专利名称：免疫球蛋白聚集体的制作方法
免疫球蛋白聚集体本发明属于蛋白质浓缩领域，更具体而言，其涉及切向流过滤(TFF)用于免疫球 蛋白浓缩和免疫球蛋白聚集体移除的应用。
背景技术：
蛋白质、尤其是免疫球蛋白在当前的医药事务中起着非常重要的作用。用 于生产重组多肽的表达系统是本领域公知的并且描述于，例如Marino，M. H.， Biopharm. 2(1989) 18-33 ；Goeddel, D. V.等，Methods Enzymo 1. 185(1990)3-7 ；ffurm, F.禾口 Bernard, Α.，Curr. Opin. Biotechnol. 10(1999) 156-159。在制药应用中使用的多肽主要在 诸如CHO细胞、NSO细胞、Sp2/0细胞、COS细胞、HEK细胞、BHK细胞、PER.C6 细胞等的 哺乳动物细胞中生产。对于人类应用，每种药用物质都必须符合特定的标准。为确保生物药用物质对人 类的安全性，例如，必须移除可能造成严重伤害的核酸、病毒和宿主细胞蛋白质。为符合质 量管理规格标准，在生产步骤之后必须有一个或多个纯化步骤。除其它因素外，纯度、生产 能力和收率在确定合适的纯化方法中起着重要的作用。由于它们的化学和物理性质，诸如分子量和结构域构造(包括二级修饰)，免疫 球蛋白的下游加工非常复杂。例如，不仅对于配制的药物，而且对于下游加工(DSP)的中 间产品，都需要浓缩溶液以实现经济性处理和应用贮存的低体积。此外，快速的浓缩方法 对于确保顺利加工和短的操作时间都是有利的。就此方面，不完善的切向流过滤(TFF)方 法(尤其是最终纯化步骤后的)可能引起持久的损害，甚至影响最终的药物产品。Ahrer， K.，等(J. Membr. Sci. 274(2006) 108-115)研究了单克隆抗体(mAb)中间溶液的切向流 浓缩过程中切变应力和聚集之间的关系。监测了选择确定的流和压力参数对可缩放 (scalable)方法性能的影响(例如，参见 Dosmar，M.等，Bioprocess Int. 3 (2005) 40-50 ； Luo, R.等，Bioprocess Int. 4 (2006) 44-46)。Mahler，H.-C.等(Eur. J. Pharmaceut. Biopharmaceut. 59 (2005) 407-417)报道了在通过不同的搅拌应力方法形成的液体 IgGl-抗体制剂中聚集体的诱导和分析。在US 6，252，055中，报道了浓缩的单克隆抗体制 备物。用于生产浓缩抗体制备物的方法报道于US 2006/0182740。US 2006/0051347报道 了包括超滤、渗滤和二次超滤序列的联合方法。在EP O 907 378中报道了应用具有250ml/ 分钟的固定再循环速率的横向流(cross-flow)超滤浓缩抗体制备物的方法。发明概述本发明的一个方面是通过切向流过滤获得浓缩的免疫球蛋白溶液的方法，特征在 于所述的方法包括以下步骤i)提供待浓缩的含有免疫球蛋白的溶液，其中所述的免疫球蛋白以单体形式和聚 合形式存在于所述溶液中，当通过尺寸排阻色谱法测定时，存在于所提供的溶液中的聚合 可溶免疫球蛋白形式的份额(fraction)具有超过2. 5%的第一个值；ii)通过应用切向流过滤浓缩i)中提供的所述溶液；iii)在切向流过滤结束后通过过滤移除所述聚合的免疫球蛋白，并且由此获得浓缩的免疫球蛋白溶液；其中，步骤ii)之后，所述免疫球蛋白的所述聚合可溶形式的份额比所述第一个 值更大，并且比第二个值要小，其中所述的第二个值是第一个值的1.25倍。本发明的另一方面是通过切向流过滤获得浓缩的免疫球蛋白溶液的方法，特征在 于所述的方法包括以下步骤i)提供待浓缩的含有免疫球蛋白的溶液，其中所述的免疫球蛋白以单体形式和聚 合形式存在于所述溶液中，当通过尺寸排阻色谱法测定时，存在于所提供的溶液中的聚合 可溶免疫球蛋白形式的份额超过2.5%，通过光遮蔽测定在所述溶液中具有第一个数目的 大小超过1 P m的颗粒；ii)通过应用具有3.0巴恒定Ap的切向流过滤浓缩i)中提供的所述溶液，由 此获得浓缩的免疫球蛋白溶液，通过光遮蔽测定在所述溶液中具有第二个数目的大小超过 1 um的颗粒；其中大小超过1 y m的颗粒的所述第二个数目小于大小超过1 P m的颗粒的所述第 一个数目的200倍。本发明的另一方面是生产异源免疫球蛋白的方法，其包括以下步骤a)提供重组哺乳动物细胞，其包含一种或多种编码异源免疫球蛋白的核酸；b)在适于表达该异源免疫球蛋白的条件下培养所述细胞；c)从重组哺乳动物细胞或培养基中回收异源免疫球蛋白；d)应用具有3.0巴恒定Ap的切向流过滤方法浓缩所获得的包含异源免疫球蛋白 的水性、缓冲溶液，其中当通过光遮蔽测定颗粒数目时，在所述浓缩的溶液中大小超过1 P m 的颗粒的数目小于浓缩前的溶液中大小超过1 P m的颗粒的数目的200倍。