专利名称：：乙型脑炎病毒e蛋白中和性b细胞抗原表位多肽及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及抗原表位多肽,尤其涉及乙型脑炎病毒JEVE蛋白中和性B细胞抗原表位多肽，本发明还涉及该抗原表位多肽在防治和诊断乙型脑炎病毒中的应用，属于分子免疫学领域。
背景技术：
：流行性乙型脑炎是由.乙型脑炎病毒(JapaneseEncephalitisvirus,JEV)引起的一种重要蚊媒性人兽共患传染病。该病毒首先于1953年在日本从患者脑组织中分离获得，因此称日本脑炎病毒，所致疾病在日本称日本乙型脑炎。在我国最早于1940年分离此病毒，为了与甲型脑炎相区别，定名为流行性乙型脑炎，简称乙脑。在世界范围内每年有30，000-50,000例乙脑病例，约25%-30%死亡，50%导致永久性中枢神经系统后遗症。我国近年每年的乙脑病例大于5000例，死亡200例以上。对于流行性乙型脑炎病毒多种动物易感，但除人、马和猪外通常不呈现临床症状。对人主要引起中枢神经系统的急性感染，人感染临床上以高热、意识障碍、抽搐、呼吸衰竭及脑膜刺激征为特征。母猪感染可引起流产、产死胎或木乃伊胎，公猪感染导致睾丸肿大影响繁殖性能为特征，少数猪只感染可能呈现发热和神经症状，而其他猪则大多数不呈显症状。给养猪业造成巨大的经济损失。马属动物易感染，少数引起脑炎与神经症状，马是终末宿主。蚊是JEV的主要传播媒介，猪是该病毒在自然界中最重要的贮存与增殖宿主。乙型脑炎病毒主要在亚洲流行，而最近发现在南半球也有报道，这说明流行性乙型脑炎可能在世界范围内威胁着人类健康。乙型脑炎病毒JEV属黄病毒科，黄病毒属，为单链正链RNA病毒。基因组约llkb，包含一个大的开放阅读框架(ORF),两端是5，端和3，端非编码区(UTR)。基因组5，端有帽子结构，但在3'端没有poly(A)尾。ORF编码含3432个氨基酸的前体蛋白，在病毒和宿主细胞蛋白酶的作用下加工为IO个成熟蛋白，包含3个结构蛋白(C，prM，E),7个非结构蛋白(NS1,NS2A，NS2B,NS3，NS4A,NS4B，NS5)。病毒粒子呈球形，直径约30nm，有嚢膜。JEV只有一个血清型，在抗原性上与西罗病毒、墨罗河谷脑炎病毒、圣路易脑炎病毒等属同一血清群，存在抗原交叉反应。病毒嚢膜糖蛋白具有血凝特性，能凝集鹅、鴒、雏鸡等动物红细胞。病毒对热抵抗力弱，56。C30分钟或IOO'C2分钟即可灭活，但对低温和干燥的抵抗力很强。乙醚、1:1000的去氧胆酸钠以及常用消毒剂均可灭活病毒，在酸性条件下不稳定，适宜pH8.5-9.0。采用疫苗进行预防接种是控制该病流行的有效措施。对乙型脑炎病毒抗原表位的研究是开发有效基因工程疫苗以及研究基于抗原表位的诊断检测试剂的理论基础。E蛋白是乙脑病毒粒子表面的一种重要的结构蛋白，是重要的免疫保护性抗原。在保护性抗原中具有中和作用的B细胞抗原表位在刺激机体产生中和性抗体中起重要作用。正确而详细地鉴定抗原表位对疾病的诊断、设计无毒副作用的人工疫苗以及免疫治疗剂等有重要的意义。
发明内容本发明的目的之一提供乙型脑炎病毒JEVE蛋白中和性B细胞抗原表位多肽。本发明的目的之二是将所述的乙型脑炎病毒正VE蛋白中和性B细胞抗原表位多肽应用于治疗或预防乙型脑炎病毒，或者将其用于制备成i貪断或检测乙型脑炎病毒的试剂。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的一种乙型脑炎病毒JEVE蛋白中和性B细胞抗原表位多肽，其氨基酸序列为SEQIDNO:1所示(77H-Thr-Gly-Glu-Ala-His-Asn-Glu-Lys-OH84)。通过试验进一步发现，将SEQIDNO:1所示的氨基酸序列中第一位氨基酸残基Thr替换为Met后，所得到的氨基酸序列(77H-Met-Gly-Glu-Ala-His-Asn-Glu-Lys-OH84)与SEQIDNO:1具有同样的活性。其中，可以对所述的乙型脑炎病毒JEVE蛋白中和性B细胞抗原表位的N端或C端进行化学修饰。所述的化学修饰为多肽链N端的自然氨基化或乙酰化，或C端的自然羧基化或酰胺化。