治疗性抗-hiv肽的合成方法

专利名称：治疗性抗-hiv肽的合成方法
技术领域：
本发明提供了肽和包含该肽的组合物，以及合成肽的方法。本发明还提供了该治 疗剂的施用方法。具体而言，本发明提供了合成SEQ ID N0:9(TRI-1144)和类似肽的方法。 这种方法采用固相和液相合成步骤来合成并组合特定肽片段组，从而获得目标肽。本发明 还提供了可作为例如合成目标肽(如SEQ ID NO 9)的中间体的单独的肽。本发明进一步 提供了可一起用来制备全长SEQ ID NO :9和类似肽的肽组合。
背景技术：
肽传递系统肽产物作为预防和治疗疾病的治疗剂和/或预防剂具有广泛用途。该种肽产物可以是各种种类，例如激素、酶和免疫调节剂(如抗体、血清蛋白和细胞因子)。为了使肽在患者体内表现出其合适的生物和治疗作用，它们在体内必须以合适的 浓度存在于其作用位点。更具体地，任何特定化合物包括任何特定肽的药代动力学取决于 该化合物在体内的生物利用度、分布和清除。然而，肽的化学性质和特征例如大小、复杂性、 构型需要以及溶解度性质易于使肽具有与其它化合物的药代动力学性质相比次优的药代 动力学性质。因此，本领域已经投入了大量的努力来尝试开发施用治疗剂如肽从而使该治疗剂 的生物利用度和半衰期均得到提高的方式。尽管在这个方面已经取得了一些进展，但本领 域仍需要可用于以所需的药代动力学性质传递肽治疗剂的组合物。本发明提供的组合物和 方法满足了这些需求。发明概述本发明提供了组合物，其能够例如用于将生物活性分子给予患者，和合成这些组 合物的方法。特别地，本发明提供了包含溶剂、胶凝材料和生物活性分子例如抗病毒肽的组 合物。本发明进一步提供了合成方法，其包括线性合成、2片段和3片段方法，以生成包含 抗病毒肽组合物。不受理论限制，本发明提供的实施方案至少部分基于以下意想不到的发 现在组合物中可掺入更高重量百分比的生物活性分子，同时在给予对象后表现出所需的 药代动力学性质。本发明提供的实施方案还至少部分基于由合成方法所得到的意想不到的 结果，例如有关可扩展性和纯度等量度的结果。在一个实施方案中，当给予患者时，本发明所提供的组合物可获得迅速(例如，在 8、12、16、20、24、28、32、36或48小时内)达到Cmax的生物分子血浆浓度，并能提供相对恒定 的该生物分子的血浆浓度5、7、10、14、17、21或28天或更长时间。在具体实施方案中，本发 明所提供的组合物的所需药代动力学性质为更低的Cmax，更长的tmax和更长的ta(ll或tai。
本发明所提供的组合物可例如用于给予包含某些抗病毒肽的组合物，这些抗病毒肽是指 T20 (SEQ ID NO :2)、T1249 (SEQ ID NO 57)、T897 (SEQ IDNO 58)、T2635 (SEQ ID NO 5)、T999 (SEQ ID NO 59)和Tl 144 (SEQ ID NO :9)，或这些肽的两种或多种的组合，和 T20 (SEQ ID NO 2), T1249 (SEQ ID NO :57)、T897 (SEQ ID NO :58)、T2635 (SEQ ID NO :5)、 T999 (SEQ ID NO 59)和 T1144(SEQ ID NO 9)肽的衍生物。在一个实施方案中，这种组合物包含溶剂；胶凝材料，其在溶剂-皮下液体交换后 形成基质；和至少一种生物活性分子，例如抗病毒肽如T20 (SEQ IDNO 2)、T1249 (SEQ ID NO :57)、T897(SEQ ID NO :58)、T2635 (SEQ ID NO :5)、T999 (SEQ ID NO 59)和 Tl 144 (SEQ ID NO 9)或其衍生物。在另一实施方案中，这种组合物还包含至少一种其它成分，例如药学可接受的载 体、大分子或其组合。在又一实施方案中，这种组合物还可包含除了上述列举的抗病毒肽以 外的抗病毒剂。本发明进一步提供了使用本发明所提供的组合物的方法。在一个实施方案中，该 组合物被用作治疗方案例如抗病毒治疗方案的一部分。在某些实施方案中，这种治疗方案 可以例如被用于治疗HIV感染，例如HIV-I感染。在一个实施方案中，本发明提供了使用本发明所提供的组合物抑制HIV向靶细胞 传递的方法，其包括给予患者一定量的本发明所提供的化合物，从而使所述靶细胞与能够 有效抑制所述细胞被所述病毒感染的一定量的活性剂(例如抗病毒肽和/或另一抗病毒 剂)接触。本发明还提供了治疗HIV感染(在一个实施方案中，为HIV-I感染)的方法，其包 括给予HIV-感染患者治疗该HIV感染有效量的本发明所提供的组合物。本发明还提供了在制备用于治疗HIV感染的药物中使用包含有效量的生物活性 分子(例如抗病毒肽)的组合物的方法(例如，用于抑制HIV传递的方法，抑制HIV融合的 方法，和/或治疗或抑制HIV感染的方法)。本发明所提供的组合物和方法的上述和其它的目标、特征和优点通过以下的详细 描述并结合附图将会变得显而易见。附图的简要说明

图1是HIV_lgp41的示意图，显示了七肽重复1区(HRl)和七肽重复2区(HR2)， 其包含公知的亮氨酸拉链状基序INNYTSLI，以及其它gp41功能区。显示的与HRl和HR2相 应的示范性天然氨基酸序列和氨基酸位置编号仅为说明的目的，并与gpl60、HIVIIIB链相关。图2显示了用各种实验室菌株和临床分离物确定的HIV_lgp41的HR2区中所含的 天然氨基酸序列的比较，其用于说明目的，而非进行限制，其中显示了氨基酸序列中的部分 变体(例如多态性)，该氨基酸序列用单字母氨基酸代码表示。出于举例的目的，与顶部的 分离序列中的氨基酸序列INNYTSLI对齐的分离物序列相应于亮氨酸拉链状基序。图3是具有氨基酸序列SEQ ID NO 9的肽的合成示意图，该合成采用了包括装配 2个肽片段的片段缩合法。图4是具有氨基酸序列SEQ ID NO 9的肽的合成示意图，该合成采用了 rink-负 载CTC2片段缩合装配策略。
图5是具有氨基酸序列SEQ ID NO 9的HIV融合抑制剂肽的合成示意图，该合成在2片段缩合法中采用了 Sieber树脂。图6是具有氨基酸序列SEQ ID NO 9的HIV融合抑制剂肽的合成示意图，该合成 在包括装配2个肽片段的方法中采用了 Glu-侧链负载树脂。图7是具有氨基酸序列SEQ ID NO 9的HIV融合抑制剂肽的合成示意图，该合成 采用了包括装配3个肽片段的片段缩合法。图8是具有氨基酸序列SEQ ID NO 9的HIV融合抑制剂肽的合成示意图，该合成 采用了包括装配2个肽片段的片段缩合法。图9显示了在给予含于如下组合物中的T1144后432小时期间短尾猴中的T1144 血浆浓度图1000μ 1 用 ZnSO4 溶液沉淀的 T1144 在 74 11 15 SAIB PLA3L NMP 中的100mg/g悬浮液(89 %肽)(一 ―)，以及400 μ 1用ZnSO4溶液沉淀的Tl 144在 40 60PLA3L NMP 中的 50mg/g 悬浮液(60%肽)(―■—)。图10显示了在给予含于如下组合物中的Tl 144后168小时期间大鼠中的Tl 144血 浆浓度图400μ 1用ZnSO4溶液沉淀的T1144在74 11 15 SAIB PLA3L NMP中的 100mg/g悬浮液(89%肽)(一 —)，以及400 μ 1用ZnSO4溶液沉淀的Tl 144在40 60 PLA3L NMP 中的 50mg/g 悬浮液(60%肽)(―■—)。图11显示了在给予含于如下组合物中的T1144后168小时期间大鼠中的 Tl 144血浆浓度图1200 μ 1的3mg/mL Tl 144溶液(——)，400 μ 1用ZnSO4溶液沉淀 的 Tl 144 在 80 O 20SAIB PLA3M NMP 中的 50mg/g 悬浮液(89 % 肽，2 % 锌) (― —)，400 μ 1 用 ZnSO4 溶液沉淀的 Tl 144 在 75 5 20SAIB PLA3M NMP 中 的50mg/g悬浮液(60%肽，2%锌)(一■—)，以及400μ 1用ZnSO4溶液沉淀的Τ1144在 65 15 20SAIB PLA3M NMP 中的 50mg/g 悬浮液(89%肽，2%锌)(一▲―)。图12显示了在给予含于如下组合物中的T1144后168小时期间大鼠中的T1144 血浆浓度图1200 μ 1的3mg/mL Tl 144溶液(——)，400 μ 1用ZnSO4溶液沉淀的Tl 144在 80 O 15SAIB PLA3M NMP 中的 50mg/g 悬浮液(73 %肽，2 % 锌)(一 ―)，以及 400μ 1 用 ZnSO4溶液沉淀的 Tl 144 在 74 11 15SAIB PLA3M NMP 中的 50mg/g 悬浮 液(73%肽，2%锌)(一■―)。图13显示了在给予含于如下组合物中的T1144后168小时期间大鼠中的T1144 血浆浓度图1200 μ 1的3mg/mL Tl 144溶液(——)，400 μ 1用ZnSO4溶液沉淀的Tl 144在 70 10 20SAIB PLA3M NMP 中的 50mg/g 悬浮液(73 %肽，2 %锌)(一 ―)，以及 400 μ 1 用 ZnSO4 溶液沉淀的 Τ1144 在 75 5 20SAIB PLA3M NMP 中的 50mg/g 悬浮 液(73%肽，2%锌)(一■―)。图14显示了在给予含于如下组合物中的T1144后168小时期间大鼠中的T1144 血浆浓度图1200 μ 1的3mg/mL Tl 144溶液(——)，400 μ 1用ZnSO4溶液沉淀的Tl 144在 70 10 20SAIB PLA3M NMP 中的 50mg/g 悬浮液(73 %肽，2 %锌)(一 ―)，以及 400μ 1 用 ZnSO4溶液沉淀的 Tl 144 在 74 11 15SAIB PLA3M NMP 中的 50mg/g 悬浮 液(73%肽，2%锌)(一■―)。图15显示了在给予含于如下组合物中的T1144后168小时期间大鼠中的T1144 血浆浓度图1200μ 1的3mg/mL T1144溶液(——),400μ 1用ZnSO4溶液沉淀的Τ1144在75 5 20SAIB PLA3M 三乙酰甘油酯中的50mg/g悬浮液(73 %肽，2 %锌) (— —)，40(^1用21^04溶液沉淀的11144在75 5 20SAIB PLA3M 苯甲酸苄酯 中的50mg/g悬浮液(73%肽，2%锌)(一■—)，以及400 μ 1用ZnSO4溶液沉淀的Tl 144在 75 5 20SAIB PLA3M NMP 中的 50mg/g 悬浮液(73%肽，2%锌)(一▲―)。图16显示了在给予含于如下组合物中的T1144后168小时期间大鼠中的 Tl 144血浆浓度图1200 μ 1的3mg/mL Tl 144溶液(——)，400 μ 1用ZnSO4溶液沉淀 的 Τ1144 在 75 5 20SAIB PLA3M NMP 中的 50mg/g 悬浮液(73 % 肽，2 % 锌) (― —)，400 μ 1 用 ZnSO4 溶液沉淀的 Tl 144 在 75 5 20SAIB PLA3M NMP 中 的75mg/g悬浮液(73%肽，2%锌)(一■—)，以及400 μ 1用ZnSO4溶液沉淀的Τ1144在 75 5 20SAIB PLA3M NMP 中的 100mg/g 悬浮液(73%肽，2%锌)(一▲―)。