本发明的另外一方面是从免疫球蛋白溶液移除免疫球蛋白聚集体的方法，特征在 于所述方法包括以下步骤i)提供待浓缩的含有所述免疫球蛋白的溶液，其中所述的免疫球蛋白以单体形式 和聚合形式存在于所述溶液中，或提供待浓缩的含有免疫球蛋白的溶液，其中在所述溶液中通过加热诱导聚合形式 的所述免疫球蛋白的形成，ii)通过应用具有3.0巴的恒定Ap、以及0.6巴的恒定跨膜压力的切向流过滤方 法浓缩i)中提供的所述溶液，iii)通过用0. 2 ym孔径的滤器过滤从在步骤ii)中获得的免疫球蛋白溶液中移 除免疫球蛋白聚集体，其中当通过光遮蔽测定颗粒数目时，在步骤ii)中所述浓缩的溶液中大小超过 1 U m的颗粒的数目小于浓缩前的溶液中大小超过1 P m的颗粒的数目的200倍。本发明的最后一个方面是在用切向流过滤的浓缩步骤期间减少聚合可溶形式的 免疫球蛋白形成的方法，其中通过在开始该浓缩步骤之前添加、补加或产生聚合可溶形式 的免疫球蛋白而实现所述减少。在根据本发明的方法的一个实施方案中，当通过光遮蔽测定颗粒数目时，在所述 浓缩的溶液中大小超过5 u m的颗粒的数目小于浓缩前的溶液中大小超过5 u m的颗粒的数 目的100倍。在另一实施方案中，当以在所述溶液的尺寸排阻色谱图中的单体免疫球蛋白峰之前的洗脱峰曲线下面积测定时，所述聚合可溶免疫球蛋白形式的份额超过5%。在另一 实施方案中，根据本发明的方法在步骤d)之前或步骤d)之后包括以下步骤e)纯化含有异源免疫球蛋白的水性、缓冲溶液。在一个实施方案中，所述异源免疫球蛋白是完全免疫球蛋白、或免疫球蛋白片 段、或免疫球蛋白缀合物。在另一实施方案中，哺乳动物细胞是CHO细胞、BHK细胞或 PER,C6 细胞。在另一实施方案中，通过光遮蔽的测定是在90mg/ml的蛋白浓度下进行。 在一个实施方案中，所述聚合可溶形式的免疫球蛋白的份额比所述第一个值更大而比第二 个值更小，其中所述第二个值是第一个值的1. 10倍。在一个实施方案中，本发明的一个方 面是通过切向流过滤获得不含不可溶免疫球蛋白聚集体的浓缩的免疫球蛋白溶液的方法， 并且所述的浓缩的免疫球蛋白溶液不含不可溶免疫球蛋白聚集体。在另一实施方案中，所 述方法用于通过切向流过滤获得不含不可溶免疫球蛋白聚集体和超过5 μ m的可溶免疫球 蛋白聚集体的浓缩的免疫球蛋白溶液，其中所述的浓缩的免疫球蛋白溶液不含不可溶免疫 球蛋白聚集体并且不含超过5 μ m的可溶免疫球蛋白聚集体，并且所述的移除所述聚合免 疫球蛋白是通过用具有1.0 μ m孔径或更小(在一个实施方案中是0.2 μ m孔径)的滤器过 滤来进行。在另外的实施方案中，浓缩后的免疫球蛋白浓度超过80mg/ml，在另一实施方案 中超过90mg/ml，在另外一个实施方案中超过100mg/ml。在一个实施方案中，浓缩后的免疫 球蛋白浓度低于275mg/ml，或低于180mg/ml，或低于130mg/ml。在另一实施方案中，所述的 过滤浓缩的免疫球蛋白溶液用具有1 μ m或更小孔径的滤器进行，以移除超过5 μ m的可溶 的聚集形式的免疫球蛋白并移除不可溶的聚集形式的免疫球蛋白。在一个实施方案中，所 述聚合免疫球蛋白形式是可溶的聚集免疫球蛋白和不可溶的聚集免疫球蛋白。在一个实施 方案中，所述聚合形式的免疫球蛋白是可溶的聚集免疫球蛋白形式。在一个实施方案中，聚 合可溶免疫球蛋白形式的份额少于25%，在另一实施方案中少于15%，在另外一实施方案 中少于10%。发明详述本发明提供了通过切向流过滤获得不含免疫球蛋白聚集体的浓缩的免疫球蛋白 溶液的方法，其包括以下步骤i)提供待浓缩的含有免疫球蛋白的溶液，其中所述的免疫球蛋白以单体形式和聚 合形式存在于所述溶液中，当以所述提供的溶液的尺寸排阻色谱图中的单体免疫球蛋白峰 之前的洗脱峰曲线下面积测定时，所述可溶聚合形式的份额超过2. 5%，即可溶高分子量 (HMW)形式的份额超过2. 5% ；ii)通过应用切向流过滤浓缩i)中提供的所述溶液，在切向流过滤期间，聚合形 式免疫球蛋白中含有的免疫球蛋白分子的数目增加，优选直到形成不可溶的颗粒；iii)在切向流过滤结束后通过过滤步骤移除所述的不可溶的聚合形式免疫球蛋 白，从而获得不含免疫球蛋白聚集体的浓缩的免疫球蛋白溶液。抗-IL-IR抗体(参见WO 2005/023872)在本发明期间在我们的实验室中可足量 获得，因此本发明应用这一免疫球蛋白进行例示。通常，本发明同样还可以用其它免疫球蛋 白来实施。这一示例性描述仅仅是用于举例，而非限制本发明。提供了这些实例以帮助理 解本发明，本发明的真实范围如随后的权利要求中所示。在本发明中，术语“切 向流过滤”或“TFF”可互换使用，其指这样的过滤方法，其中待浓缩的含有多肽的溶液沿着滤膜表面(即，与滤膜表面正切)流动。该滤膜包含具有 确定截断值的孔径。在一个实施方案中，该截断值是20kDa至50kDa，在另一实施方案中是 30kDa。