本发明中所述的乙型脑炎病毒JEVE蛋白中和性B细胞抗原表位多肽可以通过固相多肽合成方法合成得到，也可以通过基因工程技术制备得到，这些都为本领域人员所通晓。本发明乙型脑炎病毒JEVE蛋白中和性B细胞抗原表位或其连接物可用于制备免疫原，或将其免疫动物以产生免疫保护。也可将所述的乙型脑炎病毒JEVE蛋白中和性B细胞抗原表位或其连接物制备成检测抗乙型脑炎病毒JEV抗体或抗乙型脑炎病毒JEV多肽抗体的试剂。将本发明所述的表位多肽制备成免疫原或疫苗，至少包括所述的一个或全部抗原表位，这些多肽通过自身连接、相互连接或与载体连接，并辅以T细胞抗原表位，包括Thl和/或Th2表位多肽。这些T细胞抗原表位可以来源于JEV病毒蛋白或其它动物蛋白中具有刺激机体细胞免疫活性的多肽序列。检测乙型脑炎病毒JEV可以针对E蛋白抗原表位的单克隆抗体或针对抗原表位多肽的多克隆抗体，检测方法可以包括间接ELISA、双抗体夹心ELISA、直接免疫荧光技术、间接免疫荧光技术，快速检测试纸条免疫膜层析技术等。检测乙型脑炎病毒JEV抗体，包括野毒感染产生抗体，疫苗免疫产生抗体，母源抗体，抗JEV单克隆抗体等。检测方法可以包括间接ELISA、双抗体夹心ELISA,快速检测试纸条免疫膜层析技术等。蛋白质抗原B细胞抗原表位鉴定的方法有多种，如基因工程定点突变表达抗原蛋白分析法、噬菌体随机肽库筛选技术、合成多肽检测技术等。本项发明在鉴定抗原表位中主要采用的是基因工程技术多肽融合重叠(overlapping)表达JEVE蛋白，体外免疫反应检测多肽融合蛋白组与JEV抗血清的结合性鉴定抗原表位序列，进一步缩短与突变表达表位融合蛋白，鉴定抗原表位的序列结构；再应用合成多肽技术验证表位的正确性；用表位融合蛋白抗原免疫动物制备表位特异性单因子血清，分才斤抗原表4立功肯t。本发明的有益效果如下1.将本发明的乙型脑炎病毒JEVE蛋白中和性B细胞抗原表位多肽作为免疫原或疫苗免疫动物才几体后能够产生针对JEV的中和抗体，并能够在体内或体外中和JEV,阻止病毒感染动物机体。2.本发明的乙型脑炎病毒E蛋白中和性B细胞抗原表位多肽与载体连接或自身连接或相互连接，能够免疫动物，在免疫动物后产生的抗多肽抗体或抗乙型脑炎病毒抗体能够在体内外中和乙型脑炎病毒正v并产生免疫保护。3.本发明的乙型脑炎病毒E蛋白中和性B细胞抗原表位或其连接物在免疫动物是产生抗多肽或抗正V抗体能够检测JEV病毒或其多肽。4.本发明的乙型脑炎病毒E蛋白中和性B细胞抗原表位或其连接物能够检测乙型脑炎病毒JEV抗体或抗乙型脑炎病毒JEV多肽抗体。图1为乙型脑炎表位多肽序列与同一血清群其它黄病毒氨基酸序列的同源性比较。图2为表位多肽SEQNO:l和SEQNO:2以及其它突变多肽与GST融合表达物与JEVE蛋白单克隆抗体4企测结果。图中从左至右依次为M，蛋白质分子量标准；1，GST;2,GST-TGEAHNEK;3,GST-TGEAHNTK;4,GST-TGESHNTK;5,GST-MGEAHNEK;6,GST-MGEAHNDK;7,GST-TGEAHNPK。图3为本发明表位多肽抗体体外中和乙型脑炎病毒实验结果。1,未加血清对照；2,抗表位多肽抗体；3，JEV疫苗免疫阳性血清；4,阴性血清作用结果。具体实施方式以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的范围。实施例1重叠(overlapping)多肽融合表达系列JEVE蛋白抗原多肽片段并进行间接ELISA筛选根据JEVE蛋白列，设计一系列多肽，这些多肽相互重叠，且覆盖JEVE蛋白全长。根据每一条多肽M酸序列，设计合成一对DNA链，将DNA链插入表达载体与GST进行融合表达。融合表达的系列重组蛋白与JEV中和性单克隆抗体进行应用性分析，分析JEVE蛋白中和性抗原表位。具体流程如下设计多肽序列—合成编码多肽序列的DNA链—多肽融合表达载体构建—诱导表达—表达融合蛋白亲和层析纯化—表达产物与中和性单克隆抗体免疫反应性检测—分析JEVE蛋白中和性抗原表位。试验结果见表1、表2和表3。