 对、间位氯代苯基，邻、对、间位溴代苯基及邻、对、间位碘代苯基中的一 种；所述的R3中的邻、对、间位1至50个碳原子取代的垸氧基苯基选自邻、 对、间位甲氧基苯基，邻、对、间位乙氧基苯基及邻、对、间位丙氧基苯基 中的一种；所述的R3中的邻、对、间位胺基苯基选自邻、对、间位甲胺基苯基，令卩、 对、间位乙胺基苯基及邻、对、间位丙胺基苯基中的一种；所述的R4中邻、对、间位1至50个碳原子的垸基苯基是邻、对、间位甲 基苯基，邻、对、间位乙基苯基或邻、对、间位丙基苯基中的一种；所述的R4中邻、对、间位卤代苯基选自邻、对、间位氟代苯基，邻、对、 间位氯代苯基，邻、对、间位溴代苯基及邻、对、间位碘代苯基中的一种；所述的R4中邻、对、间位1至50个碳原子取代的垸氧基苯基选自邻、对、 间位甲氧基苯基，邻、对、间位乙氧基苯基及邻、对、间位丙氧基苯基中的 一种；所述的W中邻、对、间位胺基苯基选自邻、对、间位甲胺基苯基，邻、 对、间位乙胺基苯基及邻、对、间位丙胺基苯基中的一种；所述的R5中的邻、对、间位1至50个碳原子的烷基苯基选自邻、对、 间位甲基苯基，邻、对、间位乙基苯基及邻、对、间位丙基苯基中的一种；所述的R5中的邻、对、间位卤代苯基选自邻、对、间位氟代苯基，邻、 对、间位氯代苯基，邻、对、间位溴代苯基及邻、对、间位碘代苯基中的一 种；所述的R5中的邻、对、间位1至50个碳原子取代的垸氧基苯基选自邻、 对、间位异丙基苯基，邻、对、间位甲氧基苯基，邻、对、间位乙氧基苯基 或及邻、对、间位丙氧基苯基中的一种；所述的R5中的邻、对、间位胺基苯基选自邻、对、间位甲胺基苯基，邻、 对、间位乙胺基苯基或邻、对、间位丙胺基苯基中的一种；所述的R3或Rs中l至50个碳原子的垸氧基选自甲氧基，乙氧基，丙氧 基，异丙氧基，丁氧基，异丁氧基，仲丁氧基，叔丁氧基，戊氧基，异戊氧基，新戊氧基，叔戊氧基，己氧基，2-甲基戊氧基及苄氧基中的一种；所述的R4中1至50个碳原子的烷氧基选自甲氧基，乙氧基，丙氧基，异 丙氧基，丁氧基，异丁氧基，仲丁氧基，叔丁氧基，戊氧基，异戊氧基，新 戊氧基，叔戊氧基，己氧基及苄氧基中的一种。所述的R3或Rs中的l至50个碳原子的烷基胺基选自甲胺基，乙胺基， 丁胺基，戊胺基，异戊胺基，新戊胺基，叔戊胺基及己胺基中的一种；所述的R3或R5中的"-羟基烷基胺基选自2—羟基乙基胺基，3—羟基丙 基胺基，4~^5基丁基胺基，5—羟基戊基胺基及6—羟基己基胺基中的一种；所述的R3或R5中的co -羧基烷基胺基选自2—羧基乙基胺基，3—羧基丙 基胺基，4一羧基丁基胺基，5—羧基戊基胺基及6—羧基己基胺基中的一种；所述的R3或R5中的co -酯基烷基胺基选自2—酯基乙基胺基，3—酯基丙 基胺基，4一酯基丁基胺基，5—酯基戊基胺基及6~酯基己基胺基中的一种；所述的R3或Rs中的芳基胺基选自邻、对、间位甲基苄基胺基，邻、对、 间位乙基苄基胺基，邻、对、间位丙基苄基胺基，邻、对、间位异丙基苄基 胺基，邻、对、间位甲氧基苄基胺基，邻、对、间位乙氧基苄基胺基，邻、 对、间位丙氧基苄基胺基，邻、对、间位氟代苄基胺基，邻、对、间位氯代 苄基胺基，邻、对、间位溴代苄基胺基及邻、对、间位碘代苄基胺基中的一 种；所述的R3或R5中的二烷基胺基选自二甲胺基，二乙胺基，二丙胺基，二丁胺基，二戊胺基，二异戊胺基，二新戊胺基，二叔戊胺基及二己胺基中的 一种；所述的R3或Rs中的二 ("-羟基烷基)胺基选自二 (2—羟基乙基)胺基， 二 (3—羟基丙基)胺基，二 (4^5基丁基)胺基，二 (5—羟基戊基)胺基 及二 (6—羟基己基)胺基中的一种；所述的R3或R5中的二 ("-羧基垸基)胺基选自二 (2—羧基乙基)胺基， 二 (3—羧基丙基)胺基，二 (4一羧基丁基)胺基，二 (5—羧基戊基)胺基 及二 (6—羧基己基)胺基的一种；所述的R3或Rs中的二 ("-酯基烷基)胺基选自二 (2—酯基乙基)胺基, 二 (3—酯基丙基)胺基，二 (4一酯基丁基)胺基，二 (5—酯基戊基)胺基 及二 (6—酯基己基)胺基中的一种；所述的R3或R5中的二芳胺基选自二 (邻、对、间位甲基苄基)胺基，二 (邻、对、间位乙基苄基)胺基，二 (邻、对、间位丙基苄基)胺基，二 (邻、 对、间位异丙基苄基)胺基，二 (邻、对、间位甲氧基苄基)胺基，二 (邻、对、间位乙氧基苄基)胺基，二 (邻、对、间位丙氧基苄基)胺基，二 (邻、 对、间位氟代苄基)胺基，二 (邻、对、间位氯代苄基)胺基，二 (邻、对、 间位溴代苄基)胺基及二 (邻、对、间位碘代苄基)胺基中的一种。本发明的检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物荧光探针的合成方 法，包括以下步骤1) 将带有Rp R2， R3和R4取代基的香豆素3—羰基化合物溶于干燥的有机溶剂中，在室温或回流温度下缓慢滴加带有R5取代基的邻巯基苯胺，其中带有R,， R2， R3和R4取代基的香豆素3—羰基化合物与带有R5取代基的 邻巯基苯胺的摩尔比是l: 1 5;搅拌反应1 4小时后得到固体沉淀，过滤 除去有机溶剂，真空干燥所得固体后得到式(II)的探针前体；2) 将步骤l得到的探针前体溶于干燥的有机溶剂中，在冰浴条件下，缓 慢滴加HgX2，其中探针前体与HgX2的摩尔比是l: 1 2 ;室温搅拌反应4 16小时后得到红色固体沉淀，过滤后真空干燥红色固体，然后用有机溶剂扩 散结晶，得到式(I)的红色针状晶体，即所述荧光探针；所述的取代基R1、 R2、 R3、 R4、 W及X的定义同上述发明内容中所述。 所述的有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、1， 2-二氯乙垸、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈、丙酮、苯及甲苯等中的一种以上。本发明的检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物荧光探针可用于生 物体系中谷胱甘肽还原酶和生物活性巯基化合物的检测，生物活细胞和活组 织内的谷胱甘肽还原酶和生物活性巯基化合物的分析检测和荧光成像检测， 以及临床医学上病变组织中谷胱甘肽还原酶和生物活性巯基化合物的检测。本发明提供了一种以香豆素为母体、用于检测谷胱甘肽还原酶及生物活 性巯基化合物的荧光探针。该荧光探针对谷胱甘肽还原酶和还原型谷胱甘肽， 半胱氨酸，乙酰半胱氨酸，高胱氨酸，谷胱甘肽等生物活性巯基化合物有很 好的选择性，其它氨基酸，蛋白质和酶对检测没有影响，溶液的荧光强度与 生物活性巯基化合物的浓度在lxl(T7M到lxlO—5M的范围内有一定的线性关 系，表现出了它良好的实际应用性；该系列探针分子结构简单，合成方法简 单且效率高，易推广于实际检测。