该过滤方法是一种超滤方法。术语“横向流”表示待浓缩溶液的与膜正切的液流 (渗余物流)。术语“跨膜压力”或“TMP”在本发明内可互换使用，其指施加的用于驱动溶剂和比 滤膜的截断值更小的成分通过滤膜的孔径的压力。在一个实施方案中，在根据发明的方法 中的跨膜压力是0. 6巴。跨膜压力是入口、出口和渗透物的平均压力，并且可如下计算术语“免疫球蛋白”是指由一个或多个基本上由免疫球蛋白基因编码的多肽组成 的蛋白质。确认的免疫球蛋白基因包括不同的恒定区基因和繁多的免疫球蛋白可变区基 因。免疫球蛋白可以以不同的形式存在，包括，例如Fv、Fab和F(ab)2以及单链(scFv)或双 体(例如，Huston，J. S.等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(1988)5879-5883 ；Bird, R. E.等， Science 242(1988)423-426 ；—般地，Hood L. E.等，Immunology，Benjamin N. Y.，第二版 (1984)；禾口 Hunkapiller, T.和 Hood, L.，Nature 323(1986) 15-16)。术语“完全免疫球蛋白”表示包含两条称为轻免疫球蛋白链多肽(轻链)和两条 称为重免疫球蛋白链多肽(重链)的免疫球蛋白。完全免疫球蛋白的每一条重和轻免疫球 蛋白链多肽含有可变结构域(可变区)(一般为多肽链的氨基端部分)，其包含可与抗原相 互作用的结合区域。完全免疫球蛋白的每一条重和轻免疫球蛋白链多肽还包含恒定区(一 般为羧基端部分)。重链的恒定区介导抗体与i)拥有Fcy受体(FCYR)的细胞诸如吞噬 细胞结合，或与ii)拥有新生儿Fc受体(FcRn)(也称为Brambell受体)的细胞结合。其 还介导与一些因子包括经典补体系统的因子诸如成分(Clq)的结合。免疫球蛋白的轻链和 重链的可变区依次包含不同的片段，即四个框架区域(FR)和3个高变区(CDR)。术语“免疫球蛋白片段”表示包含选自重链的可变结构域、CH1结构域、铰链区、Ch2 结构域、Ch3结构域或Ch4结构域，或者轻链的可变结构域或Q结构域中的至少一个结构域 的多肽。还包含其衍生物和变体。例如，可存在其中一个或多个氨基酸或氨基酸区域缺失 的可变结构域。术语“免疫球蛋白缀合物，，指包含通过肽键与其它多肽轭合的免疫球蛋白重或轻 链的至少一个结构域的多肽。所述其它多肽是非免疫球蛋白肽，诸如激素、生长受体、抗融 合肽或补体因子等。在一个实施方案中，所述免疫球蛋白缀合物含有与两个或四个非免疫 球蛋白肽共价连接的免疫球蛋白分子。通用的色谱方法和它们的用途是本领域技术人员公知的。例如参见色谱法 (Chromatography),第 5 版，Heftmann，E.(编辑)，A 部分原理和技术(Fundamentals and Techniques)，Elsevier Science Publishing Company，纽约，(1992) ；Deyl, Z.(编辑)，生 物科学中的先进色谱法和电迁移方法(Advanced Chromatographic and Electromigration Methods inBiosciences), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998)； Poole, C. F.,禾口 Poole, S. K.，当今的色谱法(Chromatography Today), Elsevier Science Publishing Company,纽约(1991) ；Scopes, R. K.，蛋白质纯化原理和实践(Protein
7Purification-Principles and Practice), SpringerVerlag,纽约，(1982) ；Sambrook, J., 等(编辑)，分子克隆实验室手册(Molecular Cloning =A Laboratory Manual)，第二版， Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , (1989)；或分子生物 学的当前技术(Current Protocols in Molecular Biology), Ausubel, F. M.等(编辑)， John Wiley & Sons, Inc.，纽约。对于重组产生的异源免疫球蛋白的纯化，通常应用不同柱色谱步骤的组合。通常 在蛋白质A亲和色谱法后跟随有一个或两个其它的分离步骤。最终的纯化步骤称为“精 制步骤(polishing st印)”，用于除去痕量杂质和污染物，例如聚集的免疫球蛋白、残余 HCP (宿主细胞蛋白质)、DNA(宿主细胞核酸)、病毒或内毒素。对于这一精制步骤，通常使 用在流通模式中的阴离子交换材料。