图17显示了在给予含于如下组合物中的T1144后168小时期间大鼠中的T1144 血浆浓度图1200 μ 1的3mg/mL Tl 144溶液(——)，400 μ 1用ZnSO4溶液沉淀的Tl 144在 77 15 8SAIB NMP 乙醇中的 50mg/g 悬浮液(88%肽，2%锌)(一 ―)，200 μ 1 用 ZnSO4溶液沉淀的Tl 144在77 15 8SAIB NMP 乙醇中的100mg/g悬浮液(88%肽， 2%锌)(一■—)，400μ 1 用 ZnSO4 溶液沉淀的 Tl 144 在 74 11 15SAIB PLA3M NMP 中的100mg/g悬浮液(73%肽，2%锌)(一O ―)，以及200 μ 1用ZnSO4溶液沉淀的Tl 144 在 74 11 15SAIB PLA3M NMP 中的 100mg/g 悬浮液(73%肽，2%锌)(一□―)。图18显示了在给予含于如下组合物中的T1144后168小时期间大鼠中的T1144 血浆浓度图1200 μ 1的3mg/mL Tl 144溶液(——)，400 μ 1用ZnSO4溶液沉淀的Tl 144在 70 5 20SAIB PLA3M NMP 中的 50mg/g 悬浮液(89 %肽，2 % 锌)(一 ―)，以及 400 μ 1 用 ZnSO4 溶液沉淀的 Τ1144 在 75 5 20SAIB PLA3M NMP 中的 50mg/g 悬浮 液(89%肽，2%锌)(一■―)。图19显示了在给予含于如下组合物中的T1144后168小时期间大鼠中的T1144 血浆浓度图1200μ 1的3mg/mL T1144溶液(——),400μ 1用ZnSO4溶液沉淀的Τ1144 在 70 5 20SAIB PLA3M NMP 中发 50mg/g 悬浮液(73 % ) (― —)，400 μ 1 用 ZnSO4 溶液沉淀的 Tl 144 在 75 5 20SAIB PLA3M NMP 中的 50mg/g 悬浮液(89% ) (―■ —),400 μ 1用ZnSO4溶液沉淀(73% )并在ZnSO4溶液中浆化(70% )的Τ1144在 75 5 20SAIB PLA3M NMP 中的 50mg/g 悬浮液(一▲ ―)，400 μ 1 喷雾干燥(89% ) 并在 ZnSO4 溶液中菜化(66% )的 Τ1144 在 75 5 20SAIB PLA3M NMP 中的 50mg/g 悬浮液(—ο—)，400 μ 1用ZnSO4溶液沉淀(88% )并在ZnSO4溶液中浆化(71% )的Tl 144 在75 5 20SAIB PLA3M NMP中的50mg/g悬浮液(一揪--)，以及400 μ 1喷雾干燥 (89% )并在 ZnSO4 溶液中菜化(65% )的 Τ1144 在 75 5 20SAIB PLA3M NMP 中的 50mg/g 悬浮液(一χ—)。图20显示了在给予含于如 下组合物中的Tl 144后432小时期间短尾猴中的Tl 144 血浆浓度图800μ 1的3. 5mg/mL Tl 144溶液(——)，400 μ 1用ZnSO4溶液沉淀的Tl 144 在 75 5 20SAIB PLA3M NMP 中的 50mg/g 悬浮液(89 % ) (― —)，400 μ 1 用 ZnSO4 溶液沉淀的 Tl 144 在 74 11 15SAIB PLA3M NMP 中的 100mg/g 悬浮液(89% ) (—■—)以及 ΙΟΟΟμ 1 用 ZnSO4 溶液沉淀的 Tl 144 在 74 11 15SAIB PLA3M NMP 中的 100mg/g 悬浮液(89% ) (― ▲—)。
图21显示了在给予含于如下组合物中的T1144后168小时期间大鼠中的T1144 血浆浓度图1200 μ 1的3mg/mL Tl 144溶液(——)，400 μ 1用ZnSO4溶液沉淀的Tl 144在 40 60PLGA1A NMP 中的 50mg/g 悬浮液(89 %肽，2 %锌)(一 —)，400 μ 1 用 ZnSO4 溶 液沉淀的 Τ1144 在 60 40PLGA1A NMP 中的 50mg/g 悬浮液(89%肽，2%锌)(―■—)， 以及400μ 1用ZnSO4溶液沉淀的Tl 144在40 60PLA3L NMP中的50mg/g悬浮液(88% 肽，2%锌)(一▲—)。 图22显示了在给予含于如下组合物中的T1144后168小时期间大鼠中的T1144 血浆浓度图1200 μ 1的3mg/mL Tl 144溶液(——)，400 μ 1用ZnSO4溶液沉淀的Tl 144在 50 50PLGA1A NMP 中的 50mg/g 悬浮液(73%肽，2%锌)(一 ―)，400 μ 1 用 ZnSO4 溶 液沉淀的Τ1144在40 60PLGA1A 三乙酰甘油酯中的50mg/g悬浮液(73 %肽，2 %锌) (―■ —)，400 μ 1 用 ZnSO4 溶液沉淀的 Tl 144 在 40 60PLGA3A NMP 中的 50mg/g 悬浮液 (73% 肽，2% 锌)(一▲—)，以及 400μ 1 用 ZnSO4 溶液沉淀的 T1144 在 40 60PLA3L NMP 中的50mg/g悬浮液(73%肽，2%锌)(—ο—)。图23显示了在给予含于如下组合物中的Τ1144后168小时期间大鼠中的Τ1144 血浆浓度图1200 μ 1的3mg/mL Tl 144溶液(——)，400 μ 1用ZnSO4溶液沉淀的Tl 144在 50 50PLGA1A NMP 中的 50mg/g 悬浮液(73%肽，2%锌)(一 ―)，400 μ 1 用 ZnSO4 溶 液沉淀的 Τ1144 在 50 50PLGA1A NMP 中的 100mg/g 悬浮液(73%肽，2%锌)(一■―)， 400 μ 1 用 ZnSO4 溶液沉淀的 Tl 144 在 40 60PLGA3A NMP 中的 50mg/g 悬浮液(91 % 肽，2%锌)(一 —)，400μ 1 用 ZnSO4 溶液沉淀的 T1144 在 40 60PLA3L NMP 中的 100mg/g悬浮液(91%肽，2%锌)(一□―)，以及400μ 1用ZnSO4溶液沉淀的Τ1144在 40 60PLA3L NMP 中的 200mg/g 悬浮液(90%肽，2%锌)(一Δ ―)。图24显示了在给予含于如下组合物中的Τ1144后168小时期间大鼠中的Τ1144 血浆浓度图1200 μ 1的3mg/mL T1144溶液(——)，400 μ 1通过喷雾干燥制备的Τ1144在 40 60PLA3M NMP 中的 50mg/g 悬浮液(一 ―)，以及 400 μ 1 用 MeOH 沉淀的 Tl 144 在 40 60PLA3M NMP 中的 50mg/g 悬浮液(88%肽)(―■—)。图25显示了在给予含于如下组合物中的T1144后168小时期间大鼠中的T1144 血浆浓度图1200μ 1的3mg/mL T1144溶液(——),400μ 1用ZnSO4溶液沉淀的Τ1144 在 40 60PLA3L NMP 中的 50mg/g 悬浮液(60% ) (― —), 400 μ 1 经洗涤的 Tl 144 在 40 60PLA3L NMP 中的 50mg/g 悬浮液(94 % ) (― ■ ―)，400 μ 1 用 ZnSO4 溶液沉淀的 Tl 144 在 40 60PLA3L NMP 中的 50mg/g 悬浮液(88% ) (― ▲―)，以及 400 μ 1 从 MeOH/ H2O溶液中沉淀出的Tl 144在40 60PLA3L NMP中的50mg/g悬浮液(91% ) (—ο—)。图26显示了在给予含于如下组合物中的Τ1144后168小时期间大鼠中的Τ1144 血浆浓度图1200 μ 1的3mg/mL T1144溶液(——)，400 μ 1用CaCl2溶液沉淀的Τ1144在 40 60PLA3L NMP 中的 50mg/g 悬浮液(29 % ) (― ―)，400 μ 1 用 CaCl2 溶液沉淀的 Tl 144 在 40 60PLA3L NMP 中的 50mg/g 悬浮液(53% ) (― ■ ―)，400 μ 1 用 FeSO4 溶液 沉淀的 Tl 144 在 40 60PLA3L NMP 中的 50mg/g 悬浮液(88% ) (― ▲—)，以及 400 μ 1 用 FeSO4 溶液沉淀的 Tl 144 在 40 60PLA3L NMP 中的 50mg/g 悬浮液(91 % ) (—ο—)。图27显示了在给予含于如下组合物中的Tl 144后432小时期间短尾猴中的Tl 144 血浆浓度图800μ 1的3. 5mg/mL T1144溶液(——),400μ 1用锌溶液沉淀的Τ1144在40 60PLGA1A NMP 中的 50mg/g 悬浮液(89% ) (― —)，以及 400 μ 1 用 ZnSO4 溶液沉 淀的 Τ1144 在 40 60PLA3L NMP 中的 50mg/g 悬浮液(60%肽)(―■—)。图28显示了在给予含于如下组合物中的T1144后168小时期间短尾猴中的T1144
血浆浓度图1200μ 1 的 3mg/mL Tl 144 溶液(-)，400 μ 1 在 40 60PLA3L NMP 中
的沉淀物H的悬浮液(一□ —),400 μ 1在40 60PLA3L NMP中的沉淀物J的悬浮液 (―O —)，400 μ 1 在 40 60PLA3L NMP 中的沉淀物 M 的悬浮液(一 ―)，以及 400 μ 1 在40 60PLA3L NMP中的沉淀物N的悬浮液(一■―)。图29显示了在SAIB PLA NMP最优大鼠药物(“ΡΚ”)研究#526 中原位形成凝胶的结果。TRI-144在大鼠血浆中的浓度为803-003-Α，悬浮在 SAIB PLA3L NMP(74 11 15)中的用硫酸锌沉淀的 100mg/g TRI-1144 ；803-003-B, 悬浮在 SAIB PLA3L NMP(65 15 20)中的用硫酸锌沉淀的 50mg/g TRI-1144 ； 803-003-C，悬浮在 SAIB PLA3L NMP (70 15 15)中的用硫酸锌沉淀的 50mg/g TRI-1144 ;803-003-D，悬浮在 SAIB PLA3L NMP(75 5 20)的用硫酸锌沉淀的 50mg/ g TRI-1144。图 30 显示了在 SAIB PLA NMP 和 PLGA NMP 比较大鼠 PK 研究#526 中原位形成凝胶的结果。TRI-1144在大鼠血浆中的浓度为803-010-A，悬浮在 SAIB PLA3L NMP(75 5 20)中的用过量硫酸锌沉淀的 50mg/g TRI-1144 ； 803-010-E，悬浮在 SAIB PLA3L NMP(75 5 20)中的用硫酸锌沉淀的 50mg/ gTRI-1144 ;803-010-F，悬浮在PLA3L NMP (40 60)中的用过量硫酸锌沉淀的50mg/g TRI-1144。图31显示了在PLGA最优猴PK研究#527中原位形成凝胶的结果。TRI-1144在 猴血浆中的浓度为0782-096，通过添加过量硫酸锌从水中沉淀出的、悬浮在(50 50) PLA3L NMP (40 60)中的50mg/g TRI-1144 ;803_020，通过添加过量硫酸锌从水中沉淀 出的、悬浮在 SAIB PLA3L NMP(75 11 15)中的 50mg/g TRI-1144。 图32显示了在PLGA最优大鼠PK研究#530和531中原位形成凝胶的结果。 TRI-1144在大鼠血浆中的浓度为0782-099，通过添加过量硫酸锌从50 50甲醇水中 沉淀出的、悬浮在PLA3L NMP(40 60)中的50mg/g TRI-1144 ;0782_102，通过添加过量 硫酸锌从水中沉淀出的、悬浮在PLA3L NMP(40 60)中的50mg/g TRI-1144。图33显示了在PLGA最优大鼠PK研究#552中原位形成凝胶的结果。