图l.本发明实施例1中荧光探针对谷胱甘肽还原酶与其它蛋白质的选择 性识别；其中图la是荧光探针分别加入到各种酶或蛋白质溶液中后的颜色变化(左数 第二为谷胱甘肽还原酶)；图lb是荧光探针分别加入到各种酶或蛋白质溶液 中后的荧光选择性；由左至右分别为荧光探针I-1 (HgL)， GR(谷胱甘肽还 原酶)，p印sin(胃蛋白酶)，tripsin(胰蛋白酶)，catalase， BSA， protease (蛋 白酶)，lysozyme， globulin(球蛋白)，protamine。图2.本发明实施例1中荧光探针对生物活性巯基化合物还原型谷胱甘肽 GSH的选择性识别(图中左边黑色表示未加GSH的荧光探针I-l (HgL)溶液 不发荧光，右边绿色表示加入GSH后荧光增强)。图3.本发明实施例1中荧光探针的荧光强度对生物活性巯基化合物还原 型谷胱甘肽浓度的线性关系(相关系数1 =0. 99685)。
具体实施方式
实施例1(1) 将2.5 g 7-N,N-二乙氨基香豆素-3 —醛溶于干燥甲醇中，搅拌回流反应 下缓慢滴加3.5g邻巯基苯胺，搅拌回流反应5小时后过滤，常温真空干燥所 得固体后得探针前体(II-1)，产率87%。EI國MS，m/e,319.1 [M+l]+.入abmax/nm =390腦。(2) 将3g探针前体(II-l)溶于干燥三氯甲垸中，在冰浴条件下，缓慢滴加 入2gHgCl2，搅拌回流反应3小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色 固体，然后用乙醇结晶，得到红色针状晶体荧光探针(I-1)，产率850/。。EI-MS， m/e, 590.1 [M+l]十.入abmax/nm = 490跳<formula>formula see original document page 21</formula>荧光探针I-1的结构将荧光探针(I-1)分别加入到各种酶或蛋白质(见图lb)溶液中，由图la可看出在各种酶和蛋白质溶液中加入荧光探针(1-1)后的颜色变化，左数第二 为谷胱甘肽还原酶，颜色由橙色变为浅黄色，而其它酶和蛋白质溶液中在加 入荧光探针(I-1)后无此变化，说明本发明的荧光探针具有选择性识别。荧光探针(I-1)分别加入到各种酶或蛋白质溶液中后的荧光选择性见图lb;荧光探针对生物活性巯基化合物还原型谷胱甘肽GSH的选择性识别见图 2 (图中左边黑色表示未加GSH的荧光探针I-1 (HgL)溶液不发荧光，右边 绿色表示加入GSH后荧光增强)；对生物活性巯基化合物还原型谷胱甘肽浓 度的线性关系见图3 (相关系数R=0. 99685)。实施例2(1) 2.7 g 7-N,N-二甲氨基香豆素-3 —醛溶于干燥甲醇中，室温搅拌下缓慢 滴加5 g邻巯基苯胺，回流搅拌反应8小时后过滤，常温真空干燥所得固体后 得探针前体(II-2)，产率78%。EI-MS， m/e, 287.1 [M+l]+,人abmax/nm =390訓。(2) 将3.6g探针前体(II-2)溶于干燥三氯甲烷中，在冰浴条件下，缓慢滴 加入2gHgCl2，搅拌回流反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红 色固体，然后用四氢呋喃(THF)与乙醚的混合液结晶(体积比2: 1)，得到 红色针状晶体荧光探针(I-2)，产率90%。EI-MS, m/e, 558.1 [M]+,入abmax/nm = 487nm。c卜-Hg荧光探针1-2的结构实施例3(1) 25 g 7-N,N-二甲氨基-4-甲基香豆素-3 —醛溶于干燥甲醇中，室温搅拌 下缓慢滴加32 g邻巯基苯胺，搅拌反应4小时后过滤，常温真空干燥所得固 体后得探针前体(II-3)，产率61%。 EI-MS， m/e, 302,2 [M+l]+.入abmax/nm =390nm。(2)将13g探针前体(II-3)溶于干燥三氯甲垸中，在冰浴条件下，缓慢滴加 入10 g HgCl2，搅拌反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固体， 然后用THF:乙醚的混合液结晶(体积比2: 1)，得到红色针状晶体荧光探针 (1-3)，产率87%。
EI-MS, m/e， 573.1 [M+l]+.入abmax/nm = 481nm。
荧光探针(I-3)的结构
实施例4
(1) 6.5 g 7-N，N-二乙氨基-6， 8-二甲基香豆素-3 —醛溶于干燥乙腈中，室 温搅拌下缓慢滴加5 g邻巯基苯胺，搅拌反应8小时后过滤，常温真空干燥所 得固体后得探针前体(II-4)，产率72%。
EI國MS, m/e， 347.1 [M+l]+.入abmax/nm =392nm。
(2) 将5.7g探针前体(II-4)溶于干燥二甲基亚砜中，在冰浴条件下，缓慢 滴加入3gHgCl2，搅拌反应14小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色 固体，然后用THF:乙醚的混合液结晶(体积比2: 1)，得到红色针状晶体荧 光探针(I-4)，产率79%。
EI掘，m/e, 618.1 [M+l]十.入abmax/nm = 472 nm
c卜
-Hg
荧光探针(I-4)的结构实施例5
7-(N-乙基-N，-苄基)胺基香豆素醛的合成参见文献(J. Am. Chem. Soc. 2003 125, 16174 16175)。
(1) 6.5 g 7-(N-乙基-N，-节基)胺基香豆素醛溶于干燥乙腈中，室温搅拌下 缓慢滴加7 g邻巯基苯胺，回流搅拌反应4小时后过滤，常温真空干燥所得固 体后得探针前体(II-5)，产率40%。
EI画MS, m/e, 380,1 [M+l]+.人abmax/nm =387nm,
(2) 将5.7g探针前体II-5溶于干燥二甲基亚砜中，在冰浴条件下，缓慢 滴加入3.4gHgCl2，搅拌反应14小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红 色固体，然后用THF:乙醚的混合液结晶(体积比2: 1)，得到红色针状晶体 荧光探针(I-5)，产率76%。
EI誦MS, m/e, 651.3 [M+l]+,入ab丽/證=473画。
荧光探针(I-5)的结构
实施例6
(1) 25 g 7-N，N-二("-甲酯基己基)-4-甲基香豆素-3—醛溶于干燥乙腈中， 室温搅拌下缓慢滴加32 g邻巯基苯胺，搅拌反应4小时后过滤，常温真空干 燥所得固体后得探针前体(II-6)，产率61%。