表1重叠多肽融合蛋白与JEV中和性单克隆抗体ElELISA反应检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注:包被抗原为多肽与GST融合表达蛋白，多肽序列分别如表中所示多肽序列。OD值为三个重复孔平均OD值。表2截短的表位肽融合蛋白与JEV中和性单克隆抗体ElELISA反应结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注:包被抗原为多肽与GST融合表达蛋白，多肽序列分别如表中所示多肽序列。OD值为三个重复孔平均OD值。表3突变的表位多肽融合蛋白与JEV中和性单克隆抗体E1ELISA反应结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>注:包被抗原为多肽与GST融合表达蛋白，多肽序列分别如表中所示多肽序列。OD值为三个重复孔平均OD值。*:JEV为乙型脑炎病毒，MVEV为墨罗河谷脑炎病毒(Murrayvalleyencephalitisvirus),WNV为西尼罗病毒(WestNilevirus),KUN为昆禁病毒(Kunjinvirus),UV为尤苏它病毒(Usutuvirus)。实施例2乙型脑炎病毒JEVE蛋白中和性B细胞抗原表位的合成根据E蛋白中和性B细胞抗原表位的氨基酸序列，应用固相多肽合成技术，采用自动多肽合成仪或人工多狀合成方法。固相树脂采用Fmoc保护的氨基酸Wang树脂或其它树脂，树脂经DMF溶涨、piperidine胶Fmoc保护后，根据氨基酸序列顺序，加入Fmoc保护的氨基酸，在HBTU存在情况下进行酰化反应。酰化反应完成后经过洗涤，再加入第二位的Fmoc-氨基酸进行酰化反应，并洗涤。如此循环，从多肽序列C末端超起始向N末端，按照顺序合成完整的多肽链。合成完成后，根据组成肽链氨基酸不同选取适当试剂用TFA法裂解肽链与树脂的连接并用冷乙醚沉淀TFA多肽，经脱盐纯化、LC-MS和HPLC分析鉴定后备用。在整个合成过程中，每个氨基酸酰化反应后可以应用Kaiser法或TMBS法测试反应的完成情况。为了便于使表位多肽和载体蛋白连接，在合成多肽时可以在多肽序列的N末端加一个半胱氨酸。根据以上所述的固相多肽合成技术，分别合成了SEQNO:1和SEQNO:2表位多肽。实施例3乙型脑炎病毒JEVE蛋白B细胞抗原表位的化学修饰按照实施例2的方法合成的多肽片段，其N末端为自然氨基修饰，C末端为自然M修饰。N末端乙酰化修饰方法:按照以上介绍的多肽合成至最后一个Fmoc保护氨基酸偶联结束，并进行N末端Fmoc保护基团的去除，然后进行以下操作。取150^1乙酸酐和20|iLEIPEA溶于4.8mlDMF中，充分混合并在水浴中冷却。然后将以上混合液加入多肽合成反应管中反应5min。再依次用5mlDMF和二氯曱烷(DCM)洗2次，每次5min。氮气吹干后按照常规方法进行侧链保护基团的去除、裂解、纯化和鉴定。C末端酰胺化修饰方法C末端酰胺化的多肽合成时应选用树脂为Rink树脂。执行合成程序时应对树脂用DMF溶涨20min,然后从C末端第一位氨基酸开始执行合成程序，同前过Fmoc-wang树脂合成方法。实施例4乙型脑炎JEVE蛋白B细胞抗原表位与载体蛋白KLH和BSA的偶联载体蛋白KLH或BSA4mg溶于0,5ml含5mMEDTA的PBS(pH7.2)緩沖液中，加入l.Omg连接剂Sulfo-SMCC，充分溶解后在室温孵育60min或37。C孵育30min。应用Sephadex.G-25柱或透析方法脱盐纯化Sulfo-SMCC处理的载体蛋白，并用BCA法测定蛋白含量后备用。称取实施例2所合成的表位多肽4mg，加入0.5ml重蒸馏水溶解多肽，然后将溶解后的多肽与Sulfo-SMCC处理的载体蛋白混合，4'C孵育2小时或反应过夜，分装备用。实施例5乙型脑炎病毒JEVE蛋白B细胞抗原表位氧化实现自身的连接含半胱氨酸的多肽可以通过巯基的氧化反应形成自身连接。一般情况下应用DMSO介导的氧化反应实现连接，根据多肽的酸碱性，氧化反应可以在微酸或微碱性条件下进行。微酸性环境下的氧化反应用适当浓度的醋酸溶解多肽，使多肽的浓度在0.5-1.5mM范围内，醋酸的终浓度不超过5%,用,4)2(303调整多肽溶液的pH为6.0左右，加入10-20%的DMSO，25。