TRI-1144 在大鼠血浆中的浓度为803-050-1，通过添加硫酸锌从50 50甲醇水中沉淀出的、悬 浮在((50 50) PLGA 2A) NMP (40 60)中的 50mg/g TRI-1144 ;803-050_3，通过添加 硫酸锌从50 50甲醇水中沉淀出的、悬浮在((50 50)PLGA2. 5A) NMP(40 60)中 的50mg/g TRI-1144 ;803-050-4，通过添加硫酸锌从50 50甲醇水中沉淀出的、悬浮在 ((50 50) PLGA 3A) NMP (40 60)中的 50mg/g TRI-1144。图 34 显示了在 PLA-PEG 1500 和 PLGA-PEG 1500 共聚物NMP 大鼠 PK 研究 #553 中原位形成凝胶的结果。TRI-1144在大鼠血浆中的浓度为803-051-2，通过添加硫酸锌 从50 50甲醇水中沉淀出的、悬浮在((65 35)PLGA-PEG1500) NMP(40 60)中 的50mg/g TRI-1144 ;803-051-3，通过添加硫酸锌从50 50甲醇水中沉淀出的、悬浮 在 PLA3L-PEGI500 NMP(40 60)中的 50mg/g TRI-1144 ;803-051_4，通过添加硫酸锌从50 50甲醇水中沉淀出的、悬浮在PLA3L NMP(40 60)中的50mg/g TRI-1144。图35显示了溶剂比例和PLA/NMP最优PK研究#560的结果。TRI-1144在大鼠 血浆中的浓度为803-072-8，通过添加硫酸锌从50 50甲醇水中沉淀出的、悬浮在 PLA3L NMP (40 60)中的 50mg/g TRI-1144 ;803-072_9，通过添加硫酸锌从 50 50 甲 醇水中沉淀出的、悬浮在 PLA3L NMP(30 70)中的 50mg/g TRI-1144 ；803-072-10,ffl 过添加硫酸锌从50 50甲醇水中沉淀出的、悬浮在(50 50PLGA3A) NMP(40 60) 中的 50mg/g TRI-1144。
图36显示了溶剂最优PK研究#561的结果。TRI-1144在大鼠血浆中 的浓度为803-073-3，通过添加硫酸锌从50 50甲醇水中沉淀出的、悬浮在 (PLA3L ((NMP PEG400 (50 50))) (30 70)中的 50mg/g TRI—1144 ;803-073_4，通过 添加硫酸锌从50 50甲醇水中沉淀出的、悬浮在(PLA3L ((NMP PEG400 (50 50))) (40 60)中的50mg/g TRI-1144 ；803-073-5 通过添加硫酸锌从50 50甲醇水中沉淀 出的、悬浮在(PLA3L ((NMP 丙二醇(70 30))) (40 60)中的 50mg/g TRI-1144。图37显示了 PLGA位点清除PK研究#585的结果。TRI-1144在大鼠血浆 中的浓度为782-165-1，通过添加硫酸锌从50 50甲醇水中沉淀出的、悬浮在 (50 50PLGA 2.5A (((NMP PEG400 (50 50))) (40 60)中的 50mg/gTRI_1144 ； 782-165-2，通过添加硫酸锌从50 50甲醇水中沉淀出的、悬浮在(50 50PLGA 2A ((NMP PEG400 (50 50))) (40 60)中的 50mg/g TRI-1144 ;782_165_3 通过添加 硫酸锌从50 50甲醇水中沉淀出的、悬浮在(50 50PLGA1A ((NMP PEG400 (50 50) ))(40 60)中的 50mg/g TRI-1144。发明详述定义本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“患者”指哺乳动物，例如人。在具体 实施方案中，“患者”为需要治疗本发明所公开的疾病或病症(例如HIV或AIDS)的哺乳动 物，例如人。本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“靶细胞”指能被HIV感染的细胞。在 一个实施方案中，该细胞为人类细胞；在另一实施方案中，该细胞为能通过包括膜融合的过 程被HIV感染的人类细胞。在另一实施方案中，该细胞存在于患者中，例如人患者中。本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“组合物”指包含溶剂、胶凝材料和生 物活性分子(例如抗病毒肽)的制剂。本发明描述了示范性的组合物。本发明所提供的组 合物可以例如被用作药剂或被用于制备药剂。本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“溶剂”指可与水混溶的液体。在一 个实施方案中，该溶剂为可与水混溶的液体，并与共溶剂(例如NMP)联合使用。溶剂可被 用于例如充分稀释所述胶凝材料以允许注射至患者。本发明描述了示范性的溶剂，其是本 领域技术人员所公知的。本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“胶凝材料”指可与溶剂混溶的材料， 当存在于包含溶剂和胶凝材料的组合物中时，其在溶剂_皮下液体交换(即，溶剂-皮下患 者液体交换)时形成基质。本发明描述了示范性的胶凝材料，其是本领域技术人员所公知 的。
本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“基质”指胶凝材料在溶剂-皮下液 体交换后所呈现的可生物降解或可生物蚀解的形式。在一个实施方案中，该基质为粘性 (即抗剪切)基质。在另一实施方案中，该基质为凝胶。本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“溶媒”指可用于向患者传递生物活 性分子(例如，肽例如抗病毒肽)的包含溶剂和胶凝材料的液体材料。溶媒可在液体状态 下贮存。
本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“药学可接受的载体”指不明显改变 其所加入的活性成分(例如，HIV融合抑制剂肽)的生物活性的载体介质。药学可接受的载 体包括但不限于以下一种或多种水、缓冲的水、盐水、0. 3%甘氨酸、水性醇、等张水溶液； 并可进一步包含一种或多种物质，例如甘油，油，盐例如钠、钾、镁和铵盐，膦酸酯或盐，碳酸 酯，脂肪酸，糖(例如甘露糖醇)，多糖，聚合物，赋形剂，以及防腐剂和/或稳定剂(用于提 高保质期，或者根据需要和便于所述组合物的生产和分配)。在一个实施方案中，该药学可 接受的载体适于肌肉内、皮下或肠胃外施用。除非另行特别指明，本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“包含异亮氨酸 或亮氨酸的氨基酸”在用于HIV融合抑制剂肽时分别指异亮氨酸或亮氨酸，或它们相应的天 然发生的氨基酸(例如，L-氨基酸)、非天然发生的氨基酸(例如，D-氨基酸)、异构体形式 (例如，正亮氨酸、别异亮氨酸等)或衍生物形式(例如，叔亮氨酸)。氨基酸异亮氨酸或亮 氨酸的一种形式可用于排除该氨基酸的其它形式。本发明所述的HIV融合抑制肽在其氨基 酸序列中，除了本发明所教导氨基酸序列的一个或多个位置处包含具有异亮氨酸或亮氨酸 的氨基酸外，还可包含在HIV gp41的HR2区序列中发现的源自HIV gp41的HR2区域序列 的一个或多个多态性变体(参见，例如图2)。术语“HIV”指人类免疫缺陷型病毒，在一个实施方案中指HIV-I。本发明所用的术语“分离的”在用于生物活性分子，例如抗病毒肽例如HIV融合 抑制剂肽或肽片段时表示其基本不含不构成该生物活性分子的整体结构的一部分的成分， 例如，在化学合成、生产或采用生物、生化或化学过程修饰时基本不含化学前体或其它化学 品。在某些实施方案中，该分离的生物活性分子为按重量超过75%、80%、85%、90%、95%、 97%、99%或 99. 9%纯的。术语“1至3个氨基酸替换”在用于HIV融合抑制剂肽时指HIV融合抑制剂肽除 了与SEQ ID NO :9-15中任一序列相比具有不少于一个且不多于三个的氨基酸差异外，具有 SEQ ID NO :9-15任一序列的氨基酸序列；同时还具有(a)超过一个的亮氨酸拉链状基序和 至少一个不同于形成亮氨酸拉链状基序所需的亮氨酸的额外亮氨酸(即不位于亮氨酸拉 链状基序的位置1或8处)，或(b) 3至5个亮氨酸拉链状基序；并具有抗HIV的抗病毒活 性(在抑制HIV-介导的融合中具有活性)。就此而言，具有替换的HIV融合抑制剂肽的氨 基酸差异(与SEQ ID NO 9-15相比)所处的氨基酸序列位置不同于本发明的HIV融合抑 制剂肽所示的亮氨酸和/或异亮氨酸残基的位置(参见，例如本发明的图示(I)和(II))。 该不少于一个且不超过3个的氨基酸差异包括但不限于保守氨基酸替换(本领域已知包括 具有与所替换氨基酸基本相同的电荷、大小、亲水性和/或芳香性的氨基酸的替换，其范例 包括但不限于甘氨酸_丙氨酸_缬氨酸，色氨酸_酪氨酸，天冬氨酸_谷氨酸，精氨酸_赖 氨酸，天冬酰胺-谷氨酰胺，以及丝氨酸-苏氨酸)和/或多态性变体(例如，如图2所示，或者在HIV-I的实验室、各种分化体和/或临床分离物中发现的)。例如，对于SEQ ID NO 11、12或13，HIV融合抑制剂肽在SEQ ID NO :11、12或13任一序列的氨基酸残基10、17、24、 31和38以外的位置处具有1至3个氨基酸差异。例如，对于SEQ ID NO 9和SEQ ID NO 14，HIV融合抑制剂肽在SEQ ID NO 9或SEQ ID NO 14的氨基酸残基10、17、21、24和38 以外的位置处具有1至3个氨基酸差异。例如，对于SEQ ID NO 10或SEQ ID NO :15，HIV 融合抑制剂肽在SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 15的氨基酸残基10、17、21、31和38以外的 位置处具有1至3个氨基酸差异。这种实施方案的示范性范例包括但不限于SEQ ID NO 16 的氨基酸序列，其中可作为1至3个氨基酸替换的氨基酸差异的位点的位置表示为Xaa(表 示任何天然或非天然发生的氨基酸，即在这个氨基酸位置处可以使用一个以上的可能氨基 酸)。此外，还可产生一个或多个保守氨基酸替换，例如赖氨酸被精氨酸或组氨酸替换，精氨 酸被赖氨酸或组氨酸替换，谷氨酸被天冬氨酸替换，或者天冬氨酸被谷氨酸替换。为了说明 的目的，在氨基酸位置10、17、21、24、31和38处加上了下划线。再参考SEQ ID NO :9_15， 应 注意在SEQ ID NO :16中的“Zaa”用于表示的是可以是亮氨酸或异亮氨酸的氨基酸；Baa 用于表示的是优选为亮氨酸、异亮氨酸，也可以是Xaa的氨基酸，但至少一个Baa为亮氨酸 或异亮氨酸。SEQ ID NO: 16:XaaXaaXaaEAXaaDRAZaaAEXaaAARZaaEAZaaZaaRABaaXaaEXaaXaaEKBaaEAAZaaREZaa本发明所述的HIV融合抑制剂肽还可以例如包括衍生自HIV gp41的HR2区的肽， 该HIV gp41的HR2区对应于HIV-I的实验室、分化体或临床分离物，例如图2列举的实验 室菌株和临床分离物中存在的SEQ ID NO :5(通过序列比对)，只要该HIV融合抑制剂肽满 足SEQ ID NO: 16的氨基酸要求。在一个实施方案中，这种HIV融合抑制剂肽显示与SEQ ID NO 9-15中任一序列相比具有1至3个氨基酸替换。