用于口腔卫生保健的天然多肽的制作方法

专利名称：用于口腔卫生保健的天然多肽的制作方法
用于口腔卫生保健的天然多肽 优选权的要求
本申请要求2007年1月16日提交的美国临时申请号60/880， 753 的优先权，该申请的^^开内容以其全文通过引用合并入本文。
背景技术：
多年来，研究者一直试图开发可用于抵抗口腔中的感染的化学治 疗剂。早在20世纪40年代中期，随着抗生素的引入，人们开始明白， 虽然这些有力的试剂可能是有效的，但口腔的独特性问题干扰了它们 的用途。随着时间的推移，对口腔中菌斑的产生理解更深。随着理解 的加深，人们开始明白，递送至口腔的试剂需要附着至口腔组织以抵 抗唾液流动和口部咀嚼的力量引起的去除。被广为接受的是，为了使 抗微生物剂在口腔中有效，需要将该试剂在该环境中保持一段时间。 说明该原理的一个实验比较了两个著名的抗微生物剂四环素和青霉素 的功效。经显示当在体外进行检测时，与四环素相比，青霉素是更有 效的试剂。同样，显示当在肉汤培养基中进行抗细菌生长的检测时， 与四环素相比，青霉素在显著更低的浓度上有效地抗口腔细菌(1 ug/ml (对于青霉素)对10-20 ug/ml (对于四环素))。此外，青霉 素是杀菌剂，从而促进杀死细菌，然而四环素是抑菌剂，从而减緩细 菌的生长和发育。然而，尽管功效上存在这些显著的差异，但经证明 当局部应用于口腔时四环素是更有效的抗微生物剂。因此，当向涂覆 有唾液的羟基磷灰石盘(SHA)(牙/釉质表面的替代品)加入四环素， 然后清洗该四环素处理的SHA牙齿类似物，并将其置于细菌的培养物 中时，看到此类生物极少能够粘附至SHA。另一方面，当以相似的方 式用青霉素处理SHA时，没有效果。因此，尽管当与青霉素相比时四 环素的功效较低，但四环素在解释药物粘附和从涂覆有唾液的牙齿类似物释》文的测定中更优。因为两种最常见的牙病，龋病(caries)和牙 周病由粘附至牙齿表面的口腔细菌引起，所以口腔中抗微生物功效的 检测需要集中在预防或减少细菌粘附至牙齿表面的方法上。
基于该理解，20世纪60年代后期和70年代早期的研究检查了具 有直接性(substantivity )的特征(试剂结合牙齿样表面并从其释i文 的能力)的试剂。已研究的具有该特征的首批试剂中的一个是氯己定 (双缩二胍(bisbiguanide)抗樣l生物剂)，其在体外和体内都显示减少 菌斑至牙齿的附着。研究称为Peridex⑧和Perioguard⑧的试剂，其为 目前可商购获得的已进行过检测并且显示结合口腔组织的口腔清洗 剂。当用于临床研究时，与抗微生物活性组合的该直接性的特性导致 龈炎和龋病水平的降低。自那时以来，已进行许多努力以开发在口腔 中有效作用的试剂。迄今临床试验已显示极少成功例子。 一个这样的 成功例子利用了试剂三氯生(triclosan) ， Colgate Total⑧牙膏中 的活性成分。该洁牙剂经试验证明足以获得联邦机构例如ADA和FDA 的认可。商购可获得的含有三氯生的洁牙剂由Colgate Palmolive公 司提供。通过采用已知的抗微生物剂三氯生(酚类化合物)(其已用 于洗发剂和除臭剂中)，并且将其连接至允许其结合至口腔组织的试 剂开发了全效牙膏(Total toothpaste )。三个主要的工业公司Procter and Gamble/Unilever以及Colgate Palmolive/>司几乎同时将三氯 生作为在口腔中可能有效的试剂进行开发。各公司具有其自己的策略，
所述策略设计用于使活性剂三氯生结合至口腔组织以使其可有效地抗 结合牙齿的口腔微生物。要重申的是，三氯生本身不能结合口腔组织， 从而尽管其具有有效的抗微生物特性但其在口腔中是无效的。Colgate Palmolive 7>司将igicare或gantrex与三氯生混合，从而形成聚合 化合物，该化合物，当递送至口腔时，以使三氯生有效的方式结合。 该组合产品，除了包含氯己定的产品外，和其他包含酚类化合物的试 剂是过去40年中开发的最好的有效试剂之一。
龋病是最常见的慢性儿童期疾病，其频繁程度比哮喘高5倍。17 岁以上的儿童中超过70%具有蛀洞。超过1亿8百万美国人缺少牙齿健康保险，从而缺少该感染的治疗。变异链球菌(又迈W"/7S)被认为是 与蛀牙相关程度最高的微生物之一。在患有局限型青少年牙周炎(现
称为局限型侵袭性牙周炎(Localized Aggressive Periodontitis )) 的儿童的研究中， 一个申请者发现这些儿童中有许多具有最小程度的 牙蛀蚀。此外，这些研究发现，患有该形式的牙周病的儿童具有唾液 蛋白乳铁蛋白(lactoferrin) (Lf)的变体。当该Lf变体(赖氨酸变 体)在昆虫载体中表达并且对其进行检测时，发现其杀死变异链球菌。 相反，存在于健康的非牙周病儿童中的另一种更常见的Lf变体(精氨 酸变体)对变异链球菌的存活影响极小或无影响。
