PsammaplinA的新颖衍生物、其合成方法以及其用于预防或治疗癌症的用途的制作方法

专利名称：：PsammaplinA的新颖衍生物、其合成方法以及其用于预防或治疗癌症的用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及到PsammaplinA的新颖衍生物、其合成方法以及它们用于预防和/或治疗癌症或肿瘤的用途。
背景技术：
：Ps翻邻linA(式1)是对称的溴代酪氨酸衍生的二硫化物二聚体，其最初在1987年被从未鉴别出的海绵(Arabshahi,L.;Schmitz,F.J.,J.Org.Chem.1987,52，3584-3586)、Thorectopsamraaxana(Rodriguez,A.D.，etal.，TetrahedronLett.1987，28,4989-4992)禾卩Psa,plysillasp(海绵属)(QuinfloA,E.;Crews，P.TetrahedronLett.1987，28，3229-3232)中分离出来。早期的研究显示，PsammaplinA具有一般的抗细菌和抗癌特性。在1999年，人们发现PsammaplinA显示出显著的体外抗金黄色葡萄球菌(SA)和耐甲氧西林青霉素类抗菌素的金黄色葡萄球菌(MRSA)的抗菌活性，这被推断为被PsammaplinA通过抑制DNA促旋酶而诱导的细菌DNA合成停滞的结果(Kim,D.etal.，Arch.Pharm.Res.1999，22，25-29)。另夕卜，已有报导PsammaplinA显示出对许多酶的特定抑制性，这些酶包括局部异构酶II(topoII)(Kim,D.etal.，AnticancerRes.1999，19,4085-4090)、法呢基蛋白质转移酶和亮氨酸氨肽酶(Shin,J.etal.,J.Tetrahedron2000，56，907卜9077)、以及壳多糖酶，如同最近的报导(Tabudravu，J.N.et.al.，Bioorg.Med.Chem.2002，10，1123-1128)。在这些酶当中，真核生物DNA复制所需要的topoII、以及细菌DNA促旋酶属于决定着对DNA拓扑学的重塑的局部异构酶家族。最近有报导说，Psa鹏aplinA展示出显著的抗人肺(A549)、卵巢(SKOV-3)、皮肤(SK-MEL-2),CNS(XF498)、以及结肠(HCT15)的癌细胞系的细胞毒性(Park,Y.etal.，J.Nat.Prod.2003，66，1495-1498)。其他的研究建议，PsammaplinA的细胞毒性或许与其对基本的细胞代谢过程-DNA复制的抑制效果有关，并且PsammaplinA的主要靶分子之一可能是pola-引物酶(Jiang,Y.etal.,BMCCancer2004,4:70)。最近，已经发现式1是有潜力的肿瘤侵入和血管生成所必需的金属蛋白酶一APN的抑制剂(Shima，J.S.etal.,J.CancerLetters.2004,203，163-169)在所报导的归因于PsammaplinA(式l)的生物活性之中，最重要的或许是其抑制使组蛋白脱去乙酰基的酶--被称为组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)的能力，(IC504.2nM，体外无细胞的酶测定)(Pifta，I.C.etal.，J.Org.Chem.2003，68，3866-3873)。数种HDAC抑制剂作为潜在的用于癌症的分子靶向化疗试剂目前正在临床试验(Remiszewski，S.W.，Curr.Med.Chem.2003，10,2393-2402)。尽管式1既可体外又可体内抑制肿瘤生长，但其生理学稳定性较差,这限制了其作为药物的开发。式1在生理条件下的不稳定性(或者细胞膜渗透性较差)可以解释为什么HI)AC在基于细胞的测定中的抑制性要求式1的浓度比:HDAC在基于酶的测定中所要求的浓度要高1800倍。在开发有潜力的和选择性的HDAC抑制剂的过程中，已经证明由杂芳族酸衍生的酰胺部分可以用作薩C抑制剂有用的末端残基。一系列杂环酰胺异羟肟酸的合成显示了吲哚-酰胺、尤其是2-取代吲哚-氨甲酰作为:HDACis的高潜力(I)ai，Y.etal.;Bioorg.Med.Chem.Lett.2003，13，1897-1901)。
发明内容本发明的一个目的在于获得具有与PsairanaplinA相似的结构、并且具有对癌细胞系的显著生物活性的新分子。本发明的一个目的在于提供一种对应于如下所示结构式(I)的分子及其药学上可接受的盐<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>(I)其中n是选自于1、2、3、4、5、6、7、8的整数;i是选自于l、2的整数；j是选自于0、l的整数；当i=2时，则j=0;并且当i=1时，则j=1;X是卤素原子；W是选自下组的连接物广CO-NH-、-NH-CO-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-S-、-S-CO-、-CH=CH-、共价键；R是选自于下组的基团氢原子、CfCe烷基、CfCe羧基烷基；:R2、R3:彼此可相同或者不相同，选自于下组氢原子、C「C6烷基、CrC6卤代烷基、卤素原子、羟基、C「Ce垸氧基、C「Ce氨垸基、C「Ce饱和杂环垸基、C6_C12芳基、C6_C2。芳fe基、C4_C12杂方基；R4选自于下组氢原子、C「C6烷基、QrC6酰基、Ce-C12芳基丄6-C2Q芳烷基、Q-C12杂芳基；&选自于下组氢原子、C「Ce烷基、C'e-C2。芳烷基。卤素原子是选自于下组的原子Cl、F、Br、1。CrC6卤代烷基是指包含1、2、3、4、5或6个碳原子和至少一个卤素原子的直链的、支链的或环状的烷基链。CrC6烷氧基是指包含1、2、3、4、5或6个碳原子的直链的、支链的或环状的_0_烷基。C「C/氨烷基是指包含l、2、3、4、5或6个碳原子的直链的、支链的或环状的-NH-烷基或-二烷基。C'i-C'e饱和杂环烷基是饱和的环状链，其包含1、2、3、4、5或6个碳原子和一个或两个杂原子比如N、0、S，例如吡咯烷、哌啶、四氢呋喃。C6-C12芳基是包含6、7、8、9、10、11或12个碳原子的芳基，如苯基或萘基。C6-C2。芳烷基是包含垸基链和至少一个芳基，并且具有6到20个碳原子，如苯甲基或三苯甲基。Q-C^杂芳基是包含4、5、6、7、8、9、10、ll或12个碳原子和一个或两个杂原子比如N、0、S的芳基，例如吡啶、呋喃、嘧啶。C2-C6酰基是-CO垸基，其中垸基链包含1、2、3、4或5个碳原子。优选满足下列一个或几个条件n是选自于2、3、4、5、6的整数；i是2;j是0;X是Br;W是-CO-NH-;RpR^Rs是氢原子；:R4是H:;R5是H。优选的分子是包括在下表中的那些分子<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>本发明人惊讶地发现,对应于结构式(I)的分子具有抑制癌细胞的细胞周期中至少一个、优选两个、更优选三个步骤的特性。特别地，当与癌细胞接触时，结构式(]:)的分子具有--种或多种下述特性-它们可诱导细胞周期停滞；-它们可诱导程序性细胞死亡(即，调亡)；-它们可用作组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)的抑制剂；_它们可用作DNA甲基转移酶(D雨Ts)的抑制剂；_它们可诱导TNF(肿瘤坏死因子)相关的程序性细胞死亡的表达，诱导配体TRAIL用的。它们可用作人类SI::RTl和SI::RT2的抑制剂。-一些结构式(I)的分子作为用于更具生物学活性的分子的合成的中间体也是有药学上可接受的盐包括由药学上可接受的无机或有机的碱和酸衍生的盐。合适的9盐包括由在药物学现有技术中众所周知的许多其他酸的碱金属比如钾和钠、碱土金属比如钙和镁盐所衍生的盐。具体地，药学上可接受的盐的例子是由可形成生理学可接受的阴离子的酸所形成的有机酸盐,例如甲苯磺酸盐、甲烷磺酸盐、醋酸酯、柠檬酸盐、丙二酸盐、酒石酸盐、琥珀酸、安息香酸盐、抗坏血酸盐、a-酮戊二酸盐、以及a-甘油磷酸盐。合适的无机盐还可以是形成的盐，包括硫酸盐、硝酸盐、碳酸氢盐、以及碳酸盐。通过使用本