EI画MS，m/e，590.1 [M+l]+.入abmax/nm =390nm,
(2) 将13g探针前体(II-6)溶于干燥二甲基亚砜中，在冰浴条件下，缓慢 滴加入10gHgBr2，搅拌反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色 固体，然后用THF:乙醚的混合液结晶(体积比2: 1)，得到红色针状晶体荧 光探针(I-6)，产率57%。
EI-MS, m/e， 861.2 [M+l]+.入abmax/nm = 467 nm。<image>image see original document page 25</image>
实施例7
(1) 25 g 7-N,N-二("-甲酯基己基)-4-乙氧基香豆素-3 —酸溶于干燥乙腈 中，室温搅拌下缓慢滴加32 g邻巯基苯胺，回流搅拌反应4小时后过滤，常 温真空干燥所得固体后得探针前体(II-7)，产率46%。
EI-MS, m/e， 634.1 [M+l]+. A abmax/nm =390nm。
(2) 将13 g探针前体(II-7)溶于干燥二甲基亚砜中，在冰浴条件下，缓慢 滴加入14gHgCl2，搅拌反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色 固体，然后用THF:乙醚的混合液结晶(体积比2: 1)，得到红色针状晶体荧 光探针(I-7)，产率79%。
EI画MS， m/e, 833.2 [M+l]+,入abmax/nm = 465腦。<image>image see original document page 25</image>实施例8
(1) 25 g 7-N,N-二("-甲酯基己基)-4-乙氧基香豆素-3 —醛，室温搅拌下缓 慢滴加15g2-巯基-6-溴苯胺，搅拌反应4小时后过滤，常温真空干燥所得固 体后得探针前体(II-8)，产率47%。
EI國MS， m/e,714.2 [M+l]+,入abmax/nm =390nm。
(2) 将13g探针前体(II-8)溶于干燥二甲基亚砜中，在冰浴条件下，缓慢 滴加入16gHgCl2，搅拌反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色 固体，然后用THF:乙醚的混合液结晶(体积比2: 1)，得到橙色针状晶体荧 光探针(I-8)，产率43%。
EI-MS, m/e， 911.2 [M+l]+.入abmax/nm = 463 nm。
荧光探针(I-8)的结构
实施例9
(1) 14 g 7-N,N-二(5—羧基戊基胺基)-4-甲基香豆素-3 —醛溶于干燥丙酮 中，室温搅拌下缓慢滴加32 g邻巯基苯胺，搅拌反应4小时后过滤，常温真 空干燥所得固体后得探针前体(II -6)，产率88%。
EI國MS， m/e， 513.2 [M+l]+. X abmax/nm =390跳
(2) 将13g探针前体(II-6)溶于干燥乙醚中，在冰浴条件下，缓慢滴加入 13gHgBr2，搅拌反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固体， 然后用THF:甲苯的混合液结晶(体积比3: 1)，得到红色针状晶体荧光探针 (1-9),产率57%。
EI-MS,m/e, 855.2 [M+l]+. Xab,/nm = 467nm。<formula>formula see original document page 27</formula>
荧光探针(I-9)的结构
实施例10
(1) 25 g 7-N，N-二("-羧基丙垸基)-4-叔戊氧基香豆素-3—醛溶于干燥丙酮 中，搅拌室温下缓慢滴加43 g邻巯基苯胺，回流搅拌反应4小时后过滤，常 温真空干燥所得固体后得探针前体(II-IO)，产率46%。
EI画MS， m/e， 1165 [M+l]+.入abmax/nm =390跳
(2) 将13g探针前体(II-10)溶于干燥乙醚中，在冰浴条件下，缓慢滴加入 23gHgCl2，搅拌反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固体， 然后用THF:乙醚的混合液结晶(体积比2: 1)，得到红色针状晶体荧光探针 (I誦IO)，产率69%。
EI-MS，m/e, 841.2 [M+l]+.入abmax/nm = 468 nm。
<formula>formula see original document page 27</formula>
荧光探针(I-10)的结构实施例11
(1) 25 g 7-N,N-二甲氨基-4-甲基香豆素-3-醛溶于干燥丙酮中，室温搅拌 下缓慢滴加32 g 4-甲基邻巯基苯胺，回流搅拌反应4小时后过滤，常温真空 干燥所得固体后得探针前体(II-ll)，产率76%。
EI-MS， m/e， 634.1 [M+l]+.入abmax/nm =392画。
(2) 将13g探针前体(II-ll)溶于干燥乙醚中，在冰浴条件下，缓慢滴加入 43gHgCl2，搅拌反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固体， 然后用THF:乙醚的混合液结晶(体积比2: 1)，得到红色针状晶体荧光探针 (1-11)，产率18%。
EI國MS, m/e, 905.2 [M+l]+,入abmax/nm = 463證。
实施例12
(1) 18 g 7-N，N-二(5—羧基戊基胺基)-4-溴香豆素-3—醛溶于干燥丙酮中， 室温搅拌下缓慢滴加32g2-巯基5-溴苯胺，搅拌反应3.5小时后过滤，常温真 空干燥所得固体后得探针前体(II-12)，产率75%。
EI画MS, m/e, 615.2 [M+l]+,入abmax/nm =390歸。
(2) 将13g探针前体(II-12)溶于干燥乙醚中，在冰浴条件下，缓慢滴加入 10gHgBr2，搅拌反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固体， 然后用二氯甲烷乙醚的混合液结晶(体积比2: 1)，得到红色针状晶体荧光 探针(I-12)，产率57%。
EI-MS, m/e, 840.2 [M+l]+,入abmax/nm = 467 nm。
荧光探针(n-ii)的结构<formula>formula see original document page 29</formula>
荧光探针(I-12)的结构
实施例13