近来，我们已显示具有该乳铁蛋白的赖氨酸形式的合成肽杀死变 异链球菌。其他研究人员已显示乳铁蛋白肽具有抗微生物活性，但迄 今为止没有人显示来源于该肽的抗菌活性可用于抗口腔中的生物。我 们也已证明该肽在口腔中具有有限的有效性，除非将其连接至将允许 该肽结合至牙齿表面的某些物质。因此，我们已开发了融合肽，其中 将活性肽连接至小唾液肽富酪蛋白(statherin),这样其可保持其抗微 生物活性，同时也可保留在牙齿表面以减少变异链球菌对该表面的结 合。
乳铁蛋白(Lf)是在乳房分泌物、泪液和唾液以及在胃肠道中发现 的多功能蛋白质。其主要功能是将铁与其周围环境隔离以阻止口腔微 生物获得得铁(微生物存活所必需的矿物质)。此外，在其N端中， Lf拥有具有抗^L生物特性的区域。该区域称为防卫素(defensin)区 域，并且自20世纪80年代以来已显示Lf可杀死许多类型的细菌，包 括口腔细菌。还显示，在该N端区域，从氨基酸位置11至31存在至 少2个多态性形式。对于该防卫素区域中的大部分变异，在氨基酸位 置29可包含精氨酸或赖氨酸。近至1998年，已显示氨基酸位置29 中的这2种变体具有不同的抗微生物活性，并且经设计具有此类形式 的肽可具有抗微生物活性。事实上，我们的小组在2003年产生了由昆 虫细胞分泌的全长乳铁蛋白。产生具有2种多态性形式(赖氨酸和精氨 酸)的该昆虫细胞分泌的乳铁蛋白并且其通过杆状病毒载体导入。分泌的蛋白质具有人乳铁蛋白的所有特征性质，并且我们就抗革兰氏阳性 和革兰氏阴性生物的活性检测了这两种形式。我们发现赖氨酸形式更 有效地抗一 系列革兰氏阳性和革兰氏阴性生物，特别地更有效地抗变 异链球菌(公认的龋齿的原因)。因为更频繁地在患有局限型侵袭性
牙周炎(LAP)(其中儿童具有比他们的匹配对照更少的龋病的疾病)的 患者中发现Lf的赖氨酸形式，我们推测乳铁蛋白的该赖氨酸形式可对 这些儿童提供生态学有利方面，所述生态学有利方面可解释在这些儿 童中看到的龋病的减少。然后我们进一步确定，除非纯乳铁蛋白连接 至允许其结合牙齿表面的某种物质上，否则其将在口腔中具有有限的 有用性。富酪蛋白是在唾液中发现的小唾液磷蛋白，其在受刺激的唾 液中的浓度为200 ug/mi，但在未受刺激的唾液中浓度低大约10倍。 唾液蛋白至釉质的吸附形成了釉质的薄膜涂层，口中的细菌粘附至该 薄膜涂层，形成了斑的最初细菌组分。吸附的最初唾液蛋白是粘蛋白 (mucin)、淀粉酶、唾液IgA、溶菌酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂 (cystatin)、富含酸性脯氨酸的蛋白质(PRP)和凝集素。至釉质或羟 基磷灰石(HA)表面上的薄膜吸附促进变异链球菌的粘着。相反地，唾 液蛋白如富酪蛋白和富组蛋白(histatin)表现出具有相反的作用， 从而抑制变异链球菌的附着(Gibbons和Hay 1989)。富酪蛋白是富含 酪氨酸的包含43个氨基酸的磷蛋白(Hay和Moreno 1989)。富酪蛋白 主要因其通过结合钙而减少牙垢形成的能力而著名(Hay和Moreno 1987)。最近，Shimotoyodeme等人(2006)已提出富酪蛋白与高分子量 唾液蛋白竟争从而减少变异链球菌与牙齿表面结合。他们进一步显示 由前6个氨基酸组成的小肽也具有该能力。到现在为止，仍然不存在 可确定这些氨基酸残基是否可结合另一种唾液蛋白或由富酪蛋白和乳
上的空间的能力的证据。此外，还不清楚包含富酪蛋白的融合肽是否 可保留在釉质上以及该融合肽是否可保持其抗微生物活性。
.,此处描述了融合蛋白，在该融合蛋白中，抗菌肽(以乳铁蛋白的 形戒存在)被连接至小唾液肽(富酪蛋白)，所述小唾液肽允许抗菌肽结合牙齿表面从而干扰变异链球菌结合牙齿表面的能力。
发明概述
本发明涉及使用乳铁蛋白和富酪蛋白融合蛋白和包含所述蛋白 的组合物进行的由口腔细菌引起的牙疾病的治疗。
在某些实施方案中，本发明涉及用于抑制口腔中细菌生长的包含 融合蛋白的组合物，所述融合蛋白包含乳铁蛋白多肽的赖氨酸形式或 其功能等同的肽分子和富酪蛋白多肽或其功能等同的肽分子。
在其他实施方案中，本发明涉及具有SEQ ID NO. 10、 SEQIDNO. ll或SEQ ID NO. 13的融合蛋白或其功能等同的肽分子。在其他实施 方案中，本发明涉及包含具有SEQ ID NO. 10、 SEQ ID NO. 11或SEQ ID NO. 13的融合蛋白或其功能等同的肽分子的组合物。
在另外的实施方案中，本发明涉及用于通过对需要其的患者施用 有效量的组合物来抑制口腔中的细菌、治疗或预防龋齿、治疗或预防 牙周病、治疗或预防牙斑或治疗与牙斑的存在相关的口腔炎症的方法， 所述组合物包含含有乳铁蛋白多肽的赖氨酸形式或其功能等同的肽分 子和富酪蛋白多肽或其功能等同的肽分子的融合蛋白。
附图概述


图1:乳铁蛋白、富酪蛋白和STAT-LF融合蛋白的肽序列。 图2:说明肽结合羟基磷灰石(HA)(牙齿类似物)的能力的直接性 测定法。
图3:显示只有一种形式的乳铁蛋白具有活性的扩散测定法 (Diffusionassay)。在所有图框中，圆圏是用不同试剂(PBS-作为 对照的磷酸盐緩冲盐水)浸渍的滤纸盘；LF "R"=在氨基酸位置29 上具有精氨酸(R)的乳铁蛋白的11 mer; LF "K"是在氨基酸位置29 上具有赖氨酸(K)的乳铁蛋白的11 mer。将包含标准浓度的一种试 剂的盘置于变异链球菌的汇合培养物上方。围绕盘的空区(clear zone)显示试剂扩散入琼脂培养基并且已抑制变异链球菌培养物的生长，从而表明存在抗菌活性以及变异链球菌不能在该区域生长。