技术领域：
众所周知的标准方法可以得到药学上可接受的盐。本发明的一个目的在于提供一种药物或药物组合物,其包含在药学上可接受的支持物中的有效量的结构式(I:)的分子或其盐。根据本发明，组合物包括适当的载体比如水，并且被配制成用于个体所需要的给药途径。任选地，该化合物被以与至少一个附加的治疗剂相组合或者交替的方式给药，用于肿瘤或癌症的治疗。本发明的另一个目的在于提供一种由结构式(]:)的分子所制备药物的应用，该药物用于在需要其的个体中抑制和/或治疗肿瘤或癌症。该应用尤其与预防和/或治疗选自于下组的癌症有关肺癌、卵巢癌、中枢神经系统(CNS)癌症、皮肤癌、以及结肠癌或白血病。在此使用的术语"癌症和似癌的"，指的是或描述的是在哺乳动物中的生理情况，典型地表征为无限制的细胞生长，并且尤其增殖紊乱。这样的增殖紊乱的例子包括，尤其是癌症比如恶性肿瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、以及白血病。这些癌症的更具体的例子包括乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、胰腺癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、以及甲状腺癌。在此使用的术语"肿瘤"指的是赘生性细胞生长和增殖(不管是恶性的还是良性的)、以及所有的癌前和患癌的细胞和组织。特别地，癌症可以通过实体瘤块表征。实体瘤块，如果存在，则可以是原发肿瘤块。原发肿瘤块指的是在组织中癌细胞的生长，由该组织中的正常细胞转化而导致。考虑所选择的结构式(I)的分子的生物活性、患者的年龄和体重、癌症和/或肿瘤的类型和严重性、以及所选择的给药途径而调整本发明的药物给药剂量和节奏。本发明的另一个目的在于提供结构式(I)的分子的合成方法。Hoshino等(Bioorg.Med.Chem.Lett.1992，2，1561-1562)报导了由3-溴代酪氨酸出发以4个步骤合成式1的方法(方案1)。通过4个步骤以23%的产率得到了Ps翻即linA(式1)。10方案l1方案1.试剂和条件:(i)(CF3C0)2()，80-120°C,lh(61%);(ii)70%三氟乙酸(TFA)水溶液，25。C,12h(97X);(iii)H0NH2*HC1、AcONa、EtOH，25°C(57%);(iv)DDC，N-羟基邻苯二甲酰亚胺、EtW、胱胺、1，4-二氧杂环己烷-甲醇，25°C、12h(67%)。[OOeo]随后将Hoshino的方法的基本特征并入在方案2中显示的Nicolaou(Nicolaou，K.etal.，J.Chem.-Eur.J.，2001,7，4280-4295)报导的制备PsamraaplinA型衍生物的—一般方法中。经过4个步骤由化合物4(Nicholaou，G.M.etal.，A.Bioorg.Med.Chem.Lett.2002，12,2487-2490)出发以36%的产率得到了Psammaplin1类似物。通过催化诱导的二硫化物交换，Nicolaou的方法在制备有3828个成员的PsammaplinA类似物文库中得到发展，这些类似物被掩蔽了它们的抗细菌性质(Nicolaou,G.M.etal.，Bioorg.Med.Chem.Lett.，2002，12，2487-2490)。方案2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>方案2.试剂和条件:(i)KBr-K:Br()3,H2()，23°C，12h(81%);(ii)三氟醋酐("隱)，80。C，12h;(iii)70V三氟乙酸(TFA)水溶液，23°C，12h(60%，2个步骤)；(iv)THP_0NH2，EtOH，23°C,12h;(v)EDC，NHS，1，4-二氧杂环己烷，23°C，2h;(vi)Et3N，胱胺盐酸盐，1，4_二氧杂环己烷_甲醇，23。C，2h;(vii)HCl，CH2Cl2-MeOH，60°C，2h(由化合物7开始，收率为36%)。这些全合成方法皆以很低的总产率得到Psaramap1inA。一个最近的合成PsammaplinA的方法将被述及，其免除了肟基的保护_去保护步骤，并且以较高的产率进行(Godert，A.M.et.al.，Bioorg.Med.Chem.Lett.2006，16，3330-3333)。本发明的另一个目的在于发现一种简单的合成PsammaplinA衍生物的方法，其具有较高的收率，并且可能容易工业化。现在，本发明人发现-种新颖的用于合成2-取代吲哚-氨甲酰型的PsammaplinA衍生物的方法，该方法快速、简单、并且收率高。当结构式中W为-CO-Nil-时，本发明方法的特征在于其包含如方案3中描述的至少一个步骤，其中<formula>formulaseeoriginaldocumentpage12</formula>(II)方案3在方案3中描述的合成方法，开始于吲哚(II)与大约一个当量的由对应的溴代肟原位产生的亚硝基丙烯酸酯CH2=C(N0)-C00Z进行烷基化反应，其中Z代表选自下组的基团C「C6烷基、苯基、芳基例如苯甲基(Gilchrist,T.L.;RobertsT.G.,J.Chem.Soc.PerkinTransI，1983，1283-1292)。所述溴代肟是由已知的方法通过乙基溴代丙酮酸酯与盐酸羟胺反应而制备的。优选反应在碱性介质中、在溶剂中、室温下进行。该溶剂可以是氯化溶剂如CH2C12、CHC1^或C1CH2-CH2C1，或者溶剂可以是硝基乙烷、或二氧杂环己烷。使用的碱可以是金属碳酸盐、金属碳酸氢盐、或氢化钠。优选地，我们使用碳酸盐，比如K2C03或Na2C()3。反应进程用TLC(薄层色谱)或(HPLC)(高效液体色谱)检测进行跟踪，并且可以持续-一至数小时，这取决于取代基、溶剂和温度。较好地，Z选自烷基(伯烷基、叔烷基)，或者可以是苯甲基。Z优选乙基。当W不是-CO-NH-时，本领域的熟练技术人员通过使用常识将会容易地调整该方法。例如，在肟的保护和皂化后,硼氢化物将酸还原成醇类从而制备出醛类，并且由它们通过HornerWadsworthEmmons反应制备出不饱和的类似物(W:CH=CH)。较好地，该第一步之后进行方案4中描述的工艺(I)方案4<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>当结构式中i=j=1时，将该方法调整为根据方案5产生对应的结构式(I)的分子<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>方案5与胺H2N-(CH2)n-S-R起反应，并且使肟官能团去保护，可得到化合研究了PsammaplinA衍生物在细胞癌模型中的下述生物学效果-诱导细胞周期停滞和程序性细胞死亡本发明的分子在U937急性骨髓性白血病细胞系中诱导增殖抑制(图la)和/或程序性细胞死亡(图lb)(图1)。