(1) 25 g 7-N,N-二("-丙酯基十二垸基)-4-乙氧基香豆素-3-醛溶于干燥丙 酮中，搅拌室温下缓慢滴加32 g邻巯基苯胺，搅拌反应4小时后过滤，常温 真空干燥所得固体后得探针前体(11-13)，产率86%。
EI-MS, m/e, 877.1 [M+l]+,入abmax/nm =390跳
(2) 将13g探针前体(II-13)溶于干燥乙醚中，在冰浴条件下，缓慢滴加入 10gHgCl2，搅拌反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固体， 然后用甲苯乙醚的混合液结晶(体积比3: 1)，得到红色针状晶体荧光探针 (1画13)，产率67%。
EI國MS， m/e, 1148.3 [M+l]+.入abmax/nm = 488 nm。
<formula>formula see original document page 29</formula>实施例14
(1) 18 g 7-N,N-二甲氨基-4-甲基香豆素-3 —醛溶于干燥丙酮中，室温搅拌 下缓慢滴加32 g邻巯基苯胺，搅拌反应2小时后过滤，常温真空干燥所得固 体后得探针前体(11-14)，产率97%。
EI-MS， m/e, 280.1 [M+l]+.入abmax/nm =390跳
(2) 将5.5g探针前体(II-14)溶于干燥乙醚中，在冰浴条件下，缓慢滴加入 10gHgSO4,搅拌反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固体， 然后用THF:乙醚的混合液结晶(体积比2: 1)，得到红色针状晶体荧光探针 (1-14)，产率75%。
EI曙MS， m/e， 578.8 [M+l]+.入abmax/nm = 476證。
<formula>formula see original document page 30</formula>
荧光探针(I-14)的结构
实施例15
(1) 14 g 7-N，N-二(丙酯基丙胺基)-4-甲基香豆素-3 —醛溶于干燥乙醚中， 室温搅拌下缓慢滴加27g2-巯基-4-氯苯胺，搅拌反应4小时后过滤，常温真 空干燥所得固体后得探针前体(11-15)，产率61%。
EI-MS, m/e, 863.1 [M+1 ]+.入ab max/nm =390腿。
(2) 将13g探针前体(II-15)溶于干燥乙醚中，在冰浴条件下，缓慢滴加入 10gHgBr2，搅拌反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固体， 然后用DMF:乙醚的混合液结晶(体积比2: 1)，得到红色针状晶体荧光探 针(1-15)，产率74%。
EI-MS， m/e， 897.2 [M+l]十.入abmax/nm =468 nm<formula>formula see original document page 31</formula>
荧光探针(I-15)的结构
实施例16
(1) 25 g 7-N，N-二("-乙酯基庚基)-4-乙氧基香豆素-3—醛溶于干燥二氯甲 垸中，室温搅拌下缓慢滴加32 g邻巯基苯胺，搅拌反应4小时后过滤，常温 真空干燥所得固体后得探针前体(11-16)，产率46%。
EI-MS, m/e， 878.2 [M+l]+.入abmax/nm =390腿。
(2) 将13g探针前体(II-16)溶于干燥二氯甲垸中，在冰浴条件下，缓慢滴 加入10gHgCl2，搅拌反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固 体，然后用THF:甲苯的混合液结晶(体积比2: 1)，得到红色针状晶体荧光 探针(1-16)，产率74%。
EI-MS， m/e， 859.2 [M+l]+. A abmax/nm = 478跳
<formula>formula see original document page 31</formula>
荧光探针(I-16)的结构实施例17
(1) 25 g 7-N，N-二甲氨基-4-甲基香豆素-3 —醛溶于干燥乙腈中，室温搅拌 下缓慢滴加31g 2-巯基-5-氯苯胺，搅拌反应4小时后过滤，常温真空干燥所 得固体后得探针前体(II-17)，产率57%。
EI-MS, m/e， 726.2 [M+l]+.入ab腿/nm =390跳
(2) 将13g探针前体(II-17)溶于干燥丙酮中，在冰浴条件下，缓慢滴加入 10gHgCl2，搅拌反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固体， 然后用THF:丙酮的混合液结晶(体积比2: 1)，得到红色针状晶体荧光探针 (1-17)，产率88%。
EI画MS， m/e, 997.5 [M+l]+.入abmax/nm = 473證。
实施例18
(1) 46 g 7-N,N-二乙基-4-甲基香豆素-3 —醛溶于干燥乙腈中，室温搅拌下 缓慢滴加53 g 2-巯基-3-氟苯胺，搅拌反应2小时后过滤，常温真空干燥所得 固体后得探针前体(II-18)，产率61%。
EI國MS, m/e， 241.1 [M+l]+,入abmax/nm =390跳
(2) 将13g探针前体(II-18)溶于干燥丙酮中，在冰浴条件下，缓慢滴加入 10gHgBr2，搅拌反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固体， 然后用THF: DMF的混合液结晶(体积比2: 1)，得到红色针状晶体荧光探 针(1-18)，产率84%。
EI隱MS,m/e, 621.2 [M+l]+,入abmax/nm = 467 nm。H
荧光探针(I-18)的结构
实施例19
(1) 36 g 7-N,N-二(4-乙氧基苄基)-4-乙氧基香豆素-3 —醛溶于干燥乙腈中， 室温搅拌下缓慢滴加54 g邻巯基苯胺，搅拌反应4小时后过滤，常温真空干 燥所得固体后得探针前体(11-19)，产率46%。
EI-MS, m/e， 518.2 [M+l]+,入ab腿/nm =390nm。
(2) 将13g探针前体(II-19)溶于干燥丙酮中，在冰浴条件下，缓慢滴加入 10gHgBr2，搅拌反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固体， 然后用DMF:乙醚的混合液结晶(体积比2: 1)，得到红色针状晶体荧光探 针(1-19)，产率87%。
EI-MS,m/e， 861.1 [M+l]+,入abmax/nm = 468腿。