左图框用PBS-对照浸渍的盘显示无抑制作用。
中间的图框用乳铁蛋白的精氨酸变体浸渍的盘没有显示空区， 从而不抑制变异链球菌。
右图框用乳铁蛋白的赖氨酸变体浸渍的盘显示空区，这表明试 剂已扩散入琼脂并且抑制变异链球菌的生长。
图4:显示最具活性的融合肽是LF和富酪蛋白6mer的扩散测定 法。显示5个图框，各自估计受试试剂的活性。在所有图框中，圆圏 是用不同试剂浸渍的盘。将盘置于变异链球菌的汇合培养物上方。围 绕盘的空区显示存在抗菌活性以及变异链球菌不能在该区域生长。
左上方图框其中存在赖氨酸的乳铁蛋白(11 raer)。如在围绕盘 的空区中所见，该制剂抑制变异链球菌的生长。
中间和右上方的图框是两种富酪蛋白肽(6 mer和15 mer )。如 通过未见与盘相邻的抑制区的事实所看到的，这两种制剂都不具有任 何抗菌活性。
左下方图框注释为LF的乳铁蛋白11 raer融合至富酪蛋白6 mer。该融合蛋白保持乳铁蛋白11 mer的活性。
右下方图框注释为LF的乳铁蛋白11 mer融合至富酪蛋白15 mer。该融合蛋白具有比当LF融合至Stat 6 mer时更低的活性。
下方的两个图框显示当向两种富酪蛋白加入LF时干扰的水平。 与当更大的肽融合至LF时相比，当更小的富酪蛋白肽融合至LF时LF 的活性更大。
图5:在2小时的肽处理后，从SHA方块回收变异链球菌。
发明详述
本发明涉及用于抑制细菌定殖的组合物。为了本发明的目的，术 语"抑制，，是指减少或引起存在的细菌死亡，或阻止新的细菌生长。 本发明还涉及抑制细菌在口腔中定殖从而减少牙斑和龋病的量的口腔 治疗性处理。本发明的一个实施方案是由乳铁蛋白和富酪蛋白组成的大体上纯化的融合蛋白(STAT-LF)。图1中提供了 STAT-LF的核酸和氨 基酸序列。通常，"纯化的"将是指已经历分离从而除去各种其他组 分的蛋白质或肽组合物，并且该组合物基本上保持其表达的生物学活 性。当使用术语"大体上纯化的"时，该术语将表示这样的组合物， 在该组合物中，蛋白质或肽形成了组合物的主要组分，例如构成组合 物中大约50%、大约60%、大约70%、大约80%、大约90%、大约95% 或更多的蛋白质。在某些实施方案中，本发明的蛋白质或多肽可与第 二多肽序列有效连接。
^游爭/^W凝^^子
本发明的某些实施方案包括其为STAT-LF序列的全部或一部分的 功能等同物的核酸分子。(在本申请中核酸分子还可以称为DNA序列或 核苷酸序列。所有这些术语具有与核酸分子相同的意义)。功能等同的 核酸分子是编码具有与图1中所示的STAT-LF肽相同或相似的 STAT-LF活性的肽的DNA和RM (例如基因组DNA、互补DNA、合成的 DM和信使RNA分子)。功能等同的核酸分子可编码包含与STAT-LF 肽的区域或更优选与整个STAT-LF肽具有序列同一性的区域的肽。本 申请中描述的突变优选不破坏编码序列的阅读框。功能上等同于 STAT-LF序列的核酸分子可以以下面描述的多种形式发生。
核酸分子可编码STAT-LF肽中的保守氨基酸变化。本发明的某些 实施方案包括功能等同的核酸分子，其编码STAT-LF氨基酸序列内的 保守氨基酸变化和在STAT-LF中产生沉默氨基酸变化。
核酸分子可编码STAT-LF肽中的非保守氨基酸置换、添加或缺失。 本发明的一些实施方案包括在STAT-LF氨基酸序列(图1)内产生非 保守氨基酸变化的功能等同的核酸分子。功能等同的核酸分子包括 DM和RNA，所述DM和RM编码具有非保守氨基酸置换(优选化学上 相似的氨基酸的置换)、添加或缺失但还保留与STAT-LF肽相同或相 似的STAT-LF活性的肽、肽和蛋白质。DM或RNA可编码STAT-LF的 片段或变体。此类片段和变体的STAT-LF或STAT-LF样活性通过下面描述的测定法来测定。本发明包括的STAT-LF的片段和变体应当优选 具有与STAT-LF核酸至少大约40%、 60°/。、 80%或95%的序列同一性，其 编码分子或序列的区域，例如核酸分子的编码序列或保守结构域之一。
根据下列描述，功能上等同于图1中的STAT-LF分子的核酸分子 将变得明了。例如，[图l(d)]中显示的序列可通过天然或人工突变例 如部分核苷酸插入或缺失使其长度改变，从而当将[图l(d)]中的编码 序列的完整长度当作100%时，功能等同的核酸分子优选具有其大约 60-120%，更优选其大约80-110%的长度。片段可以小于60%。
核酸分子包含部分(通常80%或更少，优选60%或更少，更优选40% 或更少的完整长度)天然或人工突变以使这些序列中的一些密码子编 码不同的氨基酸，但其中所得的肽保持相同的或相似的STAT-LF活性。 以该方式产生的突变的DNA应当优选编码这样的肽，所述肽具有与[图 1U)]中的STAT-LF肽的氨基酸序列至少大约40%,优选至少大约60%, 至少大约80%和更优选至少大约90%或95°/。的序列同一性。