它们还提高了细胞周期抑制剂p21WAFI/api的表达，已知该抑制剂是Gl所必需的、并且维持G2停滞(B皿z，F.etal.，Science.282，1497-501(1998))(图lc)。Psa鹏aplinA及其两个衍生物5008和5010的抗增殖和致细胞凋亡作用还在实体癌细胞系比如乳腺癌细胞(ZR75.1)和前列腺癌细胞(LnCap;数据未显示；参见图6)中得到证实。-UVI5008是强有力的HMC抑制剂观察到了组蛋白H:3乙酰化(图Id)和HDAC抑制(图le，泳道6,7)。-UVI5008可抑制在肿瘤抑制基因pl6INK4lnMRP2的启动子区域中的DNA甲基化为了研究是否UVI5008会具有附加的活性，研究了抑制肿瘤抑制基因的启动子DNA甲基化的可能性。使用甲基化特异性的PC:R(MSP)，观察发现未甲基化的MR132的显著增加(图2a)。相伴随地，未甲基化的pl6"Ma启动子DNA的含量增加了(图2b)。与pl6INK4a启动子的脱甲基化保持一致地，通过暴露于本发明的分子，使？16皿43基因表达解除沉默，并且该表达可与在5-脱氮胞苷与SAM的组合中所看到的表达相比较(图2c)。最后，体外使用DM甲基转移酶(D層T)的测定，证实结构式(I)的分子是:[)NMT抑制剂(图2d)。-UVI5008改变了在编码可诱导死亡配体的肿瘤选择性程序性细胞死亡的TRAIL基因座处的染色质的乙酰化状态值得注意地，U937骨髓细胞暴露于结构式(I)的分子可导致在TRAIL启动子处的染色质快速剧烈的H3K9乙酰化,并且在第一内含子处还有延迟动力学(图5a)。这种"激活性"染色质标记与mRNA(图5b)和蛋白质(图5b)水平的提高的表达相关，分别如RT-PCR和ELISA分析所示。-HDAC活性的结构_活性关系(SAR)研究为了开始上述UVI5008的HMC抑制剂活性的SAR研究，合成一系列衍生物(图7)。被系统地研究的活性读数是细胞周期停滞和p21，^m诱导、分化诱导和靶(在为a-微管蛋白的情况下)的乙酰化。-Ps扁即linA衍生物诱导AML病人未成熟细胞的程序性细胞死亡—些Psamm邻linA衍生物的抗癌潜力促使我们测试它们体表外对病人未成熟细胞的活性。如图4所示，当通过在不同病人的4个单独的体表外培养物中(AML病人#—102、#_108、#_109、#_116)胱天蛋白酶3激活测定进行测量时，结构式(I)的分子诱导了未成熟细胞的细胞周期停滞和程序性细胞死亡。所有测试的衍生物在两个不同的病人未成熟细胞样本中都显示出细胞凋亡活性。图1:a)用在1和5uM的浓度下使用的显示的化合物处理U937细胞30hrs后的细胞周期分析；b)在显示的化合物处理U937细胞24hrs后的胱天蛋白酶3凋亡测定；c)在用显示的化合物处理6和16hrs后微管蛋白乙酰化和p21表达水平；总的微管蛋白表达水平被用于相等的加载；d)在用显示的化合物处理6和16hrs后组蛋白H3乙酰化和K9H3甲基化表达水平；总的微管蛋白表达水平被用于相等的加载；e)在用显示的化合物处理6和16hrs后K9、K14、K18组蛋白H3乙酰化表达水平；总的ERKs表达水平被用于相等的加载；f)HI)AC1酶的测定将IP-:HDAC1与显示的抑制剂一起孵育24hrs;活性被测量为3:H乙酰基脱去；g)HMC4酶的测定将IP-HMC4与显示的抑制剂一起孵育24hrs;活性被测量为3H_乙酰基脱去。图2:a)在用显示的化合物处理16和24hrs后，对MRP基因进行甲基化特异性PC:R;b)在用显示的化合物处理24hrs后，pl6基因进行甲基化特异性的PCR。样本是真实复本的样本；c)在用显示的化合物处理24hrs之后的在U937细胞中的pl6表达水平；d)用1.5和50iiM显示的化合物进行D丽T酶的体外测定。图3:a)在用显示的化合物处理24hrs之后，在U937细胞中进行细胞周期和程序性细胞死亡分析；数值是单独的一式三份的平均值；b)在用显示的化合物处理的U937细胞中进行CDllc表达分析；数值是独立复本的中值；c)在用显示的化合物处理24hrs后的U937细胞中的微管蛋白乙酰化和p21表达水平；总的ERKs表达水平被用于相等的加载；d)在(c)中所示条件下的组蛋白H3的乙酰化。图4:a)在来自用编号识别的AML病人的体表内样品中进行的细胞周期分析和程序性细胞死亡；b)在用显示的化合物处理20hrs之后，#j16AML细胞的细胞周期分析、程15序性细胞死亡和组蛋白H3乙酰化水平。图5:a)在用UVI5008处理所示时间过程之后的U937细胞中，用芯片和qPCR进行TRAIL启动子调节区域和TRAIL基因第一内含子的组蛋白H3乙酰化水平分析；"NoAb"代表阴性对照；b)在与UVI5008—起孵育显示的时间之后的TRAILmRNA表达；G6PDH水平已经用于相等的加载；c)通过ELISA测定法测量的在用UVI5008处理24hrs后的U937细胞中TRAIL蛋白质表达水平。图6:A375、DU145、HCT116和MaTu细胞系对HMC抑制剂的敏感性。细胞在存在SAHA，MS275或UVI5008(0.luM、0.3uM、luM、3uM、10uM)的条件卜'进行孵育。(a)在48hrs后通过使用MTT测试法确定细胞生长情况。结果被显示为与对照物相比较的存活率百分比，并且代表表示三次测量的平均值士SD(标准偏差)。(a)通过A:P()2.7染色确定在培养48hrs时凋亡细胞的百分比。结果代表一式三份测量的平均值±SD。图7:被测试分子列表。图8a:用SAHA、MS-275和UVI5008处理A-375细胞系的剂量反应曲线，计算IC.5。(5()^感染浓度数)值。图8b:用SAHA、MS-275和UVI5008处理HCT-116细胞系的剂量反应曲线，计算IC5。值。图8c:用SAHA、MS-275和UVI5008处理DU-145细胞系的剂量反应曲线，计算IC5。值。图9A:HCT-116异种移植的归一化的动物体重轮廓。图9B:HCT-116异种移植的归一化的肿瘤重量轮廓。图10A:YQKSTELLIR的MS/MS分裂。图l()B::H3K56ac的MS识别。图11:选择编号的组蛋白改进型的SILAC蛋白质组分析。图12:图A和B皆为使用可特异性地识别H3的乙酰化的K56的抗体进行的Westernblot分析。图13A:用对照物的s:[RTi和s:[:RT2活性百分比，对照物是苏拉明钠--一种去乙酰化酶(Sirtuin)抑制剂；白藜芦醇一一种SIRT1激活剂，以及用浓度为50yM和5uM的UVI5008的SIRT1和SIRT2活性百分比。图13B:用鬼臼亚乙苷(etoposide)单独处理的、或者当存在Sirtinol(—种已知的SIRT2抑制剂)时处理的MCF7细胞的Westernblot;以及用浓度为50uM禾B5uM的UVI5008处理的MCF7细胞的Westernblot。具体实施例方式合成合成方法(方案6)从吲哚21与亚硝基丙烯酸酯22的垸基化反应开始(Gilchrist,T.L.;RobertsT.G.，J.Chem.Soc.PerkinTransI，1983，1283-1292)，其中，亚硝基丙烯酸酯22由通过乙基溴代丙酮酸酯24与盐酸羟胺进行反应而制备出来的溴代肟23原位产生。该烷基化反应还得到了由在C3位的两个连续侵入而得到的环加合物(cycloadduct.)26。通过硅胶柱层析(AcOEt/'己烷40:60)将它们分开。该反应因此具有作为3取代吲哚的烷基化反应方法的潜力。在优化后，反应产物25的产率被提高到67%(参见下表)。方案6<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>方案6.