荧光探针(I-19)的结构(1) 43 g 7-N，N-二苄基-4-乙氧基香豆素-3 —醛溶于干燥乙腈中，室温搅拌 下缓慢滴加33 g2-巯基-4-氯苯胺，搅拌反应3小时后过滤，常温真空干燥所 得固体后得探针前体(II -20)，产率57%。
EI-MS, m/e， 474.1 [M+l]+,入ab,/nm =390nm。
(2) 将13g探针前体(II-20)溶于干燥丙酮中，在冰浴条件下，缓慢滴加入 10gHgBr2，搅拌反应7小时后得红色固体，过滤后常温真空干燥红色固体， 然后用丙酮乙醚的混合液结晶(体积比2: 1)，得到红色针状晶体荧光探针 (1-20)，产率25%。
EI-MS， m/e, 835.0 [M+l]+,入abmax/nm = 463 nm。
荧光探针(I-20)的结构
应当理解，所附权利要求概括了本发明的范围，在本发明构思的引导下， 本领域的技术人员应意识到，对本发明的各实施例方案所进行的一定的改变， 都将被本发明的权利要求书的精神和范围所覆盖。
权利要求
1.一种检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物的荧光探针，其特征是该检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物的荧光探针具有以下结构式(I)中的R1或R2分别或者同时为烷基、取代烷基或芳基；R3为氢、烷基、烷氧基、胺基或芳基；R4为氢、烷基、烷氧基、芳基、硝基或卤素；R5为氢、烷基、烷氧基、胺基、芳基、硝基或卤素；X为硝酸根、硫酸根、磷酸根、高氯酸根、硫氰酸根或卤素。
2.根据权利要求1所述的检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物荧 光探针，其特征是所述的R,、 R2、 R3、 R4或Rs中的烷基为1至50个碳 原子的烷基或3至50个碳原子的环垸基；所述的&或R2中的取代烷基为芳基取代的1至50个碳原子的垸基、 "-羟基取代的1至50个碳原子的垸基、"-羧基取代的1至50个碳原子的烷 基或"-酯基取代的1至50个碳原子的烷基；所述的R,、 R2、 R3、 R4或R5中的芳基为邻、对、间位1至50个碳原 子的烷基苯基，邻、对、间位卤代苯基，邻、对、间位1至50个碳原子取代 或未取代的烷氧基苯基或邻、对、间位胺基苯基；所述的R3、 R4或R5中的烷氧基为l至50个碳原子的烷氧基；所述的R3或R5中的胺基选自1至50个碳原子的垸基胺基；或选自O)-羟基垸基胺基，co-羧基烷基胺基，"-酯基垸基胺基，芳基胺基，二烷基胺基， 二 ("-羟基烷基)胺基，二 ("-羧基垸基)胺基，二 (co-酯基烷基)胺基，二芳胺基及季铵盐基中的一种；其中烷基是1至12个碳原子； 所述的R4、 Rs或X中的卤素为氟、氯、溴或碘。
3. 根据权利要求2所述的检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物荧 光探针，其特征是所述的Ri、 R2中的1至50个碳原子的垸基分别或者同时 选自甲基，乙基，丙基，烯丙基，异丙基，丁基，异丁基，戊基，异戊基， 己基，2—甲基戊基，庚基，2—甲基己基，辛基，2—甲基庚基，壬基，2— 甲基辛基，癸基，2—甲基壬基，十一烷基，十二垸基，十三垸基，十四烷基 及十五烷基中的一种；所述的R3、 R4或R5中的1至50个碳原子的烷基选自甲基，乙基，丙基， 异丙基，丁基，异丁基，叔丁基，戊基，异戊基，新戊基，叔戊基及己基中 的一种；所述的Ri、R2中的3至50个碳原子的环烷基分别或者同时选自环丙烷基， 环丁垸基，环戊垸基，环己垸基及环庚烷基中的一种；所述的Rs、 R4或Rs中的3至50个碳原子的环烷基选自环丙烷基，环丁 垸基，环戊垸基，环己烷基及环庚烷基中的一种。
4. 根据权利要求2所述的检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物荧 光探针，其特征是所述的&、 R2中的芳基取代的1至50个碳原子的烷基分 别或者同时选自芳基甲基，芳基乙基，芳基丙基，芳基烯丙基，芳基异丙基， 芳基丁基，芳基异丁基，芳基戊基，芳基异戊基，芳基己基，2—甲基芳基戊 基，芳基庚基，2—甲基芳基己基，芳基辛基，芳基2—甲基庚基，芳基壬基， 2—甲基芳基辛基，芳基癸基，2—甲基芳基壬基，芳基十一烷基，芳基十二 烷基，芳基十三烷基，芳基十四垸基及芳基十五烷基中的一种；所述的R,、 R2中的"-羟基取代的1至50个碳原子的垸基分别或者同时 选自^-羟基甲基，"-羟基乙基，"-羟基丙基，"-羟基异丙基，co-羟基丁基， "-羟基异丁基，co-羟基戊基，"-羟基异戊基，"-羟基己基，"-羟基-2—甲 基戊基，co-羟基庚基，co-羟基-2—甲基己基，co-羟基辛基，"-羟基庚基， "-羟基壬基，"-羟基-2—甲基辛基，"-羟基癸基，"-羟基-2—"-羟基甲基 壬基，w-羟基十一垸基，co-羟基十二烷基，co-羟基十三烷基，"-羟基十四垸基及"-羟基十五烷基中的一种；所述的Ri、 R2中的"-羧基取代的1至50个碳原子的垸基分别或者同时选自CO-羧基甲基，G)-羧基乙基，"-羧基丙基，"-羧基异丙基，G)-羧基丁基，"-羧基异丁基，co-羧基戊基，"-羧基异戊基，"-羧基己基，co-羧基-2—甲 基戊基，"-羧基庚基，"-羧基-2—甲基己基，"-羧基辛基，co-羧基庚基，"-羧基壬基，"-羧基-2—甲基辛基，"-羧基癸基，co-羧基-2—"-羧基甲基 壬基，co-羧基十一烷基，"-羧基十二烷基，"-羧基十三垸基，"-羧基十四 烷基及"-羧基十五烷基中的一种；所述的R,、 R2中的"-酯基取代的1至50个碳原子的垸基分别或者同时 选自co-酯基甲基，co-酯基乙基，co-酯基丙基，"-酯基异丙基，co-酯基丁基，"-酯基异丁基，"-酯基戊基，co-酯基异戊基，"-酯基己基，"-酯基-2—甲 基戊基，w-酯基庚基，"-酯基-2_甲基己基，co-酯基辛基，"-酯基庚基， "-酯基壬基，"-酯基-2—甲基辛基，"-酯基癸基，"-酯基-2—"-酯基甲基 壬基，"-酯基十一烷基，"-酯基十二烷基，"-酯基十三烷基，"-酯基十四 烷基及"-酯基十五烷基中的一种。