在一个实施方案中，该HIV融合抑制剂 肽还包含N-末端封端基团或C-末端封端基团，或两者，且这些末端基团可包括但不限于 N-末端的氨基基团或乙酰基基团；以及C-末端的羧基基团或酰胺基基团。本发明所述的HIV融合抑制剂肽还可包括显示具有US 2006/0247416 (其全部内 容在此通过引用并入本文)所公开的任意肽的变体氨基酸序列的肽，只要该HIV融合抑制 剂肽满足SEQ ID NO :16的氨基酸要求。在一个实施方案中，这种HIV融合抑制剂肽显示与 SEQ ID NO 9-15中任一序列相比具有1至3个氨基酸替换。在优选的实施方案中，该HIV 融合抑制剂肽的长度为14至60个氨基酸残基。在一个实施方案中，该HIV融合抑制剂肽还 包含N-末端封端基团或C-末端封端基团，或两者，且这些末端基团可包括但不限于N-末 端的氨基基团或乙酰基基团；以及C-末端的羧基基团或酰胺基基团。本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“反应性官能团”指能够与另一化学 基团或化学部分形成键的化学基团或化学部分。对于化学基团，反应性官能团是本领域技 术人员公知的，包括但不限于马来酰亚胺、硫醇、羧酸、氢、磷酰基、酰基、羟基、乙酰基、疏 水基、胺、酰胺、丹酰基、磺基、丁二酰亚胺、硫醇反应性基团、胺反应性基团、羧基反应性基 团等。一种反应性官能团可用于排除另一反应性官能团。本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“接头”指可作为分子桥以可操作地 连接两个不同分子的化合物或部分(例如，接头的第一反应性官能团共价偶联至大分子载体的反应性官能团，而该接头的第二反应性官能团共价偶联至HIV融合抑制剂肽的反应性官能团)。该接头可以是氨基酸，例如在生成含有所述HIV融合抑制剂肽的一个或多个拷 贝的重组融合蛋白时。可替代性地，所述两个不同的分子可以分步方式连接至接头(例如， 通过化学偶联)。总体而言，对于接头没有具体的大小或成分限制，只要其能够满足作为分 子桥的目的。接头是本领域技术人员公知的，包括但不限于化学链、化学化合物(例如，试 剂)、氨基酸等。接头可包括但不限于同基双功能接头、异基双功能接头、生物稳定接头、可 水解接头和可生物降解接头，以及本领域已知的其它接头。如本领域技术人员公知，异基双 功能接头包含具有第一反应性官能团的一端以特异性连接第一分子，和具有第二反应性官 能团的相对端以特异性连接至第二分子。本领域技术人员了解，各种单功能、双功能和多功 能试剂(例如在Pierce Chemical Co.，Rockford，III.的目录中所描述的那些试剂)可被 用作接头。接头的长度和装配可根据需要连接的分子、实施连接的条件以及施用时的理想 药代动力学特性等因素改变，以优化特性，例如生物活性和功能的保存、稳定性、某些化学 和/或温度参数的耐受性、体内易于裂解性、以及充分的立体选择性或大小。本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“大分子载体”指连接、结合或融合 (例如，化学地或通过采用遗传表达的重组方式)至一种或多种本发明的肽的分子，因而该 分子能够相对于缺乏该分子的所述一种或多种肽赋予如下一种或多种特性该一种或多种 肽的稳定性，该一种或多种肽的生物活性的提高，或者该一种或多种肽的血浆半衰期的提 高(例如，延长该一种或多种肽在体内的存在时间)。这种大分子载体是本领域公知的，包 括但不限于血清蛋白、聚合物、碳水化合物以及脂质-脂肪酸缀合物。通常用作大分子载 体的血清蛋白包括但不限于传递蛋白、白蛋白(优选人白蛋白)、免疫球蛋白(优选人IgG 或其一个或多个链)或激素。通常用作大分子载体的聚合物包括但不限于聚赖氨酸或聚 (D-L-丙氨酸)_聚(L-赖氨酸)或多元醇。多元醇可包含水溶性聚(烯基氧化物)聚合 物，并可具有线性或支链化的链。聚合物可以是支链多元醇(例如PEG，具有多条(例如，3 条或更多条)链，其分别直接或通过接头偶联至HIV融合抑制剂肽)；在一个实施方案中， 支链多元醇在体内条件下是可生物降解的和/或随时间裂解的。合适的多元醇包括但不限 于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)以及PEG-PPG共聚物。在一个实施方案中，多元醇包括 具有约1，000道尔顿至约20，000道尔顿平均分子量的PEG。可使用通常具有大于20，000 道尔顿的分子量的其它类型大分子载体，其是本领域公知的。本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“化学保护基团”或“CPG”表示用于 阻断包含胺基团的反应性官能团与另一反应性官能团发生化学反应的化学部分。化学保 护基团是肽合成领域公知的，包括但不限于Dmcp(二甲基环丙基甲基)、Bsmoc(苯并[b] 噻吩砜-2-甲氧基羰基)、tBu(叔丁基)、trt(三苯基甲基(三苯甲基))、0tBu(叔丁氧 基)、Boc或t-Boc (叔丁氧基羰基)、Fmoc (9-芴基甲氧基羰基)、Aoc (叔戊烷氧基-羰 基)、TEOC ( β -三甲基乙基氧羰基)、CLIMOC (2-氯-1-茚满基甲氧基羰基)、BIMOC (苯 并-[f]-茚-3-甲氧基羰基)、？8 (2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基)、 2-Cl-Z(氯苄基-氧羰基)、Alloc (烯丙氧基羰基)、Cbz (苯甲氧基羰基)、Adoc (金炕 氧基-羰基)、Mcb (1-甲基环丁氧基羰基)、Bpoc (2-(对双苯基基)丙基-2-氧羰基)、 Azoc (2-(对苯基偶氮苯基)丙基-2-氧羰基)、Ddz (2，2 二甲基-3，5- 二甲氧基苄基-氧 羰基)、MTf (4-甲氧基-2，3，6-三甲氧基苯磺酰基)、PMC (2，2，5，7，8-五甲基色原烷-6-磺酰基)、Tos (甲苯磺酰基)、Hmb (2-羟基-4-甲氧基苄基)、Poc (2-苯基丙基-2-氧羰基)、Dde (1-(4，4- 二甲基-2，6- 二氧代环己 基亚基)乙基)、ivDde (1-(4，4- 二甲基-2，6- 二 氧代-环己-1-基亚基)-3-甲基丁基)、苄基、丹酰基、对硝基苄酯等。一个化学保护基团 可用于排除另一化学保护基团。本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“脱保护”是本领域公知的，指从含有 一个或多个化学保护基团的分子去除一个或多个化学保护基团的过程，其中该分子包含氨 基酸、肽片段或HIV融合抑制剂肽。一般而言，该脱保护过程包括将由一个或多个化学保护 基团保护的分子与去除该化学保护基团的化学剂反应。例如，由化学保护基团保护的N-末 端α氨基基团可与碱反应以去除对碱不稳定的化学保护基团(例如，Fmoc等)。化学保护 基团(例如，Boc、TEOC、Aoc、Adoc、Bopc、Ddz、Cbz等)可通过酸去除。其它化学保护基团， 特别是由羧酸衍生的基团，可通过酸或碱去除。本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“衍生物”指亲代化合物通过用另一 原子或原子基团替换一个或多个原子得到的化合物，对于抗病毒化合物而言，优选保留所 有或基本所有该亲代化合物的抗病毒活性。术语“第一”、“第二”、“第三”等可用于(a)表示顺序；或者(b)区别分子或分子 的反应性官能团；或者(c) (a)和(b)的组合。然而，术语“第一”、“第二”、“第三”等不应解 释为限制本发明。本发明在说明书和权利要求书中所用的有关本发明的HIV融合抑制剂肽的术语 “肽片段”和“中间体”在此可同义使用，表示包含长度不少于约5个氨基酸且不超过约30 个氨基酸的氨基酸序列并且包含HIV融合抑制剂肽的氨基酸序列的至少一部分(作为连续 氨基酸)的肽。参见本发明实施例4-7和表4、5、7和8中的可用于制备SEQ ID NO :9和 10的肽片段的示范性例子。此外，尽管在优选实施方案中肽片段(单独地或组合成组以形 成HIV融合抑制剂肽)被合成为使氨基酸残基之间形成肽键，但本领域技术人员可以容易 地了解，可使用本领域技术人员公知的反应形成非肽键(例如，亚氨基、酯、酰胼、偶氮、氨 基脲等)。本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“药代动力学特性”指组合物中全身 可用的生物活性分子(例如抗病毒肽)随时间的总量。药代动力学特性可通过测定生物活 性分子(例如，抗病毒肽)在施用后在体内随时间的总全身浓度来确定。例如，药代动力学 特性可表示为曲线下面积(AUC)、生物半衰期和/或清除率。AUC是全身生物活性分子浓度 随时间的综合量度，单位为质量时间/体积。在施用一定剂量的生物活性分子后，从给药时 到体内没有残余活性成分时的AUC是个体暴露于生物活性分子(和/或该生物活性分子的 代谢产物)的量度。当组合物所含的生物活性分子与不同于本发明所述的制剂中所含的生 物活性分子相比具有(a)更长的(“提高的”)生物(终末)半衰期(“tl/2)，(b)降低 的生物(总体)清除率(Cl)，(c)更长的持续释放属性，(d)更高的掺入该组合物中的重量 百分比(例如，约10%或更高)，(e)下降的或更小的Cmax，(f)更长的tmax，以及(g)更长的 ta(ll或、]时，该组合物具有“改善的”或“提高的”药代动力学特性。在一个实施方案中， 改善的药代动力学表示生物活性分子的清除率与比较制剂相比降低，例如通常降低至约二 分之一至约十分之一。在另一实施方案中，改善的药代动力学表示与比较制剂相比生物半 衰期提高了约10%至约60%。改善的药代动力学还可同时包括清除率降低和生物半衰期提高。在一个实施方案中，理想的药代动力学特性包括迅速达到Cmax(例如，在8、12、16、20、 24、28、32、36或48小时内)，并随后维持相对恒定的血浆浓度5、7、10、14、17、21或28天 或更长时间。在某些实施方案中，本发明所提供的组合物所需的药代动力学特性为更低的 Cmax、更长的tmax和更长的ta(11或tai。用于计算血浆浓度相对时间曲线下的面积(AUC)、总 体清除率(Cl)以及终末半衰期(tl/2)的等式列于本发明的实施例1中。本发明在说明书和权利要求书中所用的有关溶解有一种或多种固体的水性液体 的本领域标准术语“在溶液中”指在本发明更详细描述的浓度和温度实际使用条件下包含 溶解有生物活性分子(例如HIV融合抑制剂肽)且符合本领域可注射用药物制剂标准的水 性溶液。本领域中存在各种方式来区分悬浮液形式和溶液形式，例如检查视觉澄清度(溶 液的透明度相对悬浮液的浊度)、光传输等。“溶解度”可通过在没有显示出可观察到的溶 液沉淀或含有所述生物活性分子的水性液体胶凝的水性液体溶液中存在的生物活性分子 (例如HIV融合抑制剂肽)的量(例如，重量百分比)来确定。本发明在说明书和权利要求书中所 用的术语“持续释放”指生物活性分子在给予 后持续释放指定的时间段。本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“有效量”指能够实现特定方法的所 需结果的生物活性分子的量。在一个实施方案中，生物分子的有效量是足以(通过其自身 和/或与给药方案结合)降低(例如，相对于缺乏该生物活性分子的情况)患者HIV病毒 载荷的量。在另一实施方案中，生物分子的有效量是足以抑制(例如，相对于缺乏该生物活 性分子的情况)细胞被HIV感染或抑制病毒进入靶细胞的量。