试剂和条件(i)24，CHC13，NH20H+HC1，MeOH25°C(86%);(ii)K2C03，CH2C12，25°C，20h(参见表1)。表l26aX=H26bX=BrH0(1:l)，22h，项目23(当量)B引哚(当量)Na2C03(当量)产率(%)21:23:25:261121a(I)0.417:11:40:421.7521a(1)0.40:0:47:163121a(1)5.50:0:47:224221a(2)5.5nd:0:67:75221(2)5.535:0:60:4化合物25a和26a的结构用X-射线晶体衍射证实然后通过与三苯甲基氯的反应，将化合物25a和25b转化为被保护的躬26(方案6)，水解，并且通过活化与胱胺偶联为N-琥珀酰亚胺酯(Nicolaou，K.C.etal.，Chem.-Eur.J.2001，7，4280-4295)。裂解三苯甲基保护基，然后由化合物25出发经4个歩骤以43%和50%的产率得到29a和29b。17方案7C02BCO,H25aX=H,R=H25bX=Br,R=H26aX=H,R=Tr26bX=Br.R=Tr28aX=H,R=Tr，28bX=Br,R=Tr29aX=H,R=H29toX=Br,R=HIV方案7.试剂和条件(1)1(20)3，CH2C12，TrCl，25°C,20h(97%，26a;74%,26b);(ii)LiOH*H20，THF:H20(1:1)，25°C，20h(90%，27a;99%，27b);(iii)i.EDC，NHS，二氧杂环己烷，25"，2h;ii.胱胺，Et3N,甲醇，二氧杂环己烷，25°C，15h(64%,28a;84%,28b);(iv)在Et2()中的2MHC:I.,CH2C12，25°C，2h(78%，29a;81%,29b)。用大体积基团的保护不会改变肟27的立体学E值，这通过X射线结构检测得到证实。以同样方式通过与一系列二胺相偶联而合成具有不同链长的类似物(方案8)。方案S》、RO28aX=H,R=Tr28bX=Br,R=Tr13an=313bn=413ert=513dn=6NH:加aX=H,R=Tr30tiX=Br,R=Tr31aX=H31bX=Br—I方案8.试剂和条件:(i)i.EDC，NHS，二氧杂环己烷，25"C，2h;ii.13,Et3N，甲醇，二氧杂环己烷，25t:,15h;(iv)在EtW中的2MHCl，CH2Cl2，25°C，2h。各个步骤的产率总结于下述表2:表2<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>该方法也被开发，用于制备整个系列的溴代吲哚异构体。这些溴代吲哚通过应用Leimgruber-Bat.cho的方f去(Moyer，M.P.etal.，H.J.Org.Chem.，1986，56，5106—5110)或者通过Bartoli工艺(Nicolaou，K.C.etal.，J.Am.Chem.Soc.2004，126，12888-12896)而被合成。在如上所述同样的步骤之后，得到了围绕溴代吲哚区域异构体而构造的一系列Psammaplin类似物(方案9)。方案932a4-日r,R:H32b6-日r,R=H32c7-Br,R=HNOH23,C02EtC02Et.C02H33a4-Br,R=H3%6"Br,R=H33c7-日r,R=H34a4-Br,R=T『34b6-Br,R=Tr34c7-Br,R=Tr35a4"Br,R=Tr35b6-Br,R=Tr35c7-Br,R=Tr36a4-Br,R=Tr■36b6-Br,R=Tr36c7-Br,R=TrI37a4-Br,R=H37b6-Br,R=H37c7-Br,R=H方案9.试剂和条件(i)23，K2C03，CH2Cl2，25°C，20h(65%，33a;43%，33b，41%，33c);(ii)K2C03,CII2C12，TrCl,25°C，20h(74%,34a;51%,34b,41%，34c);(iii)LiOH*li20，T:HF:H2()(1:I),25°C，2()h(82%，35a;97%，35b;91%，35c);(iv)i.EDC，NHS，二氧杂环己烷，25。C，2h;ii.胱胺，Et3N，甲醇，二氧杂环己烷，25。C,15h(67X，36a;77%，36b，50%，36c);(v)在EtW中的2MHCl，CH2Cl2，25°C，2h(81%，37a;54%，37b;60%，37c)。类似地，通过酸28b与胺38和41偶联,合成了其他的化合物(方案10)。有必要使用三氟乙酸(TFA)用于化合物39中三苯甲基的裂解(Glinka,T.etal.,Bioorg.Med.Chem.2003，11，59卜600)。19方案i0<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>方案10.试剂和条件(i)i.EDC,NHS,二氧杂环己烷，25。C,2小时；ii.38或41，Et3N，甲醇，二氧杂环己烷，25°C,15h(74%，39;63%，42);(ii)TFA，CH2C12,0°C至25°C，lh(50%);(iii)THF:HC02H:H20(7:2:1)，19h，25。C(99%);(iv)在Et20中2MHCl，CH2Cl2，25°C，2h(59%)。合成的其他化合物是苯甲基保护的肟(Rutger，R.P.etal.,J.Chem.Soc.PerkinTransI，1987,2473-2480)(方案11)和通过用NaBH:4还原二硫化物和用Me]:进行甲基化反应而得到的甲基硫化物(方案12)(Rut.ger，R.P.etal.，J.Chem.Soc.PerkinTransI1987,2473-2480)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>方案11.试剂和条件(i)BnBr，K0tBu，DME，12h，25。C(72%);(ii)LiOH*H20，THF:H20(1:1)，25°C，20h(99%);(iv)i.EDC，NHS，二氧杂环己烷，25°C，2h;ii.胱月安，Et3N,甲醇，二氧杂环己烷，25。C，15h(80X)。方案1229b48方案12.试剂和条件(i)i.NaBH4，NaOH，Et0H，25。C,0.5h;ii.Mel，25°C，16h，25°C(80%)。物應A-方法:-细胸j奢养:人白血病细胞系U937在补充有10%FBS(胎牛血清;Hyclone公司)和抗生素(100U/mL青霉素，100iig/mL链霉素和250ng/mL两性霉素-B)的RPMI培养基中进行增殖。保持细胞处于2()()0()()个细胞/每毫升培养基的恒定浓度。对于A亂样本，使用Ficoll对含有80%至90%白血病未成熟细胞的骨髓进行纯化。该研究获得那不勒斯第二大学伦理委员会的批准。-配体和材料将SAHA(Alexis公司)被溶于二甲亚砜，并且在5X10—6M的浓度下使用。将MS-275(ScheringAg公司)溶于乙醇，并且在5X10—6M浓度下使用；丙戊酸(VPA;Sigma公司)在ImM的浓度F使用。将描述的所有其他化合物溶于DMSO(Sigma-Aldrich)，并且在1或5iiM的浓度下使用。-细胞周期分析收集2.5X105个细胞，并且再悬浮于500UL的低渗缓冲液(0.1%TRITONX_100、0.1X柠檬酸钠、50ug/mL碘化丙啶，RNaseA)中。将细胞避光孵育30min。通过使用细胞搜寻软件(CellQuestsoftware,BectonDickinson公司)，在FACS-Calibur流式细胞仪上获取样品，并且使用细胞搜寻软件(BectonDickinson)和ModFitLTversion3软件(Verity公司)用标准方法进行分析。