5.根据权利要求2所述的检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物荧 光探针，其特征是所述的&、 R2中的邻、对、间位1至50个碳原子的垸基 苯基分别或者同时是邻、对、间位取代甲基节基，邻、对、间位取代乙基苄 基，邻、对、间位取代丙基苄基或邻、对、间位取代异丙基苄基；所述的&、 R2中的邻、对、间位卤代苯基分别或者同时是邻、对、间位 氟代苄基，邻、对、间位氯代苄基，邻、对、间位溴代苄基或邻、对、间位 碘代苄基；所述的R,、 R2中的邻、对、间位1至50个碳原子取代的烷氧基苯基分别 或者同时是邻、对、间位取代甲氧苄基，邻、对、间位取代乙氧基苄基或邻、 对、间位取代丙氧基苄基；所述的R,、 R2中的邻、对、间位胺基苯基分别或者同时是邻、对、间位 取代甲胺基苄基，邻、对、间位取代乙胺基苄基或邻、对、间位取代丙胺基 苄基；所述的R3中的邻、对、间位1至50个碳原子的垸基苯基选自邻、对、间 位甲基苯基，邻、对、间位乙基苯基，邻、对、间位丙基苯基及邻、对、间 位异丙基苯基中的一种；所述的R3中的邻、对、间位卤代苯基选自邻、对、间位氟代苯基，邻、 对、间位氯代苯基，邻、对、间位溴代苯基及邻、对、间位碘代苯基中的一 种；所述的R3中的邻、对、间位1至50个碳原子取代的烷氧基苯基选自邻、 对、间位甲氧基苯基，邻、对、间位乙氧基苯基及邻、对、间位丙氧基苯基 中的一种；所述的R3中的邻、对、间位胺基苯基选自邻、对、间位甲胺基苯基，邻、对、间位乙胺基苯基及邻、对、间位丙胺基苯基中的一种；所述的R4中邻、对、间位1至50个碳原子的烷基苯基是邻、对、间位甲基苯基，邻、对、间位乙基苯基或邻、对、间位丙基苯基中的一种；所述的R4中邻、对、间位卤代苯基选自邻、对、间位氟代苯基，邻、对、间位氯代苯基，邻、对、间位溴代苯基及邻、对、间位碘代苯基中的一种； 所述的R4中邻、对、间位1至50个碳原子取代的烷氧基苯基选自邻、对、间位甲氧基苯基，邻、对、间位乙氧基苯基及邻、对、间位丙氧基苯基中的一种；所述的R"中邻、对、间位胺基苯基选自邻、对、间位甲胺基苯基，邻、 对、间位乙胺基苯基及邻、对、间位丙胺基苯基中的一种；所述的R5中的邻、对、间位1至50个碳原子的烷基苯基选自邻、对、 间位甲基苯基，邻、对、间位乙基苯基及邻、对、间位丙基苯基中的一种；所述的Rs中的邻、对、间位卤代苯基选自邻、对、间位氟代苯基，邻、 对、间位氯代苯基，邻、对、间位溴代苯基及邻、对、间位碘代苯基中的一 种；所述的Rs中的邻、对、间位1至50个碳原子取代的烷氧基苯基选自邻、 对、间位异丙基苯基，邻、对、间位甲氧基苯基，邻、对、间位乙氧基苯基 或及邻、对、间位丙氧基苯基中的一种；所述的Rs中的邻、对、间位胺基苯基选自邻、对、间位甲胺基苯基，邻、 对、间位乙胺基苯基或邻、对、间位丙胺基苯基中的一种。
6. 根据权利要求2所述的检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物荧 光探针，其特征是所述的R3或R5中1至50个碳原子的垸氧基选自甲氧基， 乙氧基，丙氧基，异丙氧基，丁氧基，异丁氧基，仲丁氧基，叔丁氧基，戊 氧基，异戊氧基，新戊氧基，叔戊氧基，己氧基，2-甲基戊氧基及苄氧基中的 一种；所述的R4中l至50个碳原子的烷氧基选自甲氧基，乙氧基，丙氧基，异 丙氧基，丁氧基，异丁氧基，仲丁氧基，叔丁氧基，戊氧基，异戊氧基，新 戊氧基，叔戊氧基，己氧基及苄氧基中的一种。
7. 根据权利要求2所述的检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物荧 光探针，其特征是所述的R3或Rs中的1至50个碳原子的烷基胺基选自甲 胺基，乙胺基，丁胺基，戊胺基，异戊胺基，新戊胺基，叔戊胺基及己胺基 中的一种；所述的R3或R5中的"-羟基垸基胺基选自2—羟基乙基胺基，3—羟基丙基胺基，4^5基丁基胺基，5^5基戊基胺基及6—羟基己基胺基中的一种； 所述的R3或R5中的co -羧基垸基胺基选自2—羧基乙基胺基，3—羧基丙 基胺基，4—羧基丁基胺基，5—羧基戊基胺基及6—羧基己基胺基中的一种； 所述的R3或R5中的"-酯基烷基胺基选自2—酯基乙基胺基，3—酯基丙 基胺基，4—酯基丁基胺基，5—酯基戊基胺基及6—酯基己基胺基中的一种； 所述的R3或R5中的芳基胺基选自邻、对、间位甲基苄基胺基，邻、对、 间位乙基苄基胺基，邻、对、间位丙基苄基胺基，邻、对、间位异丙基苄基 胺基，邻、对、间位甲氧基苄基胺基，邻、对、间位乙氧基苄基胺基，令P、 对、间位丙氧基苄基胺基，邻、对、间位氟代苄基胺基，邻、对、间位氯代 苄基胺基，邻、对、间位溴代苄基胺基及邻、对、间位碘代苄基胺基中的一 种；所述的R3或R5中的二烷基胺基选自二甲胺基，二乙胺基，二丙胺基，二丁胺基，二戊胺基，二异戊胺基，二新戊胺基，二叔戊胺基及二己胺基中的 一种；所述的R3或Rs中的二 ("-羟基烷基)胺基选自二 (2—羟基乙基)胺基， 二 (3—羟基丙基)胺基，二 (4—羟基丁基)胺基，二 (5—羟基戊基)胺基 及二 (6—羟基己基)胺基中的一种；所述的R3或R5中的二 ("-羧基烷基)胺基选自二 (2—羧基乙基)胺基， 二 (3—羧基丙基)胺基，二 (4一羧基丁基)胺基，二 (5—羧基戊基)胺基 及二 (6—羧基己基)胺基的一种；所述的R3或Rs中的二 ("-酯基烷基)胺基选自二 (2—酯基乙基)胺基， 二 (3—酯基丙基)胺基，二 (4一酯基丁基)胺基，二 (5—酯基戊基)胺基 及二 (6—酯基己基)胺基中的一种；所述的R3或Rs中的二芳胺基选自二 (邻、对、间位甲基节基)胺基，二 (邻、对、间位乙基苄基)胺基，二 (邻、对、间位丙基苄基)胺基，二 (邻、 对、间位异丙基苄基)胺基，二 (邻、对、间位甲氧基苄基)胺基，二 (邻、 对、间位乙氧基苄基)胺基，二 (邻、对、间位丙氧基苄基)胺基，二 (邻、 对、间位氟代苄基)胺基，二 (邻、对、间位氯代苄基)胺基，二 (邻、对、 间位溴代苄基)胺基及二 (邻、对、间位碘代苄基)胺基中的一种。
8.—种用于合成权利要求1 7任一项所述的检测谷胱甘肽还原酶及生物 活性巯基化合物的荧光探针的探针前体具有以下结构<image>image see original document page 7</image>式(n)中的^或R2分别或者同时为垸基、取代烷基或芳基；R3为氢、烷基、烷氧基、胺基或芳基；R4为氢、垸基、烷氧基、芳基、硝基或卤素；R5 为氢、烷基、垸氧基、胺基、芳基、硝基或卤素。