由于遗传密码是简并性的，所以[图1 (d)]中的核酸序列不是可编 码具有STAT-LF活性的肽的唯一序列。本发明包括具有与[图l(d)]中 描述的核酸分子相同的基本遗传信息的核酸分子。与本申请中描述的 序列相比具有一个或多个核酸变化并且导致[图l(d)]中所示的肽产 生的核酸分子(包括RM)在本发明的各种实施方案的范围内。
可使用常规的DNA-DNA或DNA-RNA杂交技术分离编码STAT-LF的 核酸的其他功能等同的形式。因此，本发明的某些实施方案还包括核 酸分子，所述核酸分子与[图l(d)]中的一个或多个序列或其互补序列 杂交，并且编码展示与由[图l(d)]中的DNA或其变体产生的STAT-LF 肽的活性相同或相似的活性的肽、肽和蛋白质的表达。此类核酸分子 优选在中度至高度严格条件(参见Sambrook等人Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 最新版.Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.)下与[图1 (d)]中的序列杂交。高 严格清洗具有低盐(优选大约0.2% SSC)，低严格清洗具有高盐(优选 大约2。/。SSC)。大约37。C或大约42。C的温度被认为是低严格的，大约50-65 。C的温度是高严格的。本发明的一些实施方案还包括鉴定编码 STAT-LF激活物肽(优选哺乳动物的肽)的核酸分子的方法，其包括在 中度或高度严格杂交条件下接触包含核酸分子的样品，所述核酸分子 包含[图l(d)]的全部或一部分(优选[图l(d)]的至少大约15或20个 核苷酸)，然后鉴定与包含[图l(d)]的全部或一部分的核酸分子杂交 的核酸分子。相似的方法描述于美国专利5,851,788。
本发明的某些实施方案还包括将与[图l(d)]的全部或一部分杂 交的核酸分子的全部或一部分例如用作探针或用于测定中以鉴定由核 酸分子(下面描述的)产生的肽的拮抗剂或抑制剂的方法。本发明的 一些实施方案包括以相似的方法使用与STAT-LF核酸分子(如下面所 描述的)具有序列同一性的核酸分子的方法。
本发明的某些实施方案还包括核酸分子检测试剂盒，其包含(优 选在适当的容器工具中或附着至表面)本文中公开的编码STAT-LF[图 1 (d)]或具有STAT-LF活性的肽的核酸分子和检测试剂(例如可检测的 标记)。
秀浙遂合參一浴^^"法
当在药物组合物中与栽体组合时，STAT-LF也是有用的。当在由 变异链球菌引起的疾病、病症或异常身体状况的医学治疗或预防的方 法中施用时，组合物是有用的。本发明的某些实施方案还包括例如通 过施用包含载体和STAT-LF的药物组合物医学治疗由过度的变异链球 菌表征的疾病、病症或异常身体状况的方法。龋病是可通过施用 STAT-LF[图l(d)]治疗或预防的疾病的一个实例。当在由其他引起牙 斑的革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌(包括但不限于放线菌属物种 (Jc〃"咖7ces )和其他链球菌属物种(57re/7&cocc/ )) 引起的疾病、病症或异常身体状况的医学治疗或预防的方法中施用时， 组合物也是有用的。
在医学治疗的方法中，可通过方法例如食物、食品添加剂、洁牙 剂、凝胶、牙膏、漱口剂、牙线、假牙清洗剂(denture wash)、义齿粘附剂(denture adhesive) 、 口香糖、糖果、饼干、软々欠料(soft drink )或体育饮料(sports drink )对人或动物施用药物组合物。可 将STAT-LF偶联至脂质或碳水化合物。这通过延长粘附的持续时间或 通过增加其亲和力或两者来增加它们粘附牙齿的能力。还可将它们偶 联至聚合物，例如在牙科工作中(例如，齿冠、牙套、填料)或牙线。 可对人或动物施用药物组合物。施用的剂量取决于个体患者的状况、 药物的指示(indication of the drug)、药物的物理和化学稳定性、 期望的效应的毒性和选择的施用途径(Robert Rakel.等人.Conn's Current Therapy (1995. W B. Saunders Company, USA)。药物组合 物用于治疗由形成牙斑的细菌感染引起的疾病例如龋齿、牙周病和心 内膜炎。在优选实施方案中，药物组合物用于治疗由放线菌属物种和 链球菌属物种引起的疾病。在另外的优选实施方案中，药物组合物用 于治疗疾病，用于治疗由(但不限于)变异链球菌、表兄链球菌 (51 5^6r/77M) 、 口腔链球菌(S. oralis)、血链球菌"譜^//力、 緩症链球菌(、格氏链J求菌(5.《0/7/0/7//)、肺炎链J求菌 (iS7re/^ococcwi1 /7/7ew370/7/ae)、酉良脓链J求菌(^ / 7C^e/ ei1)和无 乳链球菌(圼aw/"〃ae)引起的链球菌感染。