所有实验皆进行3次。-程序性细胞死亡的FACS分析按照供应商的建议，用胱天蛋白酶3活性检测法(B-桥)测量程序性细胞死亡，并且通过FACS(BectonDickinson)进行定量。-粒细胞区分粒细胞区分按如F方法进行。简言之，收集U937细胞，并且再悬浮于10liL结合藻红蛋白的CD1lc(CD11c-PE)中。将对照样与10iiL结合PE的小鼠IgGl一起孵育，在4°C下避光孵育3()min,在PBS中洗涤，并且再悬浮于500uL含有碘化丙啶的PBS(0.25ug/mL)中。用细胞搜寻技术(BectonDickinson)通过FACS对样品进行分析。将碘化丙锭(PI)阳性细胞排除在分析之外。-Westernblot分析根据抗体供应商下述建议的标准方法进行Westernblot分析。为了测定21p21WAF1/apl和pl6INK4，将100"g总蛋白提取物在15%聚丙烯酰胺凝胶上进行分离，并且进行印迹分析(blot)。Westernblot显示了p21(TransductionLaboratories,稀释度1:500)，pl6(SantaCruz)，并且使用总的ERK(SantaCruz)来归一化，用于相等的加载。对于a-微管蛋白乙酰化，将25ug总蛋白提取物在1()%聚丙烯酰胺凝胶上进行分离，并且进行印迹分析。Westernblot显示了乙酰化a-微管蛋白(Sigma，稀释度l:500)，并且使用总的ERK(SantaCruz)或者总的微管蛋白(Sigma)来归一化，用于相等的加载。-基因组DNA的分离将细胞再悬浮于15()uL的TE(TrislOmM-EDTAIraM)中。加入l.5mL溶菌缓冲液(lOmMTrispH8.0-0.ImMEDTApH8.0-0.5%SDS-20ug/mL无DNA酶的Rnase(核糖核酸酶))，并且在37tT下孵育lh后，在56。C下用终浓度为100ug/mL的蛋白酶K进行第二次孵育过夜。通过苯酚-氯仿萃取法除去蛋白质。用0.2体积的10m乙酸铵和2体积乙醇沉淀基因组DM,并且在l-30()()rpra下离心5min。用70%乙醇洗涤DNA团粒，晾干，并且再悬浮于在振动台(rockingtable)上的无核酸酶的4t!水中。于260nm下测量浓度。-基因组DNA的消化用50UEcoRV和PvuII(在MR|32启动子中不切割)将40yg的基因组DNA在37。C下消化过夜。通过苯酚-氯仿萃取法除去蛋白质，沉淀DNA，并且用40uL经过滤的水再悬浮。-基因组DNA的体外甲基化当存在SAM3，2mM终浓度时，在37°C下于2hrs期间，用8U的Sss1甲基化酶(NewEnglandBiolabs公司)使20ug经消化的DM甲基化。在苯酚—氯仿萃取后，沉淀出DNA,并且用20uL经过滤的水再悬浮。-亚硫酸氢盐处理和用于RARP甲基化的PCR:将20iig基因组DNA(或者体外甲基化的DNA)与5.5yL的3MNaOH混合，用经过滤的水把体积调节到55.5iiL。在42'C下孵育15rain后，加入500uL含有0.()5M对苯二酚的3M亚硫酸氢钠溶液。将混合物在54t:下孵育16h。用Nucleospin提取纯化试剂盒纯化经修饰的DNA，并且在50iiL经过滤的水中洗脱。用5.5uL的3MNaOH在室温下于15min内，使洗脱液去磺酸化。加入16.8yL的10M乙酸铵、1uL的GlycoBlue和200iiL乙醇，用于沉淀I)NA。经离心后回收I)NA，洗涤，晾干，并且用50uL经过滤的水再悬浮。按如下进行PCR:94。C下变性5min;35个循环;94t!下变性lmin。对于甲基化引物，于57.5。C下退火lmin;而对于未甲基化的引物，于52。CF退火lmin。72tT下延伸lmin。72°CF再延伸5min。在1,5X琼脂糖凝胶上分析PCR产物a0yL+5yL加载的染料)。RAR"甲基化引物正义链5'TCGAGAACGCGAGCGATTCG;反义链:5，GACCAATCCAACCGAAACGA;RARP2未甲基化引物正义链5，TTGAGAATGTGAGTGATTTG反义链5，AACCAATCCAACCAAAACAA-亚硫酸氢盐处理和用于p16甲基化的PCR按如下所述进行DNA萃取。按供应商(Chemicon)描述的方法进行亚硫酸氢盐处理和用于pl6甲基化测定的PCR。22-MTT细胞毒性测定以每孔8000个细胞的浓度将HCT-116、A_375和DU-145细胞铺入96孔的透明细胞培养分级平板(Corning公司)中。平板被保持在湿润的C02(5%)培养箱中过夜，以使得细胞贴附于底部。第二天早晨，以100、300、1000、3000和l()()()OnM的浓度加入化合物(SAHA、MS-275和UVI5008)，并且再次将平板在5%C02培养箱中保持48h。在完成48hrs处理后，从每个孔中除去含有化合物的培养基。将0.5mg/mLMTT(Sigma公司)溶于培养基中，并且加至每个孔中，并且将平板孵育2hrs。存活的细胞可将MTT四唑环裂解成深蓝色甲簪反应产物，然而死细胞保持无色。轻轻地除去含有MTT的培养基，并且在每个孔中加入DMS()。在摇动后，读取平板在540nm处的吸光度。所有结果被表达为三个孔的平均值。测量每个化合物的百分比细胞毒性，并且表示为其IC5。数值。-通过抗AP02.7单克隆抗体进行荧光活化细胞分类器(FACS)分析通过AP02.7(7A6)表达分析TC程序性细胞死亡的诱导，所述表达可优先地与正在凋亡的细胞中38kDa线粒体膜蛋白质反应，并且通过跟踪细胞成活性和细胞凋亡应答而确定(Koester，S.K.etal.，Cytometry29,306-12，1997;Zhang，C.，Ao，Z.，Set.h，A.&Schlossman，S.F.,JImmunol157，3980-7,1996)。将A375、DU145、IICT116和MaTu细胞系与SAH:A(l、3、10uM)、MS275(1、3、10uM)或UV]:5()()8(1、3、10uM)一起孵育48h。在胰蛋白酶消化后，在PBS中洗涤已被或未被处理的细胞--次。然后将细胞用含有2.5%FCS和100ug/mL毛地黄皂苷的PBS在4°C下孵育。在洗涤后，将细胞与结合有小鼠抗人AP02.7藻红蛋白的mAb(贝克曼考尔特公司)一起孵育。洗涤细胞，并且再悬浮于PBS/2.5XFCS中，并且通过FACSort(BectonDickinson)进行分析。使用CellQuest软件(BectonDickinsonlmmunocytometry系统)，分析被标记的细胞的AP02.7表达。-UVI5008的体内抗肿瘤活性我们通过在无免疫应答的小鼠体内异种移植HCT-116结肠恶性肿瘤细胞，检査了该化合物的体内抗肿瘤活性。材料和方法SAHA，一种PanHDAC抑制剂由默克公司赠送；MS_275，一种I类HDAC抑制剂，由Schering公司赠送；以及UVI5008,按上述公开的方法合成。所有体内研究中的小鼠是购自CharlesRiver公司的无胸腺雌性裸鼠(无毛鼠)Crl:Nu(]:co)-Foxnlnu小鼠(swiss)。剂量的制备将所有的化合物溶于8%二甲亚砜+2.5%吐温80+89.5%油中。伴随着这三种剂量，我们还采用了赋形剂对照物。试验设计将4X106个HCT-116结肠恶性肿瘤细胞皮下注射于每个动物的左侧侧腹。当肿瘤生长至4mm大小时，将动物随机分布在4个组的各组中，以使得每个组含有在处理之前具有肿瘤大小大约相同的动物。通过腹膜内注射的途径提供药物。早期的测试显示,剂量为3()mg/kg小鼠的SAHA对于小鼠而言无法忍受，并且观察到60%的死亡率。