9. 根据权利要求8所述的检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物荧 光探针，其特征是所述的R,、 R2、 R3、 R4或Rs中的烷基为l至50个碳 原子的烷基或3至50个碳原子的环烷基；所述的R,或R2中的取代垸基为芳基取代的1至50个碳原子的烷基、 "-羟基取代的1至50个碳原子的烷基、co-羧基取代的1至50个碳原子的垸 基或"-酯基取代的1至50个碳原子的烷基；所述的R4、 R2、 R3、 R4或Rs中的芳基为邻、对、间位1至50个碳原 子的烷基苯基，邻、对、间位卤代苯基，邻、对、间位1至50个碳原子取代 或未取代的烷氧基苯基或邻、对、间位胺基苯基；所述的R3、 R4或Rs中的烷氧基为l至50个碳原子的垸氧基；所述的R3或Rs中的胺基选自1至50个碳原子的烷基胺基，或选自"-羟基烷基胺基，w-羧基垸基胺基，co-酯基烷基胺基，芳基胺基，二烷基胺基， 二 ("-羟基烷基)胺基，二 ("-羧基垸基)胺基，二 ("-酯基烷基)胺基，二芳胺基及季铵盐基中的一种；其中烷基是1至12个碳原子； 所述的R4或Rs中的卤素为氟、氯、溴或碘。
10. 根据权利要求8所述的检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物荧 光探针，其特征是所述的R,、 R2中的1至50个碳原子的烷基分别或者同时选自甲基，乙基，丙基，烯丙基，异丙基，丁基，异丁基，戊基，异戊基，己基，2—甲基戊基，庚基，2—甲基己基，辛基，2—甲基庚基，壬基，2— 甲基辛基，癸基，2—甲基壬基，十一垸基，十二烷基，十三垸基，十四烷基及十五垸基中的一种；所述的R3、 R4或Rs中的l至50个碳原子的烷基选自甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，叔丁基，戊基，异戊基，新戊基，叔戊基及己基中的一种；所述的&、R2中的3至50个碳原子的环垸基分别或者同时选自环丙烷基，环丁垸基，环戊垸基，环己烷基及环庚烷基中的一种；所述的R3、 R4或R5中的3至50个碳原子的环烷基选自环丙垸基，环丁烷基，环戊烷基，环己烷基及环庚烷基中的一种。
11.根据权利要求8所述的检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物荧光探针，其特征是所述的&、 R2中的芳基取代的1至50个碳原子的烷基分别或者同时选自芳基甲基，芳基乙基，芳基丙基，芳基烯丙基，芳基异丙基，芳基丁基，芳基异丁基，芳基戊基，芳基异戊基，芳基己基，2—甲基芳基戊基，芳基庚基，2—甲基芳基己基，芳基辛基，芳基2—甲基庚基，芳基壬基，2—甲基芳基辛基，芳基癸基，2—甲基芳基壬基，芳基十一烷基，芳基十二烷基，芳基十三烷基，芳基十四烷基及芳基十五垸基中的一种；所述的Ri、 R2中的"-羟基取代的1至50个碳原子的垸基分别或者同时选自"-羟基甲基，"-羟基乙基，co-羟基丙基，"-羟基异丙基，"-羟基丁基，"-羟基异丁基，"-羟基戊基，"-羟基异戊基，co-羟基己基，"-羟基-2_甲基戊基，"-羟基庚基，"-羟基-2—甲基己基，G)-羟基辛基，co-羟基庚基，"-羟基壬基，"-羟基-2—甲基辛基，"-羟基癸基，"-羟基-2—co-羟基甲基壬基，"-羟基十一烷基，co-羟基十二烷基，"-羟基十三烷基，"-羟基十四垸基及"-羟基十五烷基中的一种；所述的Rp R2中的"-羧基取代的1至50个碳原子的烷基分别或者同时选自"-羧基甲基，"-羧基乙基，"-羧基丙基，co-羧基异丙基，"-羧基丁基,"-羧基异丁基，"-羧基戊基，"-羧基异戊基，"-羧基己基，co-羧基-2—甲基戊基，"-羧基庚基，"-羧基-2—甲基己基，co-羧基辛基，co-羧基庚基，"-羧基壬基，"-羧基-2—甲基辛基，co-羧基癸基，"-羧基-2—o)-羧基甲基壬基，"-羧基十一垸基，"-羧基十二烷基，"-羧基十三垸基，"-羧基十四烷基及"-羧基十五烷基中的一种；所述的R卜R2中的co-酯基取代的1至50个碳原子的垸基分别或者同时选自"-酯基甲基，"-酯基乙基，"-酯基丙基，"-酯基异丙基，"-酯基丁基，"-酯基异丁基，"-酯基戊基，"-酯基异戊基，"-酯基己基，"-酯基-2—甲基戊基，"-酯基庚基 酯基-2—甲基己基，"-酯基辛基，"-酯基庚基，"-酯基壬基，"-酯基-2—甲基辛基，"-酯基癸基，"-酯基-2—o)-酯基甲基壬基，"-酯基十一烷基，"-酯基十二烷基，"-酯基十三烷基，w-酯基十四垸基及co -酯基十五烷基中的一种。
12.根据权利要求8所述的检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物荧光探针，其特征是所述的&、 R2中的邻、对、间位1至50个碳原子的垸基苯基分别或者同时是邻、对、间位取代甲基苄基，邻、对、间位取代乙基节基，邻、对、间位取代丙基苄基或邻、对、间位取代异丙基苄基；所述的Ri、 R2中的邻、对、间位卤代苯基分别或者同时是邻、对、间位氟代苄基，邻、对、间位氯代苄基，邻、对、间位溴代苄基或邻、对、间位碘代苄基；所述的R,、 R2中的邻、对、间位1至50个碳原子取代的烷氧基苯基分别或者同时是邻、对、间位取代甲氧苄基，邻、对、间位取代乙氧基苄基或邻、对、间位取代丙氧基苄基；所述的R,、 R2中的邻、对、间位胺基苯基分别或者同时是邻、对、间位取代甲胺基苄基，邻、对、间位取代乙胺基苄基或邻、对、间位取代丙胺基苄基；所述的R3中的邻、对、间位1至50个碳原子的烷基苯基选自邻、对、间位甲基苯基，邻、对、间位乙基苯基，邻、对、间位丙基苯基及邻、对、间位异丙基苯基中的一种；所述的R3中的邻、对、间位卤代苯基选自邻、对、间位氟代苯基，邻、对、间位氯代苯基，邻、对、间位溴代苯基及邻、对、间位碘代苯基中的一种；所述的R3中的邻、对、间位1至50个碳原子取代的垸氧基苯基选自邻、对、间位甲氧基苯基，邻、对、间位乙氧基苯基及邻、对、间位丙氧基苯基中的一种；所述的R3中的邻、对、间位胺基苯基选自邻、对、间位甲胺基苯基，邻、对、间位乙胺基苯基及邻、对、间位丙胺基苯基中的一种；所述的R4中邻、对、间位1至50个碳原子的烷基苯基是邻、对、间位甲基苯基，邻、对、间位乙基苯基或邻、对、间位丙基苯基中的一种；所述的R4中邻、对、间位卤代苯基选自邻、对、间位氟代苯基，邻、对、间位氯代苯基，邻、对、间位溴代苯基及邻、对、间位碘代苯基中的一种；所述的R4中邻、对、间位1至50个碳原子取代的烷氧基苯基选自邻、对、间位甲氧基苯基，邻、对、间位乙氧基苯基及邻、对、间位丙氧基苯基中的一种；所述的W中邻、对、间位胺基苯基选自邻、对、间位甲胺基苯基，邻、对、间位乙胺基苯基及邻、对、间位丙胺基苯基中的一种；所述的R5中的邻、对、间位1至50个碳原子的垸基苯基选自邻、对、间位甲基苯基，邻、对、间位乙基苯基及邻、对、间位丙基苯基中的一种；所述的Rs中的邻、对、间位卤代苯基选自邻、对、间位氟代苯基，邻、对、间位氯代苯基，邻、对、间位溴代苯基及邻、对、间位碘代苯基中的一种；所述的R5中的邻、对、间位1至50个碳原子取代的烷氧基苯基选自邻、对、间位异丙基苯基，邻、对、间位甲氧基苯基，邻、对、间位乙氧基苯基或及邻、对、间位丙氧基苯基中的一种；所述的Rs中的邻、对、间位胺基苯基选自邻、对、间位甲胺基苯基，令P、对、间位乙胺基苯基或邻、对、间位丙胺基苯基中的一种。