该种抑制可通过本领域已知 的测定进行测量。在另一实施方案中，生物分子的有效量是足以改善与HIV感染相关的症 状的量。生物分子的有效量可由本领域技术人员采用本领域技术人员公知的常规体外和体 内研究获得的数据进行确定。本发明在说明书和权利要求书中所用的术语“治疗”或“疗法”或其语法上等同的 术语在有关HIV感染时可互换使用，表示包含生物活性分子(例如HIV融合抑制剂肽)的组 合物可用于影响与HIV感染相关的一个或多个过程或者影响用作测定该种治疗或疗法(例 如，“治疗性应用”)的疗效的指标的一个或多个参数或终点。例如，该生物活性分子可用于 抑制如下一种或多种过程HIV向靶细胞的传递；HIV和靶细胞之间的融合(“HIV融合”)； 病毒进入(HIV或其遗传物质在感染过程中进入靶细胞的过程)；以及合胞体形成(例如， HIV感染细胞和靶细胞之间的融合)。在评估药物在HIV感染的治疗或疗法中的效力时，病 毒抑制(通过本领域已知的测定体液或组织中HIV的病毒载荷的方法测定)常用作主要终 点，而血流中的循环CD4+细胞数量上升常用作次要终点，两者均是抑制HIV向靶细胞传递 的可测量效果。因此，包含生物活性分子(例如HIV融合抑制剂肽)的组合物可用于影响 治疗性应用，包括病毒抑制和/或提高循环CD4+细胞的相对数量。组合物本发明提供了可用于给予患者生物活性分子的组合物。特别地，本发明提供了包 含溶剂、胶凝材料和生物活性分子(例如抗病毒肽)的组合物。不受理论限制，本发明所提 供的实施方案至少部分基于以下意想不到的发现在组合物中可掺入更高重量百分比的生 物活性分子，同时在给予患者后表现出所需的持续释放性质。本发明所述的组合物在给予 患者并发生溶剂_皮下液体交换时可原位形成包含基质的凝胶组合物。
在一个实施方案中，本发明所提供的组合物在给予患者时可获得迅速(例如，在 8、12、16、20、24、28、32、36或48小时内)达到Cmax的生物分子血浆浓度，并能提供相对恒定 的该生物分子的血浆浓度5、7、10、14、17、21或28天或更长时间。在具体实施方案中，本发 明所提供的组合物的所需药代动力学性质为更低的Cmax、更长的tmax以及更长的ta(ll或ta lt)本发明所提供的组合物可例如用于给予包含某些抗病毒肽的组合物，这些抗病毒 肽是指 T20 (SEQ ID NO :2)、T1249 (SEQ ID NO 57)、T897 (SEQ IDNO 58)、T2635 (SEQ ID NO 5)、T999 (SEQ ID NO 59)和Tl 144 (SEQ ID NO :9)，或这些肽的两种或多种的组合，和 T20 (SEQ ID NO :2)、T1249(SEQ ID NO :57)、T897 (SEQ ID NO :58)、T2635 (SEQ ID NO :5)、 T999 (SEQ ID NO 59)和 T1144(SEQ ID NO 9)肽的衍生物。在一个实施方案中，所述组合物包含溶剂；胶凝材料，其在溶剂-皮下液体交换后 形成基质；和至少一种生物活性分子，例如抗病毒肽如T20 (SEQ IDNO 2)、T1249 (SEQ ID NO :57)、T897(SEQ ID NO :58)、T2635 (SEQ ID NO :5)、T999 (SEQ ID NO 59)和 Tl 144 (SEQ ID NO 9)或其衍生物。该组合物可以，例如，在给予 前作为溶液或悬浮液存在。该溶液或悬 浮液可以是水性的或者包含有机溶剂。在一个实施方案中，该组合物可在室温下贮存达18 个月。一旦给予和暴露至患者皮下空间的液体，该胶凝材料可形成可生物降解或至少可生 物蚀解的基质。因此，在一个实施方案中，该组合物可以以液体形式给予(例如，通过皮下 注射)至有此需要的患者。所得的基质可以，例如，作为该生物活性分子的持续释放基质。本发明所提供的组合物通常包含至少一种胶凝材料，其量足以在给予至患者时形 成基质(例如，约 50-1000mg/g、100-900mg/g、150-900mg/g、200-900mg/g、250-900mg/g、 500-900mg/g、750-900mg/g或750_1000mg/g)。在一个实施方案中，胶凝材料的合适的量 (mg/g)可通过以溶媒比例添加溶媒胶凝材料组合物并乘以10来测定。在一个实施方案中， 该胶凝材料为丙交酯或乙交酯聚合物。在具体实施方案中，该胶凝材料为蔗糖醋酸异丁酸 酯(SAIB)、聚丙交酯(PLA，例如PLA3L、PLA3M或PLA-PEG)或聚丙交酯-共-乙交酯(PLG， PLGA例如PLGA1、PLGA-葡萄糖或PLGA-PEG)。本发明所提供的组合物还可包含生物活性分 子，例如抗病毒肽。在一个实施方案中，本发明所提供的组合物包含足够浓度的所述生物活 性分子，从而使有效剂量的该生物活性分子在给予至患者后从形成的基质中释放，例如以 持续释放方式释放。本发明所提供的组合物通常包含至少5%浓度的生物活性分子，并以该浓度的生 物活性分子施用。因此，在一个实施方案中，本发明所提供的组合物包含等于或为该组合物 重量的约 5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、20%或更多量的生物 活性分子(例如，抗病毒肽)。在一个实施方案中，本发明所提供的组合物包含约80-90mg/ ml、90-100mg/ml、100_105mg/ml、105-1lOmg/ml、110_125mg/ml、125_130mg/ml、130_140mg/ ml、140-150mg/ml、150-200mg/ml、200-250mg/ml、250-300mg/ml 的生物活性分子。在具体实施方案中，本发明所提供的组合物在给予至患者时形成基质，在给予该 组合物后，该基质提供该生物活性分子的初始突释，然后持续释放该生物活性分子至少5、 7、10或14天。在某些实施方案中，通过给予患者本发明所提供的组合物所产生的生物活 性分子的初始突释是Cmax，至少或大约为1μ g/ml、2l·! g/ml、3l·! g/ml、4l·! g/ml、5l·! g/ml、 6 μ g/ml>7 μ g/ml>8 μ g/ml>9 μ g/ml>10 μ g/ml、llμ g/ml>12 μ g/ml>13 μ g/ml、14y g/ml 或15 μ g/ml或更高，在该组合物施用后2、4、6、8、10、12、14、16、18、20或24小时内达到。在某些实施方案中，通过给予患者本发明所提供的组合物所产生的生物活性分子的持续释放是在给予该组合物后至少5、7、10、14、21、25或28天或更长时间内释放大于或等于0. 1 μ g/ ml、0. 5 μ g/ml、l μ g/ml、l. 25 μ g/ml、l. 5 μ g/ml 或 2. 0 μ g/ml 或更多。在另一实施方案中，本发明提供了组合物，该组合物在给予至患者后形成基质 (例如，原位)，并且在给予12小时内提供至少10 μ g/ml的生物活性分子(例如，抗病毒 肽)Cmax，随后以至少1 μ g/ml的血浆水平持续释放至少7天。在一个实施方案中，本发明所提供的包含抗病毒肽的组合物进一步包含至少一种 其它成分，例如药学可接受的载体、大分子或其组合。在另一实施方案中，所述组合物包含一种或多种其它生物活性分子。在一个实 施方案中，该组合物可包含T20、T1249、T897、T2635、T999或T1144肽或其衍生物。在另 一实施方案中，这种组合物可包含或进一步包含一种或多种其它抗病毒剂。自身或作为组 合治疗方案的一部分可用于该组合物的其它抗病毒剂包括但不限于DP107(T21)或任意 其它抗病毒多肽，例如美国专利6，541，020B1 (全文通过引用并入本文)所述的那些。治 疗剂的其它示范性非限制性范例包括抗病毒剂，如细胞因子如rIFNa、rIFN^、rIFNy ； 逆转录酶抑制剂，包括但不限于阿巴卡韦、AZT (齐多夫定)、ddC (扎西他滨)、奈韦拉平、 ddl (地达诺新)、FTC(恩曲他滨)、(+)和(-)FTC、reverset、3TC(拉米夫定)、GS 840、 GW-1592、GW-8248、GW-5634、HBY097、地拉韦定、依法韦仑、d4T(司他夫定)、FLT、TMC125、 阿德福韦、替诺福韦以及阿洛夫定；蛋白酶抑制剂，包括但不限于安泼那韦、CGP-73547、 CGP-61755、DMP-450、印地那韦、那非那韦、PNU-140690、利托那韦、沙奎那韦、替利那韦、 替拉那韦、阿扎那韦、洛匹那韦、ABT378、ABT538和MK639 ；病毒mRNA加帽抑制剂，例如 三氮唑核苷；作为具有抗-HIV活性的脂质结合分子的两性霉素B ；作为糖蛋白加工抑制 剂的澳粟精胺；病毒进入抑制剂，如融合抑制剂(恩夫韦肽、T1249、其它融合抑制剂肽 以及小分子)、SCH-D (Schering-Plough)、UK-427857 (Pfizer)、TNX-355 (Tanox Inc.)、 AMD-O70 (AnorMED) 、Pro 140、Pro 542 (Progenies) 、FP-21399 (EMD Lexigen) 、BMS806、 BMS-488043 (Bristol-Myers Squibb)、maraviroc (UK-427857)、0N0-4128、GW-873140、 AMD-887、CMPD-167 以及 GSK-873, 140 (GlaxoSmithKline) ；CXCR4 拮抗剂，例如 AMD-070 ；月旨 质和/或胆固醇相互作用调节剂，例如盐酸普鲁卡因(SP-01和SP-01A)；整合酶抑制剂， 包括但不限于L-870和810 ；RNAseH抑制剂；rev或REV的抑制剂；vif的抑制剂(例如， vif-衍生的脯氨酸富集肽、HIV-I蛋白酶N-末端衍生肽)；病毒加工抑制剂，包括但不限于 白桦苷和二氢白桦苷衍生物(例如PA-457)；以及免疫调节剂，包括但不限于AS-101、粒细 胞巨噬细胞集落刺激因子、IL-2、丙戊酸以及胸腺喷丁。在一个实施方案中，本发明提供了组合物，其中生物活性分子(例如，抗病毒肽) 被溶解。在另一实施方案中，本发明提供了组合物，其中生物活性分子(例如，抗病毒肽) 被悬浮。在另一实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如， 抗病毒肽)呈喷雾干燥形式。在另一实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如， 抗病毒肽)呈包含盐(例如，金属盐)的喷雾干燥形式。
在另一实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如， 抗病毒肽)呈包含锌的喷雾干燥形式。在另一实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如， 抗病毒肽)呈包含钙的喷雾干燥形式。在另一实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如， 抗病毒肽)呈包含铁的喷雾干燥形式。在另一实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如， 抗病毒肽)呈沉淀形式。在另一实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如， 抗病毒肽)呈包含盐(例如，金属盐)的沉淀形式。在另一实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如， 抗病毒肽)呈包含锌的沉淀形式。