可使用体内递送媒介物例如脂质体将核酸分子和STAT-LF[图 1 (d)]导入细胞。还可使用物理技术例如显微注射和电穿孔或化学方法 例如共沉淀或使用脂质体将它们导入此类细胞。在一些情况下，期望 使用被靶向目的细菌的脂质体。
在优选实施方案中，使用一种或多种能够在与牙斑相关的细菌中 抑制生物膜形成的STAT-LF肽制备根据本发明的药物组合物。
包含STAT-LF肽的药物组合物特别适合用于治疗或防治(预防) 由链球菌感染引起的疾病、病症或异常身体状况的方法。此类药物组 合物特别地用于治疗由 一种或多种的口腔链球菌例如变异链球菌、表 兄链球菌、口腔链球菌、血链球菌、緩症链球菌或格氏链球菌引起的 感染。药物组合物还用于治疗和预防其他类型的链球菌感染例如肺炎 链球菌、酿脓链球菌和无乳链球菌感染。药物组合物可通过已知的用于制备可对患者施用的药学上可接 受的组合物的方法来制备，以使有效量的核酸分子或肽与药学上可接
受的媒介物组合在混合物中。适当的载体描述于例如Remington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company. Easton. Pa. ， USA)。载体包括盐水和謂
(5%葡萄糖和水)。赋形剂包括添加剂例如緩沖剂、增溶剂、表面活性 剂、悬浮剂、乳化剂、粘度控制剂(viscosity controlling agent)、 香料(flavor)、乳糖填充剂、抗氧化剂、防腐剂或染料。存在用于 稳定肽以进行胃肠外和其他施用的优选赋形剂。赋形剂包括血清白蛋 白、谷氨酸或天冬氨酸、磷脂和脂肪酸。
在其他优选实施方案中，将表面活性剂包含在组合物中以帮助渗 透生物膜。可用于本发明的表面活性剂通常包括药学上可接受的阴离 子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性(兼性/两亲性)表面活性剂和 非离子型表面活性剂。适当的药学上可接受的阴离子表面活性剂包括 例如单价烷基羧酸盐、酰基乳酸盐、烷基醚羧酸盐、N-酰基肌氨酸盐、 多价烷基碳酸盐、N-酰基谷氨酸盐、脂肪酸-多肽浓缩物
(condensates )、石危酸酯、烷基辟u酸盐(包括十二烷基石危酸钠(SLS))、 乙氧基化烷基硫酸盐、酯连接的磺酸盐(包括多库酯钠或二辛基琥珀酸 钠(dioctyl sodium succinate) (DSS))、 a-烯烃磺酸盐和石粦酸化 乙氧基化醇(phosphated ethoxylated alcohol)。适当的药学上可 接受的阳离子表面活性剂包括例如单烷基季铵盐、二烷基季胺化合物、 酰胺胺(amidoamine )和胺化酰亚胺。适当的药学上可接受的两性(兼 性/两亲性)表面活性剂包括例如N-取代的烷基酰胺、N-烷基甜菜碱、 磺基甜菜碱和N-烷基P -氨基丙酸盐。
在优选实施方案中，使用十二烷基硫酸钠。在优选实施方案中， 组合物包含按体积计算大约0. 1至大约10%，大约0. 3至大约5%或大 约0. 5%至大约2%的十二烷基硫酸钠。可选地，可在体现活性、传导活 性的赖氨酸残基之一上将取代的序列如十二烷基硫酸钠插入融合肽。 例如，可用十一酸修饰Lys的侧链这将导入与SLS中的十二烷基部分相似的长烷基链。
还可用氨基十一酸修饰Lys的侧链这将导入与SLS中的十二烷 基部分相似的长烷基链且在末端导入正电荷(NH2)。<formula>formula see original document page 16</formula>
还可用例如氨基十一酸修饰Lys的侧链并且在末端偶联天冬氨酸 以在末端导入两性离子。
在此基础上，药物組合物可包含活性化合物或物质例如STAT-LF 肽和一种或多种药学上可接受的媒介物或稀释剂，并且其包含在具有 适当的pH和与生理体液(physiological fluid)等渗的緩冲溶液中。 药物载体将取决于期望的施用途径。将活性分子与媒介物组合或将它 们与稀释剂组合的方法对于本领域技术人员来说是熟知的。组合物还 可包含添加剂例如抗氧化剂、緩沖剂、抑菌剂、杀菌性抗生素和使制 剂在期望的接受者中等渗的溶质；和可包含悬浮剂和增稠剂的水性和 非水性无菌悬浮液。组合物可包含用于将活性化合物运输至特定位置 的靶向性试剂。
根据本发明的药物组合物可通过本领域内已知的任何适当的途径来施用。在其中感染是局部性的情况下，可将药物组合物局部施用 至被感染的区域。在其中感染是全身性的情况下，可口服、静脉内或 胃肠外施用药物组合物。
在一些情况下，可能期望将根据本发明的药物组合物和已知的抗 菌剂例如抗生素一起施用。在一些情况下，抑制生物膜形成的药物组 合物也用于使细菌细胞对抗生素更易感。
本文中使用的术语"抗生素"是指本领域技术人员已知的抑制细 菌的生长或杀死其的任何化合物。术语"抗生素"包括但不限于P-
内酰胺(青霉素类和头孢菌素类)、万古霉素、杆菌肽(bacitracin)、 大环内酯(红霉素)、林可酰胺(lincosamide)(克林达霉素)、氯霉素、 四环素、氨基糖苷类(庆大霉素)、两性霉素、头孢唑啉、克林霉素、 莫匹罗星、磺胺类和曱氧苄啶、利福平、曱硝唑、喹诺酮、新生霉素、 多粘菌素(polymixin)、短杆菌肽或其任何盐或变体。使用的抗生素 将取决于细菌感染的类型。