已建立了不同的方法并将其广泛应用于蛋白质回收和纯化，诸如用微生物蛋 白质的亲和色谱法(例如蛋白质A或蛋白质G亲和色谱)，离子交换色谱法(例如阳 离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式交换)，嗜硫吸附(例如用β-巯基乙醇和其它SH配体)，疏水相互作用或芳香性吸附色谱(例如，用 苯基_琼脂糖、aza-arenophilic树脂或间氨基苯硼酸)，金属螯合亲和色谱(例如用 Ni (II)-和Cu(II)-亲和材料)，尺寸排阻色谱，和电泳方法(诸如凝胶电泳、毛细管电泳) (Vijayalakshmi, Μ. A.，Appl.Biochem.Biotech. 75(1998) 93—102)。术语“异源免疫球蛋白”表示不是由哺乳动物细胞天然产生的免疫球蛋白。根据 本发明方法生产的免疫球蛋白是通过重组方法产生的。此类方法在本领域是公知的，并且 包括在真核细胞中表达蛋白质、随后回收和分离异源免疫球蛋白，并且通常纯化至药学上 可接受的纯度。为了生产(即表达)免疫球蛋白，通过标准方法将编码轻链的核酸和编码 重链的核酸各自插入到表达盒中。应用常规方法能很容易地分离和测序编码免疫球蛋白轻 和重链的核酸。杂交瘤细胞可作为此类核酸的来源。可将表达盒插入到表达质粒中，然后 将该质粒转染至细胞中，否则所述细胞不产生免疫球蛋白。在合适的原核或真核细胞中进 行表达，并且从裂解后的细胞或从培养上清液回收免疫球蛋白。本申请中所使用的术语“待浓缩的含有免疫球蛋白的溶液”指含有完全免疫球蛋 白、免疫球蛋白片段或免疫球蛋白缀合物的水性缓冲溶液。该溶液例如可以是培养上清液、 或柱色谱洗脱物、或精制的免疫球蛋白溶液。“异源DNA”或“异源多肽”是指不天然存在于给定宿主细胞中的DNA分子或多肽、 或DNA分子群或多肽群。对特定宿主细胞异源的DNA分子可以含有衍生自宿主细胞物种的 DNA(即，内源DNA)，只要该宿主DNA与非宿主DNA(即，外源DNA)组合即可。例如，含有与 包含启动子的宿主DNA片段可操作连接的编码多肽的非宿主DNA片段的DNA分子被认为是 异源DNA分子。反之，异源DNA分子可包含与外源启动子可操作地连接的内源结构基因。由非宿主DNA分子编码的肽或多肽是“异源”肽或多肽。术语“在适于表达异源免疫球蛋白的条件下”表示用于培养表达免疫球蛋白的哺 乳动物细胞的条件，并且其是本领域技术人员公知的，或可以由本领域技术人员很容易地 确定。本领域技术人员还已知，这些条件将取决于所培养的哺乳动物细胞的类型和所表达 的免疫球蛋白的类型而可能不同。一般而言，哺乳动物细胞在20°C至40°C的温度下培养， 并且持续足以允许免疫球蛋白的有效蛋白质生产的时间段，例如，4至28天。
本发明提供了通过切向流过滤获得基本上不含免疫球蛋白聚集体的浓缩的免疫 球蛋白溶液的方法，其包括以下步骤i)提供待浓缩的含有免疫球蛋白的溶液，其中所述的免疫球蛋白以单体形式和聚 合形式存在于所述溶液中，当以所述溶液的尺寸排阻色谱图中的单体免疫球蛋白峰之前的 洗脱峰的曲线下面积测定时，所述可溶聚合形式的份额超过2. 5% ；ii)通过应用切向流过滤浓缩i)中提供的所述溶液，当以所述浓缩溶液的尺寸排 阻色谱图中的单体免疫球蛋白峰之前的洗脱峰曲线下面积测定时，所述免疫球蛋白的所述 可溶聚合形式增加不超过25% ； iii)在切向流过滤结束之后通过过滤移除聚合不可溶的免疫球蛋白，并且由此获 得基本上不含免疫球蛋白聚集体的浓缩的免疫球蛋白溶液。换而言之，本发明包括通过切向流过滤获得浓缩的免疫球蛋白溶液的方法，特征 在于所述方法包括以下步骤i)提供待浓缩的含有免疫球蛋白的溶液，其中所述的免疫球蛋白以单体形式和聚 合形式存在于所述溶液中，当通过尺寸排阻色谱法测定时，存在于所述提供的溶液中的聚 合可溶免疫球蛋白形式的份额具有超过2.5%的第一个值；ii)通过应用切向流过滤浓缩i)中提供的所述溶液；iii)在切向流过滤结束之后通过过滤移除所述聚合免疫球蛋白，并且由此获得浓 缩的免疫球蛋白溶液。其中，在步骤ii)之后，所述免疫球蛋白的所述聚合可溶形式的份额比所述的第 一个值大且比第二个值小，其中该第二个值是第一个值的1. 25倍。术语“基本上不含”指这样的免疫球蛋白制备物，其含有至少50% (w/w)的单体形 式的免疫球蛋白，在一个实施方案中含有至少75 %的单体形式的免疫球蛋白，在另一实施 方案中含有至少90%的单体形式的免疫球蛋白，或在另外一实施方案中含有超过95%的 单体形式的免疫球蛋白，该申请中所使用的术语“增加不超过10%”表示聚合可溶形式的免疫球蛋白的份 额增加不超过10%。例如，如果在切向流过滤之前通过尺寸排阻色谱法测定聚合可溶形式 的免疫球蛋白的份额为7. 5%的话，这一术语表示该份额的增加不超过0. 75%，即最大为 8. 25%。