在另一实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如， 抗病毒肽)呈包含钙的沉淀形式。在另一实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如， 抗病毒肽)呈包含铁的沉淀形式。在另一实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如， 抗病毒肽)呈包含镁的沉淀形式。在另一实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如， 抗病毒肽)呈包含铜的沉淀形式。在另一实施方案中，本发明提供了组合物，其中所述悬浮的生物活性分子(例如， 抗病毒肽)呈包含铝的沉淀形式。在另一实施方案中，本发明提供了包含约1-15%、1-14%、1-13%、1_12%、 1-11%, 1-10 %,1-9% ,1-8%, 1-7 %,1-6%,1-5%, 1-4%、1-3 %、1-2 %、5_15 %、7_15 %、 5-10%、7-10%或10-15%盐，例如金属盐的组合物。在进一步的实施方案中，本发明提供了 包含盐，例如金属盐的组合物，该盐与生物分子，例如抗病毒肽的摩尔比例为1 1。可用于 本发明所提供的组合物的金属盐的具体范例包括但不限于锌、钙和铁。改变胶凝材料在本发明所提供的组合物中的比例可以调节，例如提高或优化生物 分子从在本发明所提供的组合物给予至患者时形成的基质传递的速率。在具体实施方案 中，降低本发明所提供的组合物中的SAIB PLA比例可导致患者体内在任意特定时间的生 物分子血浆浓度升高，并可增加患者体内维持生物分子特定血浆水平的持续时间。在具体实施方案中，在本发明所提供的组合物中用NMP替代三乙酰甘油酯或苯甲 酸苄酯作为溶剂可导致患者体内在任意特定时间的生物分子血浆浓度升高，并可增加患者 体内维持生物分子特定血浆水平的持续时间。在特定实施方案中，用NMP替代三乙酰甘油 酯作为溶剂可导致Cmax上升。在另一实施方案中，增加本发明所提供的组合物所给予的注射体积(例如，加倍) 可导致患者体内在任意特定时间的生物分子血浆浓度升高，并可增加患者体内维持生物分 子特定血浆水平的持续时间。在另一实施方案中，所用的胶凝材料的类型(例如PLA)可影响本发明所提供的组合物的药代动力学参数。在具体实施方案中，将PLA类型由3L改为3M可导致Cmax下降，tmax 上升以及tQ.Q1上升。 在另一实施方案中，改变本发明所提供的组合物中的胶凝材料相对于溶剂的比例 可以影响生物分子的传递速率。在具体实施方案中，增加本发明所提供的组合物中的胶凝 材料相对于溶剂的比例(例如PLGAlA相对于NMP的比例)可导致Cmax下降，tmax上升以及 to. 01上升。在另一实施方案中，改变聚合物类型和分子量可以提高生物分子的传递速率。在 具体实施方案中，提高聚合物分子量和/或提高L G (丙交酯乙交酯)比例可导致Cmax 下降，tmax上升以及ta(ll上升。在另一实施方案中，提高本发明所提供的组合物中的肽浓度(例如，加倍)可导致 Cmax下降，tmax上升以及Vtll下降。在另一实施方案中，提高溶媒中的胶凝材料(例如PLGA)的量可导致Cmax下降，tmax 上升以及ta(ll下降。在另一实施方案中，提高溶媒(例如，含SAIB的溶媒)中的胶凝材料(例如PLA) 的量会减缓本发明所提供的组合物中的生物分子的释放(例如，降低Cmax，增加tmax和/或 增加ta(ll)。在具体实施方案中，将溶媒中PLA的量由增加至5%会进一步减缓本发明 所提供的组合物中的生物分子的释放。在另一实施方案中，将溶媒中的PLA的量由5%增加 至10%会进一步减缓本发明所提供的组合物中的生物分子的释放。溶剂可用于本发明所提供的组合物和方法中的溶剂包括可充分稀释所述胶凝材料以 允许将该组合物注射至患者的任意与水混溶的液体。在一个实施方案中，该溶剂为N-甲 基-2-吡咯炕酮(NMP)。其它合适的溶剂包括但不限于水、醇(例如，甲醇、乙醇、异丙醇和 苄醇)、二醇(例如，聚乙二醇、丙二醇和四甘醇)、苯酸酯(例如，苯酸乙酯和苯甲酸苄酯)、 甘油酯(例如，单、双和三甘油酯)、三乙酰甘油酯以及药学可接受的酯(例如，乳酸乙酯和 碳酸丙酯)。胶凝材料可用于本发明所提供的组合物和方法的胶凝材料包括在溶剂_皮下液体交换后 形成基质的任意与溶剂混溶的材料。在一个实施方案中，该胶凝材料为蔗糖醋酸异丁酸酯 (SAIB)或其衍生物，例如，特级的蔗糖醋酸酯或蔗糖醋酸异丁酸酯(SAIB-SG)。在另一实施 方案中，该胶凝材料为聚丙交酯(PLA)，例如PLA3L或PLA3M。在另一实施方案中，该胶凝 材料为聚丙交酯-共-乙交酯(PLG、PLGA、PLGA-葡萄糖或其衍生物例如PLGA-PEG1500或 PLA-PEG1500)。在另一实施方案中，该胶凝材料为聚己内酯或其衍生物或其丙交酯/乙交 酯共聚物。PLA和PLGA在丙交酯乙交酯比例、分子量及其末端基团方面不同。分子量以 名称中的数字分级。该分子量约为该数值的10000倍。该末端基团为羧酸(A)、甲酯(M)或 月桂酯基(L)。在一个实施方案中，本发明所提供的化合物可包含具有相同或不同重量百分比的 两种或多种不同胶凝剂。在具体实施方案中，该胶凝材料是两种或多种选自PLA、PLG、PLGA 或PLGA-葡萄糖的材料的混合物。在某些实施方案中，所述胶凝材料以约5-95% (重量)、约5-90% (重量)、约10-90% (重量)、约 10-85% (重量)、约 15-85% (重量)、约 20-85% (重量)、约 30-85% (重量)、约30-80% (重量)、约30-70% (重量)、约30-65% (重量)、约30-60% (重 量)、约40-85% (重量)、约45-85% (重量)、约50-85% (重量)、约55-85% (重量)、约 60-85% (重量)、约 65-85% (重量)、约 70-85% (重量)、约 75-85% (重量)、约 80-85% (重量)、约1-15% (重量)、约5-15% (重量)或约10-15%的量存在。在另一实施方案中，所述胶凝材料以约25-900mg/g、100_900mg/g、200_900mg/ g、300-900mg/g、400-900mg/g、500-900mg/g、100-800mg/g、100-700mg/g、100-600mg/ g、100-500mg/g、200-800mg/g、300-600mg/g、25-250mg/g、25-200mg/g、25-150mg/g、 50-150mg/g、50-100mg/g、50mg/g、75mg/g 或 lOOmg/g 的量存在。肽对于作为抗病毒肽的生物活性分子，本领域已知的任意抗病毒肽均可用于本发明 所提供的组合物和方法。在一个实施方案中，该抗病毒肽为T20、T1249、T897、T2635、T999 或Τ 1144肽或其衍生物。可用于本发明所提供的组合物和方法的具体抗病毒肽包括衍生自具有SEQ ID NO :5氨基酸序列的基础氨基酸序列(“基础序列”)的HIV融合抑制剂肽，但其中每种HIV 融合抑制剂肽与基础序列的不同之处在于在其氨基酸序列中具有一个以上的亮氨酸拉链 状基序，并且在其氨基酸序列中除形成亮氨酸拉链样基序所必需的亮氨酸以外具有至少一 个额外的亮氨酸(即在所述序列中除亮氨酸拉链样基序的氨基酸位点1或8以外的氨基 酸；例如在SEQ IDNO 5的氨基酸位点21用亮氨酸替换异亮氨酸)。可用于本发明所提供的组合物和方法的其它抗病毒肽包括衍生自具有SEQ ID NO :5氨基酸序列的基础氨基酸序列(“基础序列”)的HIV融合抑制剂肽，但是其中每种HIV 融合抑制肽与基本序列的不同在于其氨基酸序列中具有多于两个的亮氨酸拉链样基序。可用于本发明提供的组合物和方法的其它抗病毒肽包括一系列HIV融合抑制肽， 其中每种HIV融合抑制肽(a)包含衍生自HIV gp41的HR2区域的氨基酸序列；(b)具有 不少于2个且不多于5个亮氨酸拉链样基序的氨基酸序列；(c)在其氨基酸序列中除亮氨 酸拉链样基序的氨基酸位点1或8以外具有至少一个额外的亮氨酸(例如，与SEQ ID NO 5-7中任何一个或多个序列的基本序列比较)；并且任选地(d)在一种或多种生物学性质方 面显示出意想不到的改善。在一个实施方案中，该HIV融合抑制肽包含衍生自HIV gp41的 HR2区域的氨基酸序列，其中该氨基酸序列包含HR2亮氨酸拉链样基序，例如图1或图2显 示的HR2亮氨酸拉链样基序。在优选实施方案中，该HIV融合抑制肽长度为14到60个氨 基酸残基。在一个实施方案中，该HIV融合抑制肽进一步包含N末端封闭基团或C末端封 闭基团或两者；这些末端封闭基团可包括但不限于位于N末端的氨基或乙酰基；以及位于 C末端的羧基或酰胺基。可用于本发明提供的组合物和方法的其它抗病毒肽包括HIV融合抑制肽，其中每 种HIV融合抑制肽(a)包含衍生自HIV gp41的HR2区域的氨基酸序列；(b)具有含有多于 2个且不多于5个亮氨酸拉链样基序的氨基酸序列；并且(c)在其氨基酸序列中除亮氨酸 拉链样基序的氨基酸位点1或8以外具有至少一个额外的亮氨酸(例如，与SEQ ID NO 5-7 中任何一个或多个序列的基本序列比较)；并且(d)在一种或多种生物学性质方面显示出 意想不到的改善。在一个实施方案中，该HIV融合抑制肽包含衍生自HIV gp41的HR2区域的氨基酸序列，其中该氨基酸序列包含HR2亮氨酸拉链样基序，例如图1或图2显示的HR2亮氨酸拉链样基序。在优选实施方案中，该HIV融合抑制肽长度为14到60个氨基酸残基。 在一个实施方案中，该HIV融合抑制肽进一步包含N末端封闭基团或C末端封闭基团或两 者；这些末端基团可包括但不限于位于N末端的氨基或乙酰基；以及位于C末端的羧基或