根据本发明的药物组合物的治疗有效剂量将取决于感染的类型 和严重度以及药物组合物是否包含另外的活性成分例如抗生素。通常， 治疗有效剂量是足以控制生物膜形成或龋齿并且对被治疗的人或动物 无毒的最小量。用于测定有效剂量和毒性的方法在本领域内是已知的。
根据本发明的另一个方面，提供了产生经遗传修饰从而产生抑制 生物膜形成或龋齿的STAT-LF肽的细胞的方法。另一个方面包括对患 者施用经遗传修饰从而产生抑制生物膜形成或龋齿的STAT-LF肽的细 胞。
本发明的另外方面提供了有活力的经转染的细胞(其经遗传修饰 从而产生抑制生物膜形成的STAT-LF肽)在制备药剂中的用途，所述 药剂用于对哺乳动物患者施用以改善口腔卫生或减轻龋齿。
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用于制备药物组合物的上述STAT-LF肽还可用于制备抗微生物组 合物例如液体消毒溶液。此类溶液还可包含抗孩i生物剂或抗真菌剂例如酒冲*、聚维酮石典溶液和抗生素以及防腐剂。这些溶液可例如在插入 或植入装置例如导管之前用作皮肤或周围环境区域的消毒剂，用作封
管液(catheter lock)和/或冲洗液(flush solution)，和用作任 何医疗器械(包括但不限于导管组件例如针、Leur-Lok接头 (connector)、无针接头和针座(hub)以及其他可植入装置)的杀 菌漂洗液。此类溶液还可用于涂覆或消毒手术器械，包括但不限于钳 子、摄子、剪刀、皮肤钩、管、针、牵开器(retractor )、刮器(scaler )、 钻子、凿子、锉刀(rasp)和锯子。
用于抑制生物膜形成的抗微生物组合物可包含任何上述肽、反义 分子和抗体STAT-LF肽。
抗微生物组合物还可包含另外的组分，包括但不限于表面活性 剂、杀菌剂(antiseptic)和抗生素(参见上面列出的实例)。
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本文中公开的核酸分子可从cDNA文库获得。核苷酸分子还可从 本领域内已知的其他来源例如表达序列标签分析或体外合成获得。可 将本申请中描述的DNA (包括为功能等同物的变体)导入多种真核和 原核宿主细胞并且在其中表达。STAT-LF的重组核酸分子包含合适的 有效连接的转录或翻译调控元件。适当的调控元件来源于多种来源， 并且它们可由本领域技术人员容易地选择(Sambrook， J. Fritsch， E. E. & Maniatis， T.(最新版本).Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York; Ausubel 等人(最新版本).Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons. Inc.)。例如，如果要上调核酸分子的表达，可将有义 序列或沉默RM以及适当的启动子插入载体。启动子可以是诱导型的 或组成型的、受环境或发育调控的或细胞或组织特异性的。用本领域 已知的用于表达的启动子增强转录。CMV和SV40启动子通常用于在细 胞中表达期望的肽。还可使用本领域内已知的其他启动子(许多适当的 启动子和载体描述于本申请中引用的申请和专利中)。如果要下调核酸分子的表达，可将反义序列和适当的启动子插入 栽体。核酸分子可从天然来源(以有义或反义方向)分离、合成或其 可以是突变的天然或合成的序列或这些序列的组合。
调控元件的实例包括转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序 列、核糖体结合序列，包括翻译起始信号。此外，取决于使用的栽体， 可将其他基因元件例如选择标记整合入重组分子。可使用的其他调控 区包括增强子结构域和终止区域。调控元件可以是细菌、真菌、病毒 或鸟类来源的。同样，调控元件可来源于动物、植物、酵母、昆虫或 其他来源，包括合成产生的元件和突变的元件。
除了使用上述表达栽体外，还可通过将重组核酸分子插入已知的 来源于细菌、病毒、酵母、哺乳动物、昆虫、真菌或鸟类的表达系统 来表达肽。取决于细胞类型，可通过技术例如根癌农杆菌 (^To6ac&r/"/z7 /^/Z7e尸a"'e/7)介导的转化、；微粒轰击介导的转化 (particle-bombardment-mediated transformation)、 直接吸收、 显微注射、共沉淀、转染和电穿孔将重组分子导入细胞。可使用逆转 录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、DM病毒栽体和脂 质体。将适当的构建体插入表达栽体，该表达载体还可包含用于选择 转化细胞的标记。可将构建体插入在由限制性酶产生的位点上。
在本发明的一个实施方案中，用插入在表达载体中的本发明的核 酸分子转染细胞来产生表达由该核酸分子编码的肽的细胞。