该申请中所使用的术语“单体形式的免疫球蛋白”表示不与一个或多个其它免疫 球蛋白分子共价或非共价连接的免疫球蛋白分子。这不排除免疫球蛋白分子与一个或多个 非免疫球蛋白分子(诸如碳水化合物、染色质等)共价或非共价连接。该申请中所使用的术语“聚合形式的免疫球蛋白”和“聚集形式的免疫球蛋白”表 示与一个或多个免疫球蛋白分子共价或非共价连接的免疫球蛋白分子。这些连接的免疫球 蛋白分子可以是相同的免疫球蛋白分子或不同的免疫球蛋白分子。这并不排除该免疫球蛋 白分子与一个或多个非免疫球蛋白分子(诸如碳水化合物、染色质等)共价或非共价连接。 术语“聚合可溶形式”或“高分子量(HMW)形式”在本申请中可互换使用，表示聚合的(即 聚集的)免疫球蛋白，其中所述的聚集体仍然可溶于水性缓冲溶液中。术语“聚合不可溶形 式”表示聚合的(即聚集的)免疫球蛋白，其中所述的聚集体不溶于水性缓冲溶液中。在根据本发明的方法的步骤i)中，免疫球蛋白以单体形式和聚合形式存在，其中这两种形式可溶于溶液中。在该方法的步骤ii)中，提供了应用切向流过滤方法浓缩的含 有单体形式和聚合形式免疫球蛋白的免疫球蛋白溶液。现已惊奇地发现，如果在用切向流 过滤的浓缩步骤之前，溶液含有聚合但可溶形式的免疫球蛋白，则在聚合形式免疫球蛋白 中含有的免疫球蛋白分子的数目(即，颗粒大小)将增加，直到该聚合形式的免疫球蛋白不 再可溶于溶液中。相伴地，在切向流过滤期间几乎没有新的聚合形式的可溶免疫球蛋白形 成。因此，已发现在用切向流过滤的浓缩步骤之前含有聚合可溶形式免疫球蛋白的免疫球 蛋白溶液中，所含有的聚合可溶形式的免疫球蛋白进一步从该溶液中附聚其它免疫球蛋白 分子，导致新的聚合可溶形式的免疫球蛋白的形成减少。因此，这导致产生聚合不可溶形 式的免疫球蛋白，其可在浓缩步骤之后通过简单的过滤步骤从浓缩的免疫球蛋白溶液中除 去。本发明的另一个方面是通过切向流过滤获得浓缩的免疫球蛋白溶液的方法，其包 括以下步骤i)提供待浓缩的含有免疫球蛋白的溶液，其中所述的免疫球蛋白以单体形式和聚 合形式存在于所述溶液中；ii)通过应用具有3. 0巴Ap的切向流过滤浓缩i)中提供的所述溶液；其中当通过光遮蔽测定颗粒数目时，在所述溶液中大小超过1 P m的颗粒数目在 浓缩步骤期间增加不超过200倍。在一个实施方案中，在90mg/ml的蛋白质浓度下通过光 遮蔽测定颗粒数目。在一个实施方案中，当通过光遮蔽测定颗粒数目时，大小超过5 y m的 颗粒数目增加不超过100倍。在另一实施方案中，当以所述溶液的尺寸排阻色谱图中的单 体免疫球蛋白峰之前的洗脱峰曲线下面积测定时，所述聚合形式的所述免疫球蛋白的份额 超过5 %。在另一实施方案中，浓缩后的免疫球蛋白的浓度超过80mg/ml，在一个实施方案 中是90mg/ml或更高。在另一实施方案中，切向流过滤期间的跨膜压是0.6巴的常量。本发明的另一方面是生产异源免疫球蛋白的方法，其包括以下步骤a)提供重组哺乳动物细胞，其包含一种或多种编码异源免疫球蛋白的核酸；
b)在适于表达该异源免疫球蛋白的条件下培养所述细胞；c)从重组哺乳动物细胞或培养基中回收异源免疫球蛋白；d)应用具有3. 0巴恒定Ap的切向流过滤方法浓缩所回收的包含所述异源免疫 球蛋白的水性、缓冲溶液，由此当通过光遮蔽测定颗粒数目时，在所述溶液中大小超过1 P m 的颗粒数目增加不超过200倍。在一个实施方案中，在90mg/ml的蛋白质浓度下测定颗粒数目。在另一实施方案 中，所述异源免疫球蛋白是完全免疫球蛋白、或免疫球蛋白片段、或免疫球蛋白缀合物。在 另一实施方案中，哺乳动物细胞是CH0细胞、BHK细胞或PER.G6 细胞。术语“重组哺乳动物细胞”指可以将或将例如编码异源多肽的核酸导入/转染至 其中的细胞。术语“细胞”包括用于表达核酸的细胞。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是 CH0细胞(例如CHO K1、CH0 DG44)、或BHK细胞、或NS0细胞、或SP2/0细胞、或HEK 293 细胞、或HEK 293EBNA细胞、或PERC6 细胞、或COS细胞。在另一实施方案中，哺乳动 物细胞是CH0细胞、或BHK细胞、或PER.C6 细胞。本文所使用的表述“细胞”包括主题 (subject)细胞及其后代。因此，术语“重组细胞”包括最初转染的细胞，以及包含从其衍生 的后代细胞的培养物，而不考虑传代的次数。还应当理解，由于故意或非故意的突变，所有的后代在DNA内容物中可能不是精确同一的。与最初转化的细胞具有相同功能或生物活性 的变体后代也包括在内。在本申请中使用的术语“缓冲的”表示这样的溶液，其中通过缓冲物质使由于添加 或释放酸性或碱性物质而导致的PH值改变得以保持恒定。可以使用产生此类效果的任何 缓冲物质。在一个实施方案中，使用药学上可接受的缓冲物质，例如，磷酸或其盐、醋酸或其 盐、柠檬酸或其盐、吗啉或其盐、2-(N-吗啉代)乙磺酸或其盐、组氨酸或其盐、甘氨酸或其 盐、精氨酸或其盐、或者TRIS(羟甲基氨基甲烷)或其盐。