因此，通过将剂量减少至20mg/kg而进行对比研究。剂量为30mg/kg的UVI5008被更好地忍受，并且在较早的研究中未观察到死亡率；因此将剂量增加到40mg/kg，并且MS-275被以20mg/kg的剂量作为SAHA给药。每隔一天提供治疗。在每个组中有10只动物。使用游标卡尺测量法确定肿瘤大小。使用下述公式确定肿瘤体积TV=(a2Xb)/2(其中，a代表肿瘤宽度，b代表肿瘤长度)。-UVI5008对人类SIRT1和SIRT2的活性:使用人重组S]:RT1和SIRT2进行S]:RT活性测定。在存在NAI)+和各种浓度的受测化合物(去乙酰化酶(Sirtuins)激活剂或抑制剂)的条件下,将SIRTl(lU/孔)或SIRT2(5U,Z孔)分别与SIRTl/2底物(相当于p53乙酰化肽)一起孵育(37tT下lh)。活性被测量为荧光强度。作为内部对照，已经包括苏拉明钠一一种去乙酰化酶(Sirtuin)抑制剂、以及白藜芦醇--一种SI::RT1激活剂。在具有36()nm激发装置和46()mn发射检测装置的荧光阅读器(I即hinit.e200TECAN)上测量荧光。-UVI5008对于p53乙酰化的活性按标准方法培养MCF7细胞(人乳腺癌细胞)，并且当存在25liM鬼臼亚乙苷时用显示的化合物处理6hrs。总蛋白提取物在SDS凝胶上跑胶，并且进行印迹分析。使用抗p53ac382(Abcam)按标准方法进行Westernblot.。ERKs(SantaCruz)被用于相等的加载对昭。"、、o-当细胞用UVI5008处理时对于组蛋白蛋白质的翻译后修饰的研究在存在赖氨酸和精氨酸("轻")或者同位素标记的赖氨酸和精氨酸--Argl()和Lys8("重")的条件下，在RPMI培养基中培养U937细胞。用终浓度为5uM的UVI5008或SAHA处理在轻型培养基中培育的细胞24h。作为对照，用匿S0处理在重型培养基中培育的细胞24h。轻型和重型细胞被收集7.5Xl(f个细胞，并且以1:l的比率混合(总计为i5xi()6个细胞)。用PBs洗涤细胞两次,并且细胞团粒在-s(rc下储存。-组蛋白提取细胞被再悬浮于750liL的TRITON提取缓冲液(TEB:含有0.5%TritonX100的PBS(v/v)，2mM苯基甲基磺酰基氟化物(PMSF)和0.02%(w/v)NaN3)，并且在温和搅拌下在冰上溶解l()rain。将溶解产物在60(X)rpm下离心l()niin，并且弃去上清液。用375uL的TEB洗涤团粒，并且如前所述通过离心形成团粒。团粒被再悬浮于20"L的250mM盐酸中，并且在4°CF对组蛋白进行酸萃取过夜。-质谱分析通过离心澄清经提取的组蛋白，并且在15%丙烯酰胺凝胶上分离，凝胶用考马斯亮蓝染色。切出含有组蛋白的凝胶区域,在凝胶中进行还原和烷基化。蛋白质用胰蛋白酶(Promega公司)消化过夜。用三氟乙酸从凝胶中洗脱出肽。使用在线连接于7_泰斯拉线性四极离子阱傅里叶变换(FT)质谱仪(ThermoElectron公司，不来梅,德国)的纳米高压液相色谱Aligent1100纳米流系统，从全部20uL中排序出8uL。通过施加30分钟梯度，从C18柱子中洗脱出肽，从而缓冲液B从3%增提高到40%，流量为30L/min。将Mascot.算法用于识别肽/蛋白质。-Mascot搜索条件MS/MS离子搜索酶胰蛋白酶固定化修饰氨甲酰甲基(C)可变的修饰乙酰基(K)、Arg重型6C134N154(R)、二甲基化(K)、二甲基化(R)、24GlyGly(遍在蛋白化(ubiquitination))(K)、Lys+86C132N15(K)、甲基(K)、甲基(R)、氧化(M)质量值单一同位素值蛋白质质量无限制肽质量公差士10ppm片段质量公差±0.8Da最大脱漏分裂3仪器类型ESI-TRAP用UVI5008处理U937细胞24hrs，并且对组蛋白进行酸萃取。蛋白质用胰蛋白酶消化，并且使用在线连接于FT-ICR质谱仪的纳米液相色谱(nanoLC)来分析肽。使用Mascot算法,基于其亲本离子质量和其分裂模式来识别肽。b-或y-离子的质量列举在表中(图l()b)。粗体特征显示的质量以高质量精度地符合预计的YQKSTE[丄I:P肽的片段。-Westernblot分析使用可特异性地识别K56乙酰化的抗体进行分析，A).将等量的用溶剂二甲亚砜(泳道1和2)或用UVI5008(泳道3和4)处理24hrs的从U937细胞(图12A中泳道1和3)和U2()S细胞(图12A中泳道2和4)中提取的组蛋白加载于SDS凝胶上。箭头指示组蛋白H3的位置，B).用溶剂(图12B中-)或者用UVI5008(图12B中+)处理U937细胞5分钟、30分钟、或者1、2、3或4hrs。相同的印迹用组蛋白H3核抗体显影、剥离、并且用H3K56乙酰化特异抗体再探测。B-结果:-MTT细胞毒性测定表示为其IC5。数值的百分率细胞毒性如下表3所示。表3:使用MTT细胞毒性测定得到的在三个不同的癌细胞系中SAHA、MS-275和uv]:5()()8的[Cs。值<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>-细胞周期停滞和程序性细胞死亡的诱导Psa,plinA(UVI5000)和其衍生物(UVI5004、UVI5008、UVI5010)(图7)i秀导了在U937急性骨髓性白血病细胞系(图1)中的增殖抑制(图la)和/或程序性细胞死亡(图lb)。这些化合物诱导了细胞周期停滞,其范围为从在G1中的阻断(luMUVI5010)至在S和G2阶段中的停滞(UVI50()()、UVI5004、UV]:5008)。显著地，对于一些化合物比如UVI5010而言，在细胞周期内存在-种特征性的依赖剂量的阻断位置转换。UVI5010在G1中在luM下阻断细胞，并且在G2-M中在5"M下会使细胞停滞(图la)。UVI5008于1iiM下在G2-M中使细胞停滞的方面是特别的。这些数据建议，这些UVI化合物会以不同的效果影响细胞周期的数个检查点(checkpoint)。与细胞周期影响一致，已知为Gl所必需的并且维持G2停滞(B腿,F.etal.,Science,282,1497-501(1998))的细胞周期抑制剂p21WAF1/eipl的表达被显著地提高，如UVISOOO、UVI5008和UVI5010的结果所示(图lc)。除影响细胞周期进展之外，UVI化合物诱导了程序性细胞死亡，尽管程度有很大不同。有趣的是，对G2-M停滞有最明显影响的那些化合物也产生了最强的致细胞凋亡影响(图ib中uvi:5()0()、uv]:5()()8uv]:5()1())。Ps翻aplinA及其两个衍生物5008禾口5010的抗增殖和致细胞凋亡作用还在实体癌细胞系比如乳腺癌细胞(ZR75.1)和前列腺癌细胞(LnCap;数据未显示；参见图6)中得到证实。-LTVISOOS是强有力的:HDAC抑制剂:Ps翻邻linA(uvi5000)被认为是很弱的组蛋白脱乙酰基酶抑制剂，并且U937细胞暴露于UVI5000会导致组蛋白H3乙酰化适度的随时间而增加(图ld，泳道2、3)。该活性被UVI5008显著地增强(图1d，泳道4、5)，同时UVI5010未明显地影响球状113的乙酰化(图1d，泳道6、7)。对于特定的组蛋白乙酰化的影响，与球状:H3的乙酰化相类似，，如对于H3K9、H3K14和H3K18的乙酰化，当存在UVI5008(图le,泳道4、5)时全部增加，而用亲本化合物UVI5000(图le，泳道2、3)时增加程度较小。。有趣的是，即使对UVI5010未测得其影响球状组蛋白H3乙酰化，该化合物确实可用作HMC抑制剂，因为其可增强H3K18乙酰化，并且程度较小地增强H3K14乙酰化(图le，泳道6、7)。