C反应5-25h，氧化反应的进行程度可以通过HPLC监测。然后，用1%TFA水和乙腈为流动相，制备型反相HPLC纯化氧化性多肽。微碱性环境下的氧化反应用O.OIM磷酸盐緩冲液，pH7.5,溶解多肽至终浓度1.0mM,加入浓度DMSO至终浓度1%，25。C反应过夜，氧化反应的进行程度可以通过HPLC监测。然后用1%TFA水和乙腈为流动相，制备型反相HPLC纯化氧化性多肽。实施例6乙型脑炎病毒JEVE蛋白B细胞抗原表位间接ELISA检测猪抗JEV抗体用JEVE蛋白B细胞抗原表位合成多肽或表位多肽与载体的连接物或表位多肽自身连接物为包被抗原，包被96孔聚苯乙烯酶标板。用pH9.6，O.IM碳酸盐緩冲液稀释抗原至终浓度为5ng/ml，按100^1/孔加入酶标板中，4。C包被过夜。然后用PBST(PBS+0.05%Tween)洗涤酶标板3次；含1%BSA的PBST封闭酶标板，37°C封闭2h,封闭后用洗液PBST洗板3次，立即用于检测或-2CTC存放备用。抗体检测操作程序加入待检测猪血清(定性检测血清100倍稀释，抗体效价检测血清进行倍比稀释，同时设立阳性血清对照与阴性血清对照以及不加血清的空白对照)，37。C孵育lh,PBST洗液洗涤3次，每次3分钟；加入辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG(Goat-anti-pigIgG-HRP),37。C將育lh，PBST洗液洗涤4次，每次3分钟；加入HRP显色底物(TMB显色剂)，室温孵育5-15分钟观察显色反应；充分显色后，加入2M硫酸终止显色反应；用酶标仪测量450nm波长的吸光值；判定结果。判定结果时空白对照及阴性血清孔吸光值小于或等于0.2，阳性血清对照孔吸光值大于0.4时结果有效；计算P/N值=(检测孔OD值-空白对照孔OD值)/(阴性血清OD值-空白对照孔OD值)，P/N值等于或大于2时为阳性；以反应阳性血清的最大稀释倍数为该样品血清的抗体效价。试验结果见表4。表4合成表位多肽SEQIDNO:1检测猪血清结果猪血清血清稀释倍数50100200400800空白对照JEV阳性0.6350.5980.4250.1250.Ill0.049JEV阴性0.1010.0660.0670.0550.057注包4皮抗原为抗原表位SEQIDNO:1合成肽,5ng/ml。该阳性血清效价为200。实施例7乙型脑炎病毒JEVE蛋白B细胞抗原表位间接ELISA检测人抗JEV抗体实施方法同实施例6，待检血清、阴性对照血清和阳性对照血清为人血清；二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG(Goat-antihumanIgG-HRP)。实施例8乙型脑炎病毒JEVE蛋白B细胞抗原表位间接ELISA检测马抗JEV抗体实施方法同实施例6,待检血清、阴性对照血清和阳性对照血清为马血清；二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗马IgG(Goat-antihorseIgG-HRP)。实施例9乙型脑炎病毒JEVE蛋白B细胞抗原表位Dot-ELISA检测猪抗JEV抗JEVE蛋白B细胞抗原表位多肽或表位多肽与载体的连接物为包被抗原，以BSA为对照抗原。在硝酸纤维素膜上定点包被抗原，2pg/点，37°C固定30min,PBST洗涤6次，2%BSA中4。C封闭过夜，PBST洗涤6次后即可用于抗体检测。检测抗体时，将待检测血清样品适当稀释后与抗原包被膜于37。C孵育30min,PBST洗涤6次，加入辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG(Goat-anti-pigIgG-HRP)，37°。孵育lh,PBST洗液洗涤6次；加入AEC或DAB底物显色，室温避光孵育10min观察颜色反应。结果判定时，以包被抗原点呈现棕红色颜色反应，对照抗原点不出.现颜色反应者为阳性。