本发明的另一个实施方案涉及用本文中公开的插入在表达载体 中的核酸分子转染细胞以产生表达STAT-LF肽[图l]或本发明的其他 肽的细胞的方法。根据本发明的某些实施方案，提供了用于在细胞中 表达公开的肽的方法。优选方法包括在培养基中培养细胞(所述细胞 包含含有编码STAT-LF[图l]的核酸分子(或本发明的另一种核酸分子) 的重组DM栽体)以使肽表达。方法优选还包括从细胞或培养基中回 收肽。
絲本发明的某些实施方案包括从本申请中描述的克隆的STAT-LF肽 分子或本文中公开的其他核酸分子(参见材料和方法部分)制备的寡 核苷酸探针。探针在长度上可以是15至20个核苷酸。优选探针是[图 1]中的STAT-LF的至少15个核苦酸。本发明的某些实施方案还包括[图 l]的至少15个连续核普酸。探针用于鉴定编码STAT-LF肽以及与 STAT-LF功能等同的肽的核酸。寡核苷酸探针能够在严格杂交条件下 与[图l]中显示的序列杂交。编码本文中公开的肽的核酸分子可通过 在中度至高度严格杂交条件下用已标记的探针筛选文库来从其他生物 分离。由核酸分子编码的肽的活性通过DNA的克隆和表达来评估。在 分离表达产物后，如本申请中所描述的，就STAT-LF活性测定肽。
来自其他细胞的功能等同的STAT-LF肽分子或编码等同的 STAT-LF的cDNA或合成的DNA还可使用聚合酶链式反应(PCR)法通过
扩增来分离。可制备基于[图l]的寡核苷酸引物例如简并引物并且将 其与PCR和逆转录酶一起使用(E. S. Kawasaki (1990). In Innis等 人，Eds" PCR Protocols, Academic Press, San Diego， Chapter 3， p. 21)从而从其他生物的基因组或cDNA文库扩增功能等同的DNA。寡 核苷酸还可用作筛选cDM文库的探针。
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本发明不仅包括由本文中公开的序列编码的肽，而且还包括展示 相同的或相似的STAT-LF肽活性的功能等同的肽、肽和蛋白以及模拟 物(图1)。
实施例
进行两个不同的实验以证明我们检测的物质的抗微生物活性。第
一个实验是我们在我们的实验室开发的盘扩散筛选测定法。在该测定 中，我们在由胰酪胨大豆肉汤(trypticase soy)和20%的添加的蔗糖
组成的肉汤中培养变异链球菌的过夜培养物。将细胞培养过夜，然后在Mitis Salivarius Bacitracin (MSB)琼脂上划线至汇合。此外，我们采用25 cm无菌滤纸盘并且加入200 ul完全唾液、包含乳铁蛋白的赖氨酸或精氨酸变体的唾液，让唾液在滤纸上干燥1小时，然后将含有添加的蛋白质的滤纸置于MSB琼脂上的变异链球菌的汇合培养物的中央上。然后让该培养物在37。C下温育24小时，之后我们就围绕滤纸盘边缘的变异链球菌生长的抑制区来检查平板。该测定法用于篩选潜在的抗微生物活性。
第二组实验由在含有20%蔗糖的胰酪胨大豆肉汤(TSBS)中培养变异链球菌的贮备培养物过夜组成，其应当在24小时的时期内产生大约1 x 1()8个细胞/ml。然后我们彻底涡旋该致密的培养物以使其均匀，然后取出100 ul等分的该培养物，并且将其置于装有9. 8 mi无菌TSBS的新管(我们向其中加入了 100ul/ml的2ug/ml剂量的a)Lf的赖氨酸变体、b)Lf的精氨酸变体、c)氯己定[阳性对照]、d)PBS[阴性对照])。让该混合物生长过夜。第二天早上，取出100ul等分置于MSB琼脂上，在该琼脂上涂板，然后将其培养过夜，次日就菌落形成单位/ml对其进行检查。该组实验用于通过标准MIC培养模式(standardMIC patterns of growth)比t支和定量Lf变体的抗孩i生物活性。还通过将细菌培养物和受试试剂混合1至2小时，然后涂板过夜来进行这些实验以测定在短暂的接触时间后试剂的活性。
第三组实验使用直接性测定法，该测定法证明肽结合羟基磷灰石(HA)的能力(图4)。图5中提供测定的结果。
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用于合成肽的方法包括逐步加入通过共价键被加至固体树脂颗粒的被保护的氨基酸。该方法使用Fmoc合成化学法。 一个氨基酸加入的平均循环时间花费大约60分钟。加入的氨基酸受到保护。用于保护側链官能团的保护基团是对酸敏感的，然而氨基酸的N末端氨基官能团受到对碱敏感的Fmoc基团保护。树脂以200-400目的多孔珠粒的形式存在，其允许试剂渗入凝胶筛。在受保护的环境中进行氨基酸的添说明书第18/18页
加，然后通过过滤和重结晶除去试剂和副产物。正在生长的肽链在不溶性固相中受到完全保护。形成的肽与通过标准对-硝基苯基酯法
(p—nitophenyl ester procedure)制备的样品相同。