H3K9的甲基化作用与乙酰化反向相关，其通常被认为是-一种在启动子处的"转录激活"修饰，而甲基化作用是"沉默性"修饰。与此相一致，通过暴露于UVI5008，H3K9的甲基化被降低(图ld中间的一组；将泳道1与泳道4和5相比较)。UVI5008及其母体化合物UV:I:5()()0在体外测定中同样展示出:HDAC抑制剂活性。实际上，虽然UVI5000仅是很弱的HDAC1抑制剂，UVI5008却可几乎定量地并且最显著地阻断HDAC1活性，比确立的I类选择性HMC抑制剂一目前进入II期临床试验的MS275更有效(图lf)。另外，同样是脱乙酰基酶活性IIDAC4--II类IIDAC的一个成员，几乎完全被UVI5008阻断，而UVI50(K)仅展示出适度的活性(图lg)。与观测的这一现象保持一致地，UVI5008(以及UVI5000和UVI5010)抑制了HDAC6—另一种其底物是a-微管蛋白的II类HMC的活性(图lc，中间一组，将泳道1与泳道2-7相比较；注意，在该组中总a-微管蛋白的量在下面用于对比)。这些数据共同显示，UVI5008具有全IIDAC抑制剂作用，其具有同时阻断]:类和n类:HDAc的活性。重要的是，在该测定中uv]:5()()8比saha(伏林司他(vorinostet)，Zolinza)更有活性，后者已经被批准用于皮肤的t细胞淋巴瘤治疗并且处于其他适应症的临床试验中。-UVI5008抑制在肿瘤抑制基因pl6皿和MRg2的启动子区域中的DNA甲基化:为了研究是否UVI5008会具有附加的活性，研究了抑制肿瘤抑制基因的启动子DNA甲基化的可能性。MR132的启动子已知通过在其启动子中CpG岛的甲基化而被沉默。使用甲基化特异性的PCR(MSP)，观察发现使用UVI5008时未甲基化的MRP2的显著增加(图2a)。类似地,MSP显示了在pl6INK4a启动子处CpG岛甲基化的下降，该启动子是另一个非常确实的肿瘤抑制基因和细胞周期调控子。相伴随地，通过用UVI5008处理，未甲基化的pl6工，启动子DNA的含量增加了(图2b)。该情况下，UVI5000也展示出类似的活性。显著地，经典的DNA甲基转移酶抑制剂5-氮胞苷("AZA")显示出非常类似于UVI5008的活性，而SAHA是无活性的(图2b)。与pl6皿"启动子的脱甲基化保持一致地，通过暴露于UVI5008、较小程度暴露于UVI5000和UVI5010,可以使pl6INK4a基因表达解除沉默；并且该表达可与在5-脱氮胞苷与SAHA的组合中所看到的表达相比(图2c)。最后，使用体外DNA甲基转移酶(D醒T)测定，证实了UVI5008是DNMT抑制剂，其活性几乎与RG108—样，虽然RG108浓度更高些(图2d)。-UVI5008改变了在编码可诱导死亡配体的肿瘤选择性程序性细胞死亡的TRAIL基因座处的染色质的乙酰化状态我们的前面的工作己经显示，HDAC抑制剂比如MS275可诱导TNF相关的程序性细胞死亡的表达，在造血细胞系中和病人未成熟细胞中诱导配体TRAI:L(也被称为Apo2L或TNFSF10)((Insinga，A.etal.，Nat.Med11，7卜6(2005);Nebbioso，A.etal.，Nat.Med11，77-84(2005))。显著地，U937骨髓细胞暴露于UVI5008可导致在TRAIL启动子处的染色质快速剧烈的H3K9乙酰化，并且在第一内含子处还有延迟动力学(图5a)。这种"激活性"染色质标记与mRNA(图5b)和蛋白质(图5b)水平的提高的表达相关，分别如RT-PCR和EL]:SA分析所示。-HMC活性的结构_活性关系(SAR)研究为了开始上述UVI5008的IiMC抑制剂活性的SAR研究，合成一系列衍生物(表1)。被系统地研究的活性读数是细胞周期停滞和p21WAF1/eiP1诱导、分化的诱导和靶(在a微管蛋白的情况下)的乙酰化。目的是理解特定结构要素和特定取代的作用，尤其是，是否(i)一个还是两个对称分子的单元对于生物活性是必须的？是否(ii)二硫桥是可有可无的或者不可缺少的？以及(iii)最后不可裂解的化合物是否将显示出某种什么作用。-溴取代的位置UV:I:5()()8具有附接于吲哚环上C5的Br。将C5取代变为C6取代(UVI5013)对细胞周期停滞和程序性细胞死亡(图3a)仅有很少的影B向，而是增强了通过CDllc标记表达而测量的分化的诱导(图3b)。如同期望的那样，p21WAF1/api与UVI5008相类似地被诱导，而通过a-微管蛋白乙酰化测量的HMC6的抑制稍微被降低了(图3c泳道9)。在C7处的:Br取代(UVI5014)微弱地降低了细胞周期停滞和程序性细胞死亡，但是p21WAF1/eiPI诱导的水平和a_微管蛋白乙酰化非常类似于使用UVI5008所看到的情形(图3a、b;图3c泳道12)。在C4处设置溴原子显著地降低了活性(UVI5012)。-肟后官能团是活性所必需的，因为三苯基甲基(三苯甲基)(UVI5018)和苯甲基(UV]:5()17)衍生物在所有的测定中是无活性的，如图3a、b和图3c(泳道13、14)所示。-二硫桥二硫桥的存在对于活性是必不可少的，因为硫被碳置换(UVI5019)得到了无活性分子(图3a、b和图3c泳道15)。这对于对应的UVI5000类似物(Psa咖邻linA)同样适用，比如UVI5022是S—C的取代产物，在图3a、b和图3c(泳道18)中显示的所有测定中是无活性的。因此，一个或两个硫原子、和/或二硫桥和/或活性UVI50(K)和UVI5008的分裂的存在是细胞周期停滞、程序性细胞死亡诱导和分化所必需的。-单体同系物UVI5008和所有的活性衍生物是二聚的可分裂的分子，其在还原反应中产生对应的硫醇。该硫醇对于活性是必需的，因为羟基衍生物UVI5021是无活性的(图273a、b和图3c泳道17)。对于UVI5023—UVI5000的羟基衍生物，观测到相同的情况(图3a、b和图3c泳道19)。然而，有趣的是，甲基硫酯UVI5020在诱导程序性细胞死亡和G2M停滞时是无活性的，但是其可诱导Gl停滞和相应的p21WAF1/eipl增强的表达(图3a、b和图3c泳道16)。-Ps薩即linA衍生物诱导AML病人未成熟细胞的程序性细胞死亡—些PsammaplinA衍生物的抗癌潜力促使我们测试它们体表外对AML病人未成熟细胞的活性。如图4所示，当通过在不同病人的4个单独的体表外培养物中(AML病人#—102、#—108、#—109、#J.16)胱天蛋白酶3激活测定进行测量时，两种Psamraap:1.inA(UVI5000)和UVI5008都可诱导未成熟细胞的细胞周期停滞和程序性细胞死亡。必须注意，众所周知的薩Ci's比如MS275和SAHA显示出类似于UVI5008的活性。为了证实二次产生的衍生物(secondarilymadederivative)对于体表外AML病人未成熟细胞的作用，我们测试了化合物UVI5(X)8、UV]:5()13、UVI5014和UVI5020在5uM的浓度下的活性。如图4所示，所有测试的衍生物在两个不同的病人未成熟细胞样品中都显示出细胞凋亡活性。注意，UVI5020仅显示出很弱的程序性细胞死亡诱导，这与上述改变的活性轮廓一致。-对癌细胞系A-375、DU145和IICT-116的抗增殖活性随UV]:5()()8的剂量反应曲线显示出对不同类型癌细胞系的抗增殖活性的潜力，IC5。值的范围为1.5至3iiM(图8a-c)。-UVI5008的体内抗肿瘤活性结果如图9A和9B所示。所有化合物使用的浓度是它们的最大忍受剂量。在任何一个治疗组中都没有致死发生。在UVI5008治疗组中有一些毒性征兆，10只动物中有3只呈腹膜内液累积的形态，因此它们的重量与其他的动物相比增大了。