实施例10乙型脑炎病毒JEVE蛋白B细胞抗原表位Dot-ELISA检测人抗JEV抗实施方法同实施例9,待检血清为人血清；二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG(Goat-antihumanIgG-HRP)。实施例11乙型脑炎病毒正VE蛋白B细胞抗原表位Dot-ELISA检测马抗JEV抗实施方法同实施例9,待检血清为马血清；二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗马IgG(Goat-antihorseIgG-HRP)。实施例12乙型脑炎病毒JEVE蛋白B细胞抗原表位免疫原的制备及免疫实验乙型脑炎病毒JEVE蛋白B细胞抗原表位免疫原可以是合成抗原表位多肽，抗原表位多肽自身连接物，抗原表位多肽与载体连接物，抗原表位融合表位蛋白等。首次免疫免疫原用弗氏完全佐剂和抗原乳化，小动物免疫抗原量为100pg每只；二三免时用弗氏不完全佐剂与抗原乳化，小动物免疫抗原量为50-10(Vg每只进4亍免疫。免疫途径可为皮下注射、皮内注射或肌肉注射。各次免疫期间隔两周。加强免疫两次后检测抗体水平。试验结果见表5。表5小鼠抗表位多肽SEQNO:2抗体间接ELISA效价<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>注包被抗原为合成抗原表位多肽SEQNO:2，浓度为5pg/ml。序列表<110〉中国农业科学院哈尔滨兽医研究所<120>乙型脑炎病毒E蛋白B细胞抗原表位多肽及其应用<130>KLPI012<160〉2<170>Patentlnversion3.5<210>1<211>8<212〉PRT<213>JapaneseEncephalitisvirus<400〉1ThrGlyGluAlaHisAsnGluLys15<210>2<211>8<212>PRT<213>JapaneseEncephalitisvirus<400>2MetGlyGluAlaHisAsnGluLys1权利要求1、一种乙型脑炎病毒E蛋白中和性B细胞抗原表位多肽，其特征在于，其氨基酸序列为SEQIDNO1所示。2、一种乙型脑炎病毒E蛋白中和性B细胞抗原表位多肽，其特征在于，其氨基酸序列为SEQIDNO:2所示。3、编码权利要求1或2所述乙型脑炎病毒E蛋白中和性B细胞抗原表位多肽的核苷酸序列。4、根据权利要求1或2中任一项所述的乙型脑炎病毒正VE蛋白中和性B细胞抗原表位多肽，其特征在于所述乙型脑炎病毒JEVE蛋白中和性B细胞抗原表位在N端或C端进行化学修饰。5、才艮据权利要求4所述的乙型脑炎病毒JEVE蛋白中和性B细胞抗原表位多肽，其特征是所述的多肽链N端的化学修饰为N端的自然氨基化或乙酰化；所述的多肽链C端的化学修改为C端的自然羧基化或酰胺化。6、一种预防或治疗乙型脑炎病毒的疫苗组合物，其特征在于含有治疗上有效量的权利要求1或2所述的乙型脑炎病毒E蛋白中和性B细胞抗原表位多肽。7、权利要求1或2所述的乙型脑炎病毒E蛋白中和性B细胞抗原表位多肽在制备预防或治疗乙型脑炎病毒药物中的用途。8、权利要求1或2所述的乙型脑炎病毒E蛋白中和性B细胞抗原表位多肽在制备诊断或检测乙型脑炎病毒试剂中的用途。全文摘要本发明公开了乙型脑炎病毒E蛋白中和性B细胞抗原表位多肽，还公开了该抗原表位多肽在防治和诊断乙型脑炎病毒中的用途，属于分子免疫学领域。本发明所述的抗原表位多肽的氨基酸序列为SEQIDNO1或SEQIDNO2所示。本发明JEVE蛋白中和性B细胞抗原表位多肽作为免疫原或疫苗免疫动物机体后能够产生针对乙型脑炎病毒的中和性抗体，并能够在体内或体外中和乙型脑炎病毒，阻止病毒感染动物机体。将本发明抗原表位多肽与载体连接或自身连接或相互连接，能够免疫动物，在免疫动物后产生的抗多肽抗体或抗乙型脑炎病毒抗体能够在体内外中和乙型脑炎病毒并产生免疫保护。文档编号C07K7/06GK101333246SQ200810126289公开日2008年12月31日申请日期2008年7月30日优先权日2008年7月30日发明者华荣虹,步志高,童光志申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所