在一个实施方案中，缓冲物质是 磷酸或其盐、醋酸或其盐、或者柠檬酸或其盐、或者组氨酸或其盐、或精氨酸或其盐。缓冲溶 液可任选地包含另外的盐，例如，氯化钠、和/或硫酸钠、和/或氯化钾、和/或硫酸钾、和/ 或柠檬酸钠、和/或柠檬酸钾。在本发明的一个实施方案中，缓冲的水性溶液的PH值是pH 3. 0至ρΗΙΟ. 0，在另一实施方案中是pH 3. 0至pH7. 0，在另外一实施方案中是pH 4. 0至pH 6. 0，以及在另外的一个实施方案中是pH 4. 5至pH 5. 5。在另一实施方案中，所述方法在步骤d)之前或步骤d)之后包括以下步骤e)纯化含有异源免疫球蛋白的水性、缓冲溶液。步骤e)中的纯化可通过不同的方法和技术完成，所述方法和技术诸如色谱步骤， 或者不同或相似色谱步骤的组合，或沉淀，或盐析，或超滤，或渗滤，或冻干，或缓冲剂变换 (buffer change)，或其组合等等。在另一实施方案中，所述异源免疫球蛋白是完全免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或 免疫球蛋白缀合物。在一个实施方案中，哺乳动物细胞是CHO细胞、BHK细胞、NSO细胞、 Sp2/0细胞、COS细胞、HEK细胞或PER.C6 细胞。本发明的另外一方面是获得浓缩的免疫球蛋白溶液的方法，其包括以下步骤i)提供待浓缩的含有免疫球蛋白的溶液，其中所述的免疫球蛋白以单体形式和聚 合形式存在于所述溶液中，ii)通过应用切向流过滤浓缩所述溶液，并由此产生经浓缩的免疫球蛋白溶液，iii)过滤步骤ii)中获得的经浓缩的免疫球蛋白溶液，以除去聚合形式的免疫球 蛋白。至此，已发现在含有单体形式和聚合形式的所述免疫球蛋白的免疫球蛋白溶液的 切向流过滤期间，另外的聚合形式可溶免疫球蛋白的形成减少了，而可溶于溶液的已含有 的聚合形式的免疫球蛋白转化为不可溶于溶液的聚合形式的免疫球蛋白。因此，在用切向 流过滤浓缩免疫球蛋白溶液期间，聚合形式免疫球蛋白中彼此相连的免疫球蛋白分子数增 力口，直到该聚合形式的免疫球蛋白不再可溶于溶液中。因此，本发明的另一方面是在用切向 流过滤的浓缩步骤期间减少可溶聚合形式免疫球蛋白的形成的方法，其中通过在该切向流 过滤开始之前添加、补充或产生可溶聚合形式的免疫球蛋白来实现该减少。例如可通过热 应激产生聚合形式的免疫球蛋白。提供了以下实施例和附图以助于理解本发明，本发明的真实范围如所附权利要求 中所示。应当理解，可在给出的方法中进行修改，而不背离本发明的精神。 附图简述
图1 通过不同浓缩模式的浓缩期间的浊度。X轴以mg/ml为单位的浓度，Y轴 在350nm处测定的浊度。
图2 通过不同浓缩模式的浓缩期间每ml溶液中> 1 μ m的颗粒数；X轴浓缩因 子(CF)，Y 轴106 颗粒 /ml > 1 μ m。图3 来自经浓缩的抗-IL-IR抗体溶液的染色的不可溶聚集体(左Δρ3.0巴； 右Δρ 1.2 巴)。图4 相对于浓缩前样品中存在的高分子量形式(HMW)而言的HMW的增加。X轴 1:在具有1.2巴Δρ的TFF之前具有低HMW含量(约0.6% ) ；2 在具有1. 2巴Δρ的TFF 之前具有高HMW含量(约7. 2% ) ；3 在具有3.0巴Ap的TFF之前具有低HMW含量；4 在 具有3.0巴Δρ的TFF之前具有高HMW含量；Y轴以％为单位的HMW的增加。图5 浓缩前和在分别用1. 2巴或3. 0巴的Δ ρ浓缩后每ml溶液中的颗粒数；X轴 1 具有低HMW含量浓缩前；2 :具有高HMW含量浓缩前；3 用1. 2巴的Δ ρ浓缩具有低HMW 含量的溶液后；4 用1. 2巴的Δ ρ浓缩具有高HMW含量的溶液后；5 用3. 0巴的Δ ρ浓缩 具有低HMW含量的溶液后；6 用3.0巴的Δ ρ浓缩具有高HMW含量的溶液后；左Y轴105 个颗粒/ml ；右Y轴每ml中大小> 25 μ m的颗粒。图6 对于具有高的初始高分子量形式含量的材料，除单体强度降低之外可观察 到在约5000nm处的种类(species)(在浓缩前仅一个信号)；X轴以nm为单位的颗粒；Y 轴以％为单位的相对强度；正方形以1. 2巴的Δ ρ浓缩低HMW含量的溶液；菱形以1. 2 巴的Δ ρ浓缩高HMW含量的溶液；三角形以3.0巴的Δ ρ浓缩低HMW含量的溶液；圆形 以3.0巴的Δ ρ浓缩高HMW含量的溶液。实施例1方法a)浊度测量在没有抗体溶液内在发色团吸收的350nm和550nm处测定吸光度(UV-VIS spectrophotometer Evolution 500, Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)。用未稀 释的样品测量。使用适当的缓冲溶液作为参照介质。每个测量进行3次。