没有观察到其他的中毒症状。我们从些这实验推断，UVI5008相比于SAHA和MS-275在它们的MTD中显示出更大的抗肿瘤活性，并且没有一个化合物弓i起动物重量减少。归一化的肿瘤重量轮廓提供在表4中表4以mg计的归一化肿瘤重量轮廓(ii=10的平均值)<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>生长抑制百分率提供在如下所示表5中表5:在22天后的生长抑制百分率SAHA20mg/kg21±17MS-27520mg/kg35±12UVI:5()084()mg/kg56±7-当细胞用UVI5008治疗时对于组蛋白蛋白质的翻译后修饰的研究进行大量的质谱分析以识别组蛋白蛋白质的翻译后修饰，当用UVI5008处理细胞时这种修饰被诱导或除去。高精度的FT-ICR质谱仪允许我们确定组蛋白的各种翻译后修饰，包括明确的乙酰化肽的识别。用UVI5008处理U937(及其它)细胞导致乙酰化肽相对丰度的位移(SILAC研究)，以及导致识别出在组蛋白H3、H3K56中的新颖的乙酰化赖氨酸残基(图10a)。迄今为止，乙酰化的H3K56被我们及其他人单独地在低级真核细胞中检测至廿[OzdemirA，SpicugliaS，LasonderE，VermeulenM，Campst.eijnC，StunnenbergHG，LogieC，在酿酒酵母中作为乙酰化位点的组蛋白H3上赖氨酸56的表征。J.Biol.Chem.，2()05年7月15日;280(28):25949-52，Epub2005年5月10日]，并且在文献[OzdemirA，Mas聽toH，FitzjohnP，VerreaultA，LogieC，组蛋白H3赖氨酸56乙酰化染色体周期中新的缠绕。CellCycle,2006年11月;5(22):2602-8，Epub2006年11月15日]中进行了综述。在酵母中的研究显示，这种修饰实质上发生在所有新近合成的组蛋白中，在酵母S期期间该组蛋白被保藏进入染色质。K56乙酰化的去除发生在细胞周期中的G2/M期，并且取决于Hst3和Hst4这两个与依赖NAD+的组蛋白脱乙酰基酶Sir2有关的蛋白质。基于酵母的数据，测试了人Sirl和/或Sir2是否可以被UVI5008体外抑制，以及已知的Sir2底物的乙酰化即p53是否在UVI5008体内处理后被增强。-UVI5008对人S]:RT1和S]:RT2的活性结果如图13A所示。已经在2种不同的浓度下测试了UVI5008对人SIRT1和SIRT2的活性。作为对照，我们一直使用已知的激活剂和抑制剂比如白藜芦醇和苏拉明(A)。UVI5008清楚地显示出抗两者的抑制性能力。我们计算出UVI5008在SIRT1上的IC5。为8.9uM，并且在S]:RT2上为7.8yM。这些数据清楚地表明，UVI5008是较好的S]:RT1和SIRT2抑制剂。-些抗癌活性可能因此也是由于如同在其他癌细胞SIRT抑制剂中报告的这种作用。-UVI5008对于p53乙酰化的活性图13B显示了UVI5008对作为SI::RT抑制的读数的p53乙酰化水平的影响。该实验在MCF7细胞中进行，MCF7细胞在与鬼臼亚乙苷25iiM共处理以诱导DNA变化和激活p53中是p53WT。我们可能证实了UVI5008对p53的超乙酰化作用。29权利要求一种对应于结构式(I)的分子及其药学上可接受的盐其中n是选自于1、2、3、4、5、6、7、8的整数；i是选自于1、2的整数；j是选自于0、1的整数；当i＝2时，则j＝0；并且当i＝1时，则j＝1；X是卤素原子；W是选自下组的连接物-CO-NH-、-NH-CO-、-CO-O-、-O-CO-、-CO-S-、-S-CO-、-CH＝CH-、共价键；R是选自于下组的基团氢原子、C1-C6烷基、C1-C6羧基烷基；R1、R2、R3彼此可相同或者不相同，选自于下组氢原子、C1-C6烷基、C1-C6卤代烷基、卤素原子、羟基、C1-C6烷氧基、C1-C6氨烷基、C1-C6饱和杂环烷基、C6-C12芳基、C6-C20芳烷基、C4-C12杂芳基；R4选自于下组氢原子、C1-C6烷基、C2-C6酰基、C6-C12芳基、C6-C20芳烷基、C4-C12杂芳基；R5选自于下组氢原子、C1-C6烷基、C6-C20芳烷基。F2008800061525C00011.tif2.如权利要求1所述的分子，其特征在于，下列-个或几个条件被满足n是选自于2、3、4、5、6的整数；i是2;j是()；X是Br;W是-CO-NH-;是氢原子;:r4是h;R5是H。3.如权利要求l所述的分子，其特征在于，其被包含于如F所示列表中<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>4.一种药物，其在药学上可接受的载体中包含如权利要求1至3中任一项所述的结构式(I)的分子或其盐。5.—种根据权利要求1至3中任一项所述的结构式(I)的分子在制备用于抑制和/或治疗肿瘤或癌症的药物上的应用。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，用于预防和/或治疗选自于下组的癌症肺癌、卵巢癌、中枢神经系统(CNS)癌症、皮肤癌、以及结肠癌或白血病。7.—种用于合成如权利要求1至3中任一项所述的结构式(I)的分子的方法，其中，W为C0-NH-,其特征在于，该方法包含下述方案3中描述的至少一个步骤<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中，吲哚(II)被用大约-个当量的由对应的溴代肟原位产生的亚硝基丙烯酸酯012=C(N0)C00Z烷基化，式中Z代表选自下组的基团C:「Ce烷基、苯基、芳基，且反应在碱性介质中、在溶剂中、室温下进行。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，z是乙基、所述溶剂是c:H^:i"所述碱是K2C03。9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，当i=2且j=0时，第一步之后进行方案4中描述的工序<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中，通过用适当的保护基Y保护肟官能团，将肟(III)转化为化合物(IV)，优选Y是三苯甲基；然后通过适当的处理，将酯官能团-COOZ去保护变成-COOH，得到分子(V);然后使分子(V)与适当的二胺NH2-(CH2)n-S-S-(CH2)n-NH2反应，得到(VI);以及然后使肟官能团解离，产生结构式(I)的分子。10.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，当i=j=1时，第一步之后进行方案5中描述的工序<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>方案5其中，使化合物(VI)与胺H2N-(CH2)n-S-R起反应，并且使肟官能团去保护，得到化合物(I)全文摘要公开了对应于结构式(I)的PsammaplinA衍生物、用于合成它们的方法、以及它们用于制备抑制和/或治疗肿瘤或癌症的药物的用途。文档编号C07D209/30GK101720315SQ200880006152公开日2010年6月2日申请日期2008年2月28日优先权日2007年2月28日发明者H·G·斯顿嫩伯格,安热尔·德里拉,欣里希·格罗内迈尔,露西娅·阿尔图奇申请人:法国国家科学研究中心;斯特拉斯堡大学;法国国家健康与医学研究院;维戈大学;那不勒斯第二大学;内梅亨大学