盘扩散测定允许将特定蛋白质加入至滤纸盘，由此蛋白质可扩散入琼脂以测定抗微生物活性。将下列肽添加至盘；R=Lf的精氨酸形式(图l(a))。 K=Lf的赖氨酸形式(图l(a))。 PBS-磷酸盐緩沖盐水，其用作对照溶液，或其中加入了 Lf的R形式或K形式。在下面的图1中，我们以1 ug/ml的浓度向200 ul PBS中加入R形式或K形式，然后将其加至25 cm滤纸条的表面，让纸条干燥l小时。然后我们将变异链球菌的培养物在含有20%蔗糖的胰酪胨大豆琼脂平板上划线至汇合，然后将干燥的盘置于平板中央上。将培养物在培养箱中于37。C下培养，然后在接种后第24或48小时时对其进行评估。可在盘K周围(其中赖氨酸变体悬浮在PBS中)和在盘K中(其中赖氨酸变体悬浮在正常的唾液(所述唾液在加入K之前不具有抗菌活性)中)看到抑制区。在盘R/PBS或R/唾液(其中用精氨酸变体替代了赖氨酸变体)上未看到抑制区(图3)。以大约15 ug/ml的浓度加入LF肽的R和K形式。
图4显示ST6和ST15不具有任何抗微生物活性。在图4的最下行，从左至右可看见LFll (图1)制剂抑制变异链球菌的生长，如通过围绕盘的空区所看到的。对于融合至富酪蛋白6的LF，该融合蛋白保持乳铁蛋白11 mer的活性(图4)。与ST 15组合的LF具有比STAT-LF6更低的活性。
权利要求
1.用于抑制口腔中细菌生长的包含融合蛋白的组合物，所述融合蛋白包含i.乳铁蛋白多肽的赖氨酸形式或其功能等同的肽分子；和ii.富酪蛋白多肽或其功能等同的肽分子。
2. 权利要求l的组合物，其中融合蛋白是大体上纯化的。
3. 权利要求1的组合物，其中组合物还包含药学上可接受的赋形剂。
4. 权利要求1的组合物，其中组合物还包含表面活性剂或表面 活性剂样分子。
5. 权利要求4的组合物，其中表面活性剂是十二烷基硫酸钠。
6. 权利要求5的组合物，其中十二烷基硫酸钠以允许组合物渗 透生物膜的有效量存在。
7. 权利要求l的组合物，其中融合蛋白还包含另外的多肽序列。
8. 权利要求3的组合物，其中组合物是选自食物、食品添加剂、 洁牙剂、凝胶、牙膏、漱口剂、牙线、假牙清洗剂、义齿粘附剂、口 香糖、糖果、咀嚼片剂和溶液的剂型。
9. 权利要求1的组合物，其还包含抗菌剂、抗微生物剂、抗真 菌剂或其组合。
10. 用于抑制口腔中的细菌的方法，其包括对需要其的患者施用 有效量的包含融合蛋白的组合物，所述融合蛋白包含i. 乳铁蛋白多肽的赖氨酸形式或其功能等同的肽分子；和ii. 富酪蛋白多肽或其功能等同的肽分子。
11. 用于治疗或预防龋齿的方法，其包括对需要其的患者施用有 效量的包含融合蛋白的组合物，所述融合蛋白包含i. 乳铁蛋白多肽的赖氨酸形式或其功能等同的肽分子；和ii. 富酪蛋白多肽或其功能等同的肽分子。
12. 用于治疗或预防牙周病的方法，其包括对需要其的患者施用有效量的包含融合蛋白的组合物，所述融合蛋白包含i. 乳铁蛋白多肽的赖氨酸形式或其功能等同的肽分子；和ii. 富酪蛋白多肽或其功能等同的肽分子。
13. 用于治疗或预防牙斑的方法，其包括对需要其的患者施用有 效量的包含融合蛋白的组合物，所述融合蛋白包含i. 乳铁蛋白多肽的赖氨酸形式或其功能等同的肽分子；和ii. 富酪蛋白多肽或其功能等同的肽分子。
14. 用于治疗与牙斑的存在相关的口腔炎症的方法，其包括对需 要其的患者施用有效量的包含融合蛋白的组合物，所述融合蛋白包含i. 乳铁蛋白多肽的赖氨酸形式或其功能等同的肽分子；和ii. 富酪蛋白多肽或其功能等同的肽分子。
15. 权利要求10至14的任一项的方法，其中融合蛋白是大体上 纯化的。
16. 权利要求10至14的任一项的方法，其中组合物还包含药学 上可接受的赋形剂。
17. 权利要求10至14的任一项的方法，其中组合物还包含表面 活性剂或表面活性剂样分子。
18. 权利要求17的方法，其中表面活性剂是十二烷基硫酸钠。
19. 权利要求18的方法，其中十二烷基硫酸钠以允许组合物渗透生物膜的有效量存在。
20. 权利要求10至14的任一项的方法，其中通过选自食物、食 品添加剂、洁牙剂、凝胶、牙膏、漱口剂、牙线、假牙清洗剂、义齿 粘附剂、口香糖、糖果、咀嚼片剂和溶液的剂型施用组合物。
21. 权利要求10至14的任一项的方法，其中组合物还包含抗菌 剂、抗微生物剂、抗真菌剂或其组合。
22. 权利要求10至14的任一项的方法，其中将融合蛋白与另外 的多肽序列连接。
23. 用于抑制口腔中细菌生长的组合物，其包含具有SEQ IDNO. 10、 SEQ ID NO. 11或SEQ ID NO. 13的融合蛋白或其功能等同的肽分子。
24.具有SEQ ID NO. 10、 SEQ ID NO. 11或SEQ ID NO. 13的 融合蛋白或其功能等同的肽分子。
全文摘要
本发明总地说来涉及牙疾病、龋病(caries)和牙周病。更具体地，本发明涉及乳铁蛋白(lactoferrin)和富酪蛋白(statherin)融合蛋白(STAT-LF)以及此类多肽的治疗性、诊断性和研究性用途。本发明还提供了治疗牙疾病、龋病和牙周病的方法。
文档编号C07K14/00GK101657466SQ200880006251
公开日2010年2月24日 申请日期2008年1月16日 优先权日2007年1月16日
发明者D·菲勒, N·拉马苏布 申请人:新泽西内科与牙科大学