b)尺寸-排阻-HPLC在Summit HPLC 系统(Dionex，Idstein，德国)上用 Tosoh Haas TSK3000SWXL柱进行色谱法。通过UV 二极管阵列检测器(Dionex)在280nm处检测 洗脱峰。在将浓缩样品溶解至lmg/ml后，用由200mM磷酸二氢钾和250mM氯化钾组成的、 PH7. 0的缓冲液洗柱，直到达到稳定的基线。应用0. 5ml/分钟流速在等度条件下进行分析， 在室温下历时30分钟。用Chromeleon(Dionex，Idstein，德国)手动积分色谱图。通过将 高分子量形式的曲线下面积(AUC)与单体峰的AUC比较来确定％聚集。C)光遮蔽(Light obscuration)为监测1-200 μ m范围内的颗粒负载，使用了 SVSS-C颗粒分析仪(PAMAS Partikelmess-und Analysesysteme, Rutesheim, ΙΗ )。卞艮ig US 胃|||| 24 ^ <788> 的胃 求，用近单一尺寸聚苯乙烯球校对系统。用0. 5ml预冲洗体积进行了 0. 5ml体积的3个测 量。作为平均值计算结果并涉及1.0ml的样品体积。所计算的颗粒数在感受器的浓度限度 内。d)动态光散射(DLS)DLS是用于测量颗粒大小(一般在亚微米级大小范围)的非侵入技术。在本发明中，应用具有温控石英比色皿(25°C )的Zetasizer Nano S设备(Malvern Instruments, Worcestershire, UK)来监测Inm和6 μ m之间的大小范围。在173 °角检测反散射 激光的强度。该强度以依赖于颗粒扩散速度的速率波动，所述颗粒扩散速度又由颗粒 大小控制。因此，可从散射光强度波动的分析产生颗粒大小数据(Dahneke，B. Ε.(编 辑),Measurement ofSuspended Particles by Quasielectric Light Scattering, Wiley Inc. (1983) ；Pecora, R. , Dynamic Light Scattering !Application of Photon CorrelationSpectroscopy, Plenum Press (1985))。应用 DTS 软件(Malvern)的倍数狭小 模式(multiple narrow mode)计算通过强度的大小分布。用未稀释的样品进行实验。e)用于检测不可溶聚集体的染色方法通过0.22 μ m醋酸纤维素滤膜(Sartorius，G5ttingen,德国)过滤浓缩的 抗体溶液，并且用来自Sigma-Aldrich (Steinheim，德国)的可逆蛋白质检测试剂盒 (Reversible Protein Detection Kit)溶液染色留下的颗粒。在用缓冲液洗涤后，用装备 有数码相机DC IOO(Leica)的立体显微镜MZ 12 (Leica，Wetzlar，德国)以80倍放大检查 膜(例如参见，Li, B.，等，J. PharmaceuticalSci. 96(2007) 1840-1843)。 实施例2切向流过滤通过应用自动TFF 系统 AKTAcroSSfloWTM (GE Healthcare, Amersham Bioscien ce AB，Uppsala，瑞典)一其应用具有Hydrosart 可再生纤维素膜(其具有 30kDa的标称分子量截断值、0. 02m2的膜面积和约400g/m2的总膜载量)的可调大小的平板 盒(Sartorius，G6ttingen，德国)-将经调整和过滤的抗-IL-IR抗体的组氨酸缓冲水性 溶液(pH 5. 8)浓缩20倍至最高达100mg/ml。目标浓度设置为90mg/ml。测试了不同的Δ ρ参数，如下所述方法1 跨膜压力=0.6巴横向流=90ml/分钟Δρ = 1. 2 巴方法2 跨膜压力=0.6巴Δρ = 3. 0 巴在浓缩过程期间浊度测量(图1)、L0结果(图2，表1)显示了聚集的不可溶形式 的免疫球蛋白的形成增加取决于所施加的剪切应力。表1 光遮蔽_取决于Δ ρ值和TFF开始时聚集形式数目的颗粒数目分析数据 通过应用过滤_染色方法很容易通过视觉检测到经浓缩的溶液中的不可溶聚合 形式免疫球蛋白的负荷，该负荷取决于所施加的剪切应力和所使用的浓缩方法，支持了由 L0和浊度测量获得的结果(图3)。浓缩溶液中聚合形式的免疫球蛋白的增加取决于浓缩 前的聚合前体的状态。当使用已含有聚合形式的免疫球蛋白的材料时(如在该实施例中通 过SEC所测量为7. 5% )，在切向流过滤期间聚合形式的量的增加不可被SEC检测到(参见 表2)。表2:SEC 数据 与此相反，当浓缩近乎单体的材料(如通过SEC测定为0.6%的聚合形式的免疫球 蛋白)时，高分子量形式/聚合可溶形式的量增加(图4)。就浓缩后较大和不可溶聚集体 的情况而言，可观察到相反的关系。与最初近乎单体的溶液相比，在浓缩前具有较高程度的 聚合形式前体的溶液显示出更大且不可溶的聚集体(图5)。发现了在TFF过程中取决于所 使用的中间体的聚合前体的状态从较小可溶聚合前体(即，从其中仅聚集了少量免疫球蛋 白分子的聚合形式)向较大不可溶聚集体形式转换。DLS数据支持这一观点(图6)。在通过TFF浓缩期间，不仅TFF中的不利的高压性质(profiles)而且污染物(例 如可溶聚集体)可以导致从聚集体向更大的不可溶种类和沉淀转换的进行性的聚集过程。