13. 根据权利要求8所述的检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物荧光探针，其特征是所述的R3或R5中1至50个碳原子的垸氧基选自甲氧基，乙氧基，丙氧基，异丙氧基，丁氧基，异丁氧基，仲丁氧基，叔丁氧基，戊氧基，异戊氧基，新戊氧基，叔戊氧基，己氧基，2-甲基戊氧基及苄氧基中的一种；所述的R4中l至50个碳原子的烷氧基选自甲氧基，乙氧基，丙氧基，异丙氧基，丁氧基，异丁氧基，仲丁氧基，叔丁氧基，戊氧基，异戊氧基，新戊氧基，叔戊氧基，己氧基及苄氧基中的一种。
14. 根据权利要求8所述的检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物荧光探针，其特征是所述的R3或Rs中的1至50个碳原子的烷基胺基选自甲胺基，乙胺基，丁胺基，戊胺基，异戊胺基，新戊胺基，叔戊胺基及己胺基中的一种；所述的R3或R5中的"-羟基垸基胺基选自2—羟基乙基胺基，3—羟基丙基胺基，4~^5基丁基胺基，5^5基戊基胺基及6—羟基己基胺基中的一种；所述的R3或R5中的"-羧基烷基胺基选自2—羧基乙基胺基，3—羧基丙基胺基，4—羧基丁基胺基，5—羧基戊基胺基及6~羧基己基胺基中的一种；所述的R3或R5中的"-酯基烷基胺基选自2—酯基乙基胺基，3—酯基丙基胺基，4一酯基丁基胺基，5—酯基戊基胺基及6~酯基己基胺基中的一种；所述的R3或R5中的芳基胺基选自邻、对、间位甲基苄基胺基，邻、对、间位乙基苄基胺基，邻、对、间位丙基苄基胺基，邻、对、间位异丙基苄基胺基，邻、对、间位甲氧基苄基胺基，邻、对、间位乙氧基苄基胺基，令P、对、间位丙氧基苄基胺基，邻、对、间位氟代苄基胺基，邻、对、间位氯代苄基胺基，邻、对、间位溴代苄基胺基及邻、对、间位碘代苄基胺基中的一种；所述的R3或R5中的二烷基胺基选自二甲胺基，二乙胺基，二丙胺基，二丁胺基，二戊胺基，二异戊胺基，二新戊胺基，二叔戊胺基及二己胺基中的一种；所述的R3或Rs中的二 ("-羟基烷基)胺基选自二 (2—羟基乙基)胺基，二 (3—羟基丙基)胺基，二 (4~|5基丁基)胺基，二 (5—羟基戊基)胺基及二 (6—羟基己基)胺基中的一种；所述的R3或Rs中的二 ("-羧基烷基)胺基选自二 (2—羧基乙基)胺基，二 (3—羧基丙基)胺基，二 (44基丁基)胺基，二 (5—羧基戊基)胺基及二 (6—羧基己基)胺基的一种；所述的R3或Rs中的二 ("-酯基烷基)胺基选自二 (2—酯基乙基)胺基，二 (3—酯基丙基)胺基，二 (4—酯基丁基)胺基，二 (5—酯基戊基)胺基及二 (6—酯基己基)胺基中的一种；所述的R3或R5中的二芳胺基选自二 (邻、对、间位甲基苄基)胺基，二(邻、对、间位乙基苄基)胺基，二 (邻、对、间位丙基苄基)胺基，二 (邻、对、间位异丙基苄基)胺基，二 (邻、对、间位甲氧基苄基)胺基，二 (邻、对、间位乙氧基苄基)胺基，二 (邻、对、间位丙氧基苄基)胺基，二 (邻、对、间位氟代苄基)胺基，二 (邻、对、间位氯代苄基)胺基，二 (邻、对、间位溴代苄基)胺基及二 (邻、对、间位碘代苄基)胺基中的一种。
15.—种根据权利要求1 7任一项所述的检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物的荧光探针的合成方法，其特征是，该方法包括以下步骤1) 将带有R,， R2， R3和R4取代基的香豆素3—羰基化合物溶于干燥的有机溶剂中，然后在室温或回流温度下缓慢滴加带有R5取代基的邻巯基苯胺，其中带有Rn R2， R3和R4取代基的香豆素3—羰基化合物与带有Rs取代基的邻巯基苯胺的摩尔比是l: 1 5;搅拌反应，得到固体沉淀，过滤除去有机溶剂，真空干燥所得固体后得到式(II)的探针前体；2) 将步骤1)得到的探针前体溶于干燥的有机溶剂中，在冰浴条件下，缓慢滴加HgX2，其中探针前体与HgX2的摩尔比是l: 1 2 ;室温搅拌反应，得到固体沉淀，过滤后真空干燥固体，然后用有机溶剂扩散结晶，得到式(I)的针状晶体，即所述荧光探针；其中式(n)的探针前体具有以下结构<image>image see original document page 12</image>所述的取代基R,、 R2、 R3、 R4及R5的定义同权利要求8 14任一项所述;式(I)的荧光探针具有以下结构:<image>image see original document page 12</image>所述的取代基Rt、 R2、 R3、 R4、 R5及X的定义同权利要求1 7任一项所述。
16.—种根据权利要求1 7任一项所述的检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物的荧光探针的用途，其特征是所述的检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物的荧光探针用于生物体系中谷胱甘肽还原酶和生物活性巯基化合物的检测，生物活细胞和活组织内的谷胱甘肽还原酶和生物活性巯基化合物的分析检测和荧光成像检测，以及临床医学上病变组织中谷胱甘肽还原酶和生物活性巯基化合物的检测。
全文摘要
本发明涉及检测谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物的荧光探针及其合成方法和用途。将带有R₁，R₂，R₃和R₄取代基的香豆素3-羰基化合物溶于干燥的有机溶剂中，在室温或回流温度下缓慢滴加带有R₅取代基的邻巯基苯胺；搅拌、过滤除去有机溶剂，真空干燥所得固体后得到探针前体；将探针前体溶于干燥的有机溶剂中，在冰浴条件下，缓慢滴加HgX₂；搅拌，得到红色固体沉淀，过滤后真空干燥红色固体，然后用有机溶剂扩散结晶，得到式(I)的红色针状晶体，即所述荧光探针。该荧光探针对谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物具有良好的选择性，适用于谷胱甘肽还原酶及生物活性巯基化合物快速检测。
文档编号C07F3/14GK101591530SQ20081011299
公开日2009年12月2日 申请日期2008年5月27日 优先权日2008年5月27日
发明者刘卫敏, 张洪艳, 汪鹏飞, 盛瑞隆 申请人:中国科学院理化技术研究所