酰胺基。可用于本发明提供的组合物和方法的其它抗病毒肽包括具有与SEQ IDNO 5相似 的氨基酸序列的HIV融合抑制肽，除了该HIV融合抑制肽氨基酸序列(a)具有多于一个的 亮氨酸拉链样基序，并且具有除了形成亮氨酸拉链样基序所需要的亮氨酸以外(即除亮氨 酸拉链样基序的1或8位点以外)的至少一个额外的亮氨酸；或(b)具有多于2个亮氨酸拉 链样基序；并且其中该HIV融合抑制肽在一种或多种生物学性质方面显示出改善。在一个 实施方案中，该HIV融合抑制肽长度为14到60个氨基酸残基。在一个实施方案中，该HIV 融合抑制肽包含衍生自HIV gp41的HR2区域的氨基酸序列，其中该氨基酸序列包含HR2亮 氨酸拉链样基序，例如图1或图2显示的HR2亮氨酸拉链样基序。可用于本发明提供的组合物和方法的其它抗病毒肽包括例如SEQ IDN0:9、10、14、 和15所示的肽，或者与SEQ ID NO :9、10、14、和15中任一序列相比包含1到3个氨基酸差 异的HIV融合抑制肽。可用于本发明提供的组合物和方法的其它抗病毒肽包括氨基酸序列与SEQ ID NO 5基本氨基酸序列相似的HIV融合抑制肽，但是与所述基本氨基酸序列相比，该HIV融 合抑制肽氨基酸序列在其氨基酸序列中具有多于2个亮氨酸拉链样基序；其中该HIV融合 抑制肽在一种或多种生物学性质方面显示出意想不到的改善。可用于本发明提供的组合物 和方法的其它抗病毒肽包括例如SEQ ID NO 11-13所示的肽，或者与SEQ ID NO 11-13中 任一序列相比包含1到3个氨基酸差异的HIV融合抑制肽。本发明所述的HIV融合抑制肽可通过公知的方法常规制备，所述方法包括重组表 达编码所述肽的核酸。例如，可在适当的条件下培养重组表达HIV融合抑制肽的工程细胞 适当的时间来表达并从中获得该肽。本发明所述的HIV融合抑制肽也可通过合成方法制 备。在一个实施方案中，该肽通过线性合成方法装配。在其它实施方案中，该肽采用片段 缩合法用2个或多个肽片段装配得到。在一个实施方案中，采用2片段缩合法，其中片段 AA(1-26)和AA(27-37)被共价偶联并与AA(38)装配得到具有SEQ ID NO :9氨基酸序列的 HIV融合抑制剂肽。在其它实施方案中，采用3片段方法，其中片段AA(1-12)、AA(13-26) 和AA (27-37)被共价偶联并与AA (38)装配得到具有SEQ ID NO :9氨基酸序列的HIV融合 抑制剂肽。以下是可用于本发明所述组合物的具体肽片段。每个肽片段都可以作为中间体， 该中间体可与一组肽片段中的一个或多个其它肽片段共价结合从而产生具有SEQ ID NO 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14 或 SEQ ID NO 15氨基酸序列的HIV融合抑制肽。在一个实施方案中，在一组肽片段中，肽片段在溶液 相过程中以一定方式结合从而产生所需的具有SEQ ID N0:9、SEQ ID NO 10、SEQID N0:11、 SEQ ID NO 12,SEQ ID NO :13、SEQ ID NO 14或SEQ ID NO 15氨基酸序列的HIV融合抑制 肽。通过如下方式制备的HIV融合抑制肽也可用于本发明提供的组合物合成所述HIV融 合抑制肽的组成肽片段，然后将所述肽片段装配成HIV融合抑制肽，其中该HIV融合抑制肽具有 SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、SEQ ID NO : 14或SEQ ID NO 15的氨基酸序列。在一个实施方案中，本发明提供了制备肽的方法，包含将所述肽喷雾干燥。例如， 肽可在PH小于4或大于6时溶解(例如在水中)，其中使用合适的酸或碱例如INNaOH或 IN HCl调节pH，然后将所述肽溶液通过喷雾嘴喷到加热的箱体中。可人工收集干燥的肽颗 粒。
在另一个实施方案中，上述喷雾干燥方法进一步包括向所述喷雾干燥溶液加入赋 形剂，由此掺入赋形剂与肽。示例性赋形剂的实例包括但不限于填充剂、膨胀剂、稀释剂、湿 润剂、溶剂、乳化剂、防腐剂、风味剂、吸收促进剂、持续释放基质、着色剂、和大分子物质例 如白蛋白、或例如氨基酸和糖的物质。在另一个实施方案中，本发明提供了制备肽的方法，包括将肽溶液通过喷雾嘴喷 到(与喷雾干燥方式相似)另一溶液(例如金属盐溶液，例如锌盐、铁盐或钙盐溶液)中。 然后将所得悬浮液离心，弃去上清液，并冷冻沉淀。将该沉淀冻干并过200 μ m筛。在另一个实施方案中，本发明提供了制备肽的方法，包括盐沉淀或pH沉淀，其中 肽可在PH小于4或大于6时溶解(例如在水中)，其中使用合适的酸或碱例如IN NaOH或 IN HCl调节pH至约4到6之间或约4. 8到5. 2之间。在具体实施方案中，该方法包含向肽 溶液中加入盐溶液或强酸/碱溶液以导致沉淀。在另一个实施方案中，该方法进一步包含 通过离心收集沉淀、通过冻干干燥沉淀、以及任选地将沉淀过200 μ m筛以控制颗粒大小。不受理论限制，认为用于制备本发明提供的组合物的肽的方法和试剂可产生有益 于某些患者或疾病的理想的或改善的药代动力学参数(例如释放生物活性分子的量或持 续时间)。尤其是，金属(例如锌、铁或钙)掺入到肽沉淀中的方式(例如喷雾和/或沉淀) 可影响所得组合物的药代动力学参数。在一个实施方案中，在所述肽沉淀过程中增加所述金属含量(例如锌含量)可降 低Cmax、增加tmax并增加ta(ll。在另一实施方案中，向低金属(例如低锌)沉淀加入作为冻 干盐的金属盐(例如硫酸锌)可降低Cmax、增加tmax并增加taQ1。在另一实施方案中，沉淀出肽的溶液可影响Cmax和乜 。例如，从50 50甲醇 水中沉淀出肽相对于从纯水中沉淀出肽可降低Cmax并增加tmax。在另一实施方案中，制备肽的方式可影响Cmax和tmax。例如，喷雾沉淀相对于非喷 雾沉淀可升高Cmax并增加tmax。使用方法本发明进一步提供了使用本发明提供的组合物的方法。在一个实施方案中，所述 组合物用作治疗方案例如抗病毒治疗方案的一部分。在某些实施方案中，这样的治疗方案 可以，例如，被用于治疗HIV感染。在一个实施方案中，本发明提供了使用本发明提供的组合物抑制HIV向靶细胞传 递的方法，包括给予患者一定量本发明提供的组合物，以使所述靶细胞与抑制细胞被病毒 感染有效量的活性试剂(例如抗病毒肽)接触。该方法可以，例如用于治疗HIV感染患者。 在一个实施方案中，抑制HIV向靶细胞传递包括抑制gp41介导的HIV-I与靶细胞的融合和 /或抑制HIV感染细胞与靶细胞间的合胞体形成。本发明还提供了治疗HIV感染(在一个实施方案中，HIV-I感染)的方法，包括给予HIV感染患者治疗HIV感染有效量的本发明提供的组合物。在一个实施方案中，该组合 物包含抑制HIV向靶细胞传递有效量的HIV融合抑制肽，和/或抑制gp41介导的HIV与靶 细胞融合有效量的HIV融合抑制肽。所述方法可以，例如，用于治疗HIV感染患者。在具体实施方案中，本发明提供了改善HIV感染相关症状的方法，包括给予HIV感 染患者包含溶剂、胶凝材料和肽的组合物，其中该肽选自T20、T1249、T897、T2635、T999和 T1144，或其组合。本发明进一步提供了将包含HIV融合抑制肽的组合物用于制备用于治疗HIV感染 的药物的方法(例如用于抑制HIV传递的方法、抑制HIV融合的方法、和/或治疗HIV感染 的方法)。所述药物可为药物组合物形式，该药物组合物包含生物活性分子例如HIV融合抑 制肽、溶剂、胶凝材料，并任选地包含一种或多种药学可接受载体。在一个实施方案中，本发明提供的组合物可通过注射给予，例如皮下注射。
在另一个实施方案中，本发明提供的组合物可每3、5、7、10、14、17、21、28或60天 给予(例如通过皮下注射)一次。在另一个实施方案中，本发明提供的组合物可持续一天或多天、一周或多周、一月 或多月、或一年或多年每天给予(例如通过皮下注射)1次、2次、3次或更多次。在另一个实施方案中，本发明提供的组合物可每周给予(例如通过皮下注射)1 次、2次、3次、4次、5次、6次、7次或更多次。在特定实施方案中，本发明提供的组合物可每 周给予(例如通过皮下注射)1次或2次。在另一特定实施方案中，本发明提供的组合物每 2周给予(例如通过皮下注射)2次。每次给予可包含1次、2次、3次或更多次注射。在一个实施方案中，本发明提供的组合物以100μ 1、200μ 1、300μ 1、400μ 1、 500 μ 1,600 μ 1,700 μ 1,800 μ 1,900 μ 1、1000 μ 1 或更多体积给予。在一个实施方案中，本发明提供的组合物通过注射器注射递送，例如，通过 100 μ 1,200 μ 1,300 μ 1,400 μ 1,500 μ 1,600 μ 1,700 μ 1,800 μ 1,900 μ 1、1000 μ 1 或更大 的体积的注射器注射递送。在一个实施方案中，可使用自动注射器或笔式装置进行递送。在 另一实施方案中，该传递装置可被预填充。在一个具体实施方案中，可使用Owen Mumford 的AutoJect作为具有300μ 1、500μ 1或ΙΟΟΟμ 1体积的递送注射器，并可采用规格30、0. 5 英寸的固定针头。在另一具体实施方案中，可使用具有300μ 1、500μ 1或1000 μ 1体积和 规格30、0. 5英寸固定针头的Becton Dickinson UltraFine注射器。在一个实施方案中， 可以控制药物递送的注射深度。在一个具体实施方案中，本发明提供的组合物以50mg/ml活性药物成分(例如SEQ ID NO 9)的剂量与的药学可接受的载体，例如甘露糖醇一起在注射用水(pH 7.4)中每天 施用一次。在另一具体实施方案中，本发明提供的组合物以125mg/ml活性药物成分(例如 SEQ ID NO 9)的剂量在pH 7. 4的水中每天施用一次。
实施例实施例1在以下实施例中，评估了多种生物物理学参数和生物学参数。确定所述参数的方 法如下所述。使用标准固相合成技术并使用标准FMOC肽化学法，或如本发明实施例3详述的固相合成与液相合成的组合在肽合成仪上合成肽，包括HIV融合抑制肽和基本序列。在本实 施例中，所述HIV融合抑制肽可进一步包含反应性官能团，即大部分所述反应性官能团在N 末端被乙酰基保护和/或在C末端被酰胺基保护。从树脂上脱离后，沉淀所述肽，并将该沉 淀冻干。然后使用反相高效液相色谱纯化该肽；用电喷雾质谱法确认肽的身份。生物物理参数的评估包括测定螺旋度和热稳定性。使用圆二色谱(“⑶”)如下 测定螺旋度。简单地说，使用配有热电温控器的分光计获得CD光谱。光谱获得条件为 25V，从200到260nm步进0. 5纳米(nm)，带宽1. 5nm,典型平均时间4秒/步。扣除细 胞/缓冲液空白后，使用保守窗口大小通过三阶最小二乘多项式拟合平滑光谱以给出随 机残差。原始椭圆率数值使用标准方法转换为平均残基椭圆率，并用波长(200到260nm) 对[θ ] X 10_3(度cm7dmol)作图。然后使用标准方法计算百分比螺旋度值(通常表示为 10μΜ、25 的百分比螺旋度)。热稳定性评估如下进行当以2°C步进升高温度时监测⑶ 信号在222nm处的变化，平衡时间为1分钟。每个样品(例如HIV融合抑制肽)的热稳定 性(以Tm值表示)是对应于热转变一阶导数最大值的温度。生物学性质的评估包括测定对HIV-I毒株的抗病毒活性。在确定HIV融合抑制肽 抗病毒活性(例如，一种测量是抑制HIV向靶细胞传递的能力)时，通过源于HIV gp41的 HR区域的肽产生的数据使用体外分析，该体外分析已经显示对体内观察到的抗病 毒活性具 有预测性。更具体地，对于相同的HIVgp41衍生肽，使用体外感染性分析(“Magi-CCR5感 染性分析”，参见例如美国专利号6，258，782)观察到的抗病毒活性已显示出与体内抗病毒 活性合理相关(参见，例如Kilby等人，1998，Nature Med. 4 :1302_1307)。这些分析使用 指示细胞系MAGI或表达衍生cMAGI的CCR5对感染性病毒滴度降低进行记分。上述两种细 胞系都利用HIV-Itat的能力以反式激活HIV-LTR驱动的β -半乳糖苷酶(β-gal)报告基 因的表达。该β-gal报告基因已被修饰以定位在细胞核内，并可在感染后几天内用X-gal 底物强烈核染色检测。如果染色前只有一轮感染，被染色的核数量就可解释为等于激发接 种物(challenge inoculum)中的感染性病毒粒子数量。感染的细胞用CXD-成像器计数， 原代细胞和实验室改变的分离株都显示出病毒输入和成像器显示的感染细胞数量之间的 线性关系。在MAGI和cMAGI分析中，感染性滴度降低50% (Vn/Vo = 0. 5)是显著的，并提 供了评估抗病毒活性的主要截断值(“IC50定义为导致感染性病毒滴度降低50%的活性成 分浓度)。用于测试抗病毒活性的肽被稀释成多种浓度，并针对HIV接种进行2次或3次 重复测试，所述HIV接种物经调整在48孔微量滴定板中产生约1500到2000个感染细胞/ 孔。将所述肽(在相应稀释中)加入到cMAGI或MAGI细胞中，然后加入病毒接种物；24小 时后，加入感染和细胞-细胞融合抑制剂(例如SEQ ID N0:2(恩夫韦地))以防止第二轮 HIV感染和细胞-细胞病毒传播。