权利要求
通过切向流过滤获得浓缩的免疫球蛋白溶液的方法，特征在于所述的方法包括以下步骤i)提供待浓缩的含有免疫球蛋白的溶液，其中所述的免疫球蛋白以单体形式和聚合形式存在于所述溶液中，当通过尺寸排阻色谱法测定时，存在于所提供的溶液中的聚合可溶免疫球蛋白形式的份额具有超过2.5％的第一个值；ii)通过应用切向流过滤浓缩i)中提供的所述溶液；iii)在切向流过滤结束之后通过过滤移除所述聚合免疫球蛋白，并且由此获得浓缩的免疫球蛋白溶液；其中，在步骤ii)之后，所述免疫球蛋白的所述聚合可溶形式的份额比所述第一个值更大，并且比第二个值更小，其中该第二个值是第一个值的1.25倍。
2.通过切向流过滤获得浓缩的免疫球蛋白溶液的方法，特征在于所述的方法包括以下 步骤i)提供待浓缩的含有免疫球蛋白的溶液，其中所述的免疫球蛋白以单体形式和聚合形 式存在于所述溶液中，当通过尺寸排阻色谱法测定时，存在于所提供的溶液中的聚合可溶 免疫球蛋白形式的份额超过2.5%，通过光遮蔽测定在所述溶液中具有第一个数目的大小 超过1 P m的颗粒；ii)通过应用具有3.0巴恒定Ap的切向流过滤浓缩i)中提供的所述溶液，由此获 得浓缩的免疫球蛋白溶液，通过光遮蔽测定在所述溶液中具有第二个数目的大小超过1 P m 的颗粒；其中大小超过1 P m的颗粒的所述第二个数目小于大小超过1 P m的颗粒的所述第一个 数目的200倍。
3.生产异源免疫球蛋白的方法，其包括以下步骤a)提供重组哺乳动物细胞，其包含一种或多种编码异源免疫球蛋白的核酸；b)在适于表达该异源免疫球蛋白的条件下培养所述细胞；c)从重组哺乳动物细胞或培养基中回收异源免疫球蛋白；d)应用具有3.0巴恒定△ p的切向流过滤方法浓缩所获得的包含异源免疫球蛋白的水 性、缓冲溶液，其中当通过光遮蔽测定颗粒数目时，在所述浓缩的溶液中大小超过1 P m的 颗粒的数目小于浓缩前的溶液中大小超过1 P m的颗粒的数目的200倍。
4.从免疫球蛋白溶液移除免疫球蛋白聚集体的方法，特征在于所述方法包括以下步骤i)提供待浓缩的含有所述免疫球蛋白的溶液，其中所述的免疫球蛋白以单体形式和聚 合形式存在于所述溶液中，或提供待浓缩的含有免疫球蛋白的溶液，其中在所述溶液中通过加热诱导所述聚合形式 的免疫球蛋白的形成，ii)通过应用具有3.0巴的恒定Ap、以及0.6巴的恒定跨膜压力的切向流过滤方法浓 缩i)中提供的所述溶液，iii)通过用0.2pm孔径的滤器过滤从步骤ii)中获得的免疫球蛋白溶液移除免疫球 蛋白聚集体，其中当通过光遮蔽测定颗粒数目时，步骤ii)的所述浓缩的溶液中大小超过1 P m的颗粒的数目小于浓缩前的溶液中大小超过ι μ m的颗粒的数目的200倍。
5.在用切向流过滤的浓缩步骤期间减少聚合可溶形式的免疫球蛋白形成的方法，其 中通过在开始该浓缩步骤之前添加、补充或产生聚合可溶形式的免疫球蛋白而实现所述减 少。
6.权利要求2-4任一项的方法，特征在于当通过光遮蔽测定颗粒数目时，在所述浓缩 的溶液中大小超过5 μ m的颗粒的数目小于浓缩前的溶液中大小超过5 μ m的颗粒数目的 100 倍。
7.前述权利要求任一项的方法，特征在于当以所述溶液的尺寸排阻色谱图中的单体 免疫球蛋白峰之前的洗脱峰曲线下面积测定时，所述聚合可溶免疫球蛋白形式的份额超过5%。
8.权利要求3的方法，特征在于其在步骤d)之前或步骤d)之后包括以下步骤 e)纯化含有异源免疫球蛋白的水性、缓冲溶液。
9.前述权利要求任一项的方法，特征在于所述异源免疫球蛋白是完全免疫球蛋白、或 免疫球蛋白片段、或免疫球蛋白缀合物。
10.权利要求3-8任一项的方法，特征在于所述哺乳动物细胞是CHO细胞、BHK细胞或PER.C6 细胞。
11.权利要求2-10任一项的方法，特征在于通过光遮蔽的测定在90mg/ml的蛋白质浓 度下进行。
全文摘要
本发明报道了通过切向流过滤浓缩免疫球蛋白溶液的方法，其中聚合形式的免疫球蛋白可以在浓缩后移除。
文档编号C07K16/28GK101874040SQ200880117701
公开日2010年10月27日 申请日期2008年11月27日 优先权日2007年11月29日
发明者E·罗森伯格, G·温特, S·黑普比尔迪克勒, W·库恩 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司