将细胞再培养2天，然后固定并用X-gal底物染色以检测 HIV感染细胞。每个对照和肽稀释物的感染细胞数量用CCD成像器确定，然后计算IC50(以 μ g/ml 表示)ο对由基本序列组成的肽的抗病毒活性具有抗性的病毒可使用标准的实验室方法 制备。基本而言，在计算IC50和IC90后，将细胞与病毒和肽(例如浓度接近IC90)在培养 物中混合(包括当所述细胞此后分瓶时)。维持并监测所述培养物直至合胞体出现。从第 一轮培养收获的病毒用于在第二轮培养中感染细胞，肽的浓度高于(2到4倍)第一轮培养 使用的浓度。维持并监测第二轮培养物中对所述肽的抗病毒活性具有抗性的病毒的存在。可能需要随后几轮培养以最终产生对所述肽的抗病毒活性具有抗性的病毒分离株(在抗 此类分离株的肽的IC50预定水平)。为确定药代动力学性质，将HIV融合抑制肽或衍生出HIV融合抑制肽的基本序列 静脉内给予猕猴(Macaca fasicularis)(如本领域已知，其它动物模型也可用于确定药代 动力学性质)。在给药后多个时间点抽取血样并离心分离血浆。冷冻保存血浆样品直至在 电喷雾阳离子模式下进行LC-MS (液相色谱/质谱)分析。使用pH 6. 8的IOmM乙酸铵缓 冲液中的乙腈梯度将HIV融合抑制剂或基本序列从C18或C8HPLC柱上洗脱。分析时，使 用2倍或3倍体积的包含0.5%甲酸的乙腈将血浆样品去蛋白。猕猴血浆样品的双份校准 标准与所述样品同时制备，并在所述包含HIV融合抑制肽或基本序列的样品之前或之后分 析。使用单指数或双指数数学模型从血浆浓度_时间数据计算出药代动力学性质。通过非 线性最小二乘优化获得模型。使用了浓度1/C2权重。使用以下方程计算血浆浓度-时间 曲线下面积(AUC)、全身清除率(Cl)、和终末半衰期(t72)。
AUC = A/-a+B/-b其中A和B为截距，a和b为指数方程的速率常数，分别描述分布期和消除期。当 使用单指数模型时，消除参数“A”和“a”。Cl =剂量 /AUC (以 L/K/hr 表示)tV2 = -0. 6903/b (以小时(hr)表示)实施例2为说明本发明提供的实施方案，基本序列具有如下氨基酸序列(SEQ IDNO 5)。TTffEAffDRAIAEYAARIEALIRAAQEQQEKNEAALREL在一个实施方案中，HIV融合抑制肽与其来源的基本序列相比，包含多于2个亮氨 酸拉链样基序。这些HIV融合抑制肽的例子包括但不限于SEQ IDNO =IUSEQ ID N0:12、和 SEQ ID NO 13 ；或与 SEQ ID NO :11、SEQID NO :12、或 SEQ ID NO 13 中任一序列相比具有 1到3个氨基酸差异(例如，至少92%—致性)的氨基酸序列；每个HIV融合抑制肽具有3 到5个亮氨酸拉链样基序的氨基酸序列。以下图示(I)显示了 HIV融合抑制肽的氨基酸序 列，在所述基本序列的氨基酸位点下方(用“I”对齐)用单字母氨基酸代码(“L”表示亮 氨酸，“I”表示异亮氨酸)表示氨基酸差异(与基本序列相比)，且参与亮氨酸拉链样基序 的异亮氨酸和亮氨酸(在同一亮氨酸拉链样基序的位点1或8，或一个亮氨酸拉链样基序的 位点8和相邻亮氨酸拉链样基序的位点1)用下划线标示。一个亮氨酸拉链的位点1或8 也可作为序列中另一亮氨酸拉链样基序的相对末端位点，即作为一个基序的位点8和另一 相邻基序的位点1。(I)TTffEAffDRAIAEYAARIEALIRAAQEQQEKNEAALREL SEQ ID NO 5IL LSEQIDN0:11ILSEQ ID NO: 12LISEQ ID NO: 13在另一个实施方案中，HIV融合抑制肽与其来源的基本序列相比，包含多于1个亮 氨酸拉链样基序，以及不参与形成亮氨酸拉链样基序的额外的亮氨酸。这种HIV融合抑制肽的例子包括但不限于 SEQ ID N0:9、SEQ ID NO 10, SEQ ID NO :14 JPSEQ ID N0:15;或 与 SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :14、或 SEQ ID NO 15 中任一序列相比具有 1
到3个氨基酸差异(例如，至少92%—致性)的氨基酸序列；并且每种HIV融合抑制肽氨 基酸序列与SEQ ID NO :5基本序列的不同在于包含多于1个亮氨酸拉链样基序，和不参与 形成亮氨酸拉链样基序的额外的亮氨酸(即，除亮氨酸拉链样基序位点1或8以外的亮氨 酸)。在一个实施方案中，非亮氨酸拉链样基序亮氨酸替换在SEQ ID NO :5基本序列的氨 基酸位点21替换了异亮氨酸，该替换提供了促进这些肽的有利生物学性质的因素。以下图 示(II)显示了 HIV融合抑制肽的氨基酸序列，在所述基本序列的氨基酸位点下方(用“ I，， 对齐)用单字母氨基酸编码(“L”表示亮氨酸，“I”表示异亮氨酸)表示氨基酸差异(与 基本序列相比)，且参与亮氨酸拉链样基序的异亮氨酸和亮氨酸(在同一亮氨酸拉链样基 序的位点1或8，或一个亮氨酸拉链样基序的位点8和相邻亮氨酸拉链样基序的位点1)用 下划线标示。不参与形成亮氨酸拉链样基序的亮氨酸为斜体。(II)TTffEAffDRAIAEYAARIEALIRAAQEQQEKNEAALREL SEQ ID NO 5I IL LSEQ ID NO 9L LSEQIDN0:10L ISEQ ID NO 14LISEQ ID NO: 15以下图示(III)显示了“基本序列”SEQ ID NO 5与本发明公开的SEQ IDNO :9_15肽的比较总结，SEQ ID NO :9-15肽相对于SEQ ID NO :5显示出改善的生物学性质。SEQ ID NO 9-15中各序列相对于SEQ ID NO 5基本序列的氨基酸替换用下划线和粗体标示。(III)SEQ ID NO 5TTffEAffDRAIAEYAARIEALIRAAQEQQEKNEAAL RELSEQ ID NO 9TTffEAffDRAIAEYAARIEALLRALQEQQEKNEAAL RELSEQ ID NO: 10TTffEAffDRAIAEYAARIEALLRAAQEQQEKLEAAL RELSEQ ID NO: 11TTffEAffDRAIAEYAARIEALIRALQEQQEKLEAAL RELSEQ ID NO: 12TTffEAffDRAIAEYAARIEALIRAIQEQQEKLEAAL RELSEQ ID NO: 13
TTffEAffDRAIAEYAARIEALIRALQEQQEKIEAAL RELSEQ ID NO: 14TTffEAffDRAIAEYAARIEALLRAIQEQQEKNEAAL RELSEQ ID NO: 15
TTffEAffDRAIAEYAARIEALLRAAQEQQEKIEAAL REL 参考表1，将根据本发明的HIV融合抑制肽与合成肽比较该合成肽具有相同的基 本序列，但氨基酸序列有所不同(与SEQ ID N0:9-15比较)，并具有抗HIV活性。所述比 较包括用本发明实施例1所述的方法确定的生物物理参数和生物活性参数。在确定生物 活性时，由于通过抗病毒活性进行评估，因而使用了病毒分离株，该病毒分离株对已知抑制 HIV介导的融合的某些肽的抗病毒活性具有抗性(所述抗性病毒分离株在表1中命名为 “Res”)。表1 生物物理学和生物学(抗病毒活性)参数 SEQ ID NO :6和SEQ ID NO :7与基本序列SEQ ID NO :5的不同在于单个亮氨酸替 换(分别位于位点24和位点31)；如以上表1所示，该替换没有显著地影响抗病毒活性，但 导致了半衰期的改善(参见以下表2)。SEQ ID NO :6与根据本发明具有SEQ ID NO :9的 HIV融合抑制肽相似，但是SEQ ID NO :9的氨基酸序列具有另一个氨基酸差异，即氨基酸位 点21的亮氨酸(而SEQ IDNO 6在氨基酸位点21是异亮氨酸)。参考表1，与SEQ ID NO 6的肽比较，SEQ ID NO 9中亮氨酸替换异亮氨酸导致螺旋度降低(从97%到61 % )，同时 保持良好的抗性性质(对抗性病毒分离株“Res”的活性)。类似地，SEQ ID NO 7的氨基酸 序列与根据本发明具有SEQ ID NO 10的HIV融合抑制肽相似，但是SEQ ID NO 10的氨基酸序列具有一个氨基酸差异，即氨基酸位点21的亮氨酸(而SEQ ID NO :7在氨基酸位点21 是异亮氨酸)。参考表1，与SEQID NO 7的肽比较，SEQ ID NO 10中亮氨酸替换异亮氨酸 导致螺旋度降低(从84%到77%)，同时保持良好的抗性性质(对抗性病毒分离株“Res” 的活性)。因此，表1显示了 SEQ ID NO 9和10相对于SEQ ID NO 6~7的改善性质。本实施方案说明了根据本发明的HIV融合抑制肽与基本氨基酸序列相比的药代 动力学性质。使用实施例1此前详述的评估药代动力学性质的方法，表2说明了与基本序列SEQ ID NO :5的药代动力学性质相比，根据本发明的HIV 融合抑制肽的药代动力学性质。表2 如表2所示，SEQ ID NO :6、7、9和10都显示出延长的生物半衰期(“t1//，)。SEQ ID NO 8在氨基酸位点21为亮氨酸，而在氨基酸位点24或31不是，其没有显示出SEQ ID NO :6、7、9和10肽所显示的显著延长的半衰期。为了在生产药物制剂时将HIV融合抑制肽配制到药学可接受载体中，在水溶液中 的稳定性可能是重要的参数，尤其是当药物制剂被肠胃外给予时。应注意到，根据本发明的 HIV融合抑制肽在生理pH下显示出在水溶液中改善的稳定性。例如，如下分别测试具有SEQ ID N0:2、SEQ ID NO :5氨基酸序列的合成肽，和具有SEQ ID NO :9氨基酸序列的HIV融合 抑制肽的溶解度向磷酸缓冲液(PBS)中加入浓度为10mg/ml的所述肽，在1周(168小时) 时间中的不同时间点，测定(例如用HPLC)在37°C下约pH 7. 3到约pH 7. 5范围内的溶液 中残留的肽的量。包含SEQ ID NO :2的溶液在仅仅数小时后变得不稳定(溶液中检测到最 少量的肽)。相反，在1周的时间点仍可在溶液中检测到90%或更多具有SEQ ID NO 9氨 基酸序列的HIV融合抑制肽，但是在1周的时间点只可在溶液中检测到少于80%具有SEQ ID NO 5氨基酸序列的肽。实施例3将本发明提供的HIV融合抑制肽的生物学性质与其它公认的有效抗病毒剂(包 括SEQ ID N0:2(恩夫韦地))进行了比较。尤其是，将感兴趣的新化合物SEQ ID NO :9与公认的抗病毒剂SEQ ID NO :2进行了体外抗性比较研究，详述如下MT2细胞用病毒分离株 (IIIB、030、060和098)感染，并在浓度逐渐升高的SEQ ID NO :2 (恩夫韦地)或SEQ ID NO: 9中培养以选择抗性。初始肽浓度约为各个肽对相应野生型分离株的IC5tl的2倍。通过每 1-3天添加新鲜肽保持肽浓度。使用标准技术监测培养物的细胞病理效应(CPE)，当达到最 大CPE时，将一小等份病毒用于随后轮次的感染。与野生型病毒生长速率比较，根据培养时 间，肽浓度升高2 到4倍。在选择期间，也收集不含肽的病毒储液。不含肽的病毒储液用双 脱氧测序化学法鉴定gp41的基因型改变，并使用cMAGI感染性分析确定表型易感性。使用SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 9进行体外选择的比较结果如表3所示。这些数 据显示SEQ ID NO :9选择的培养时间比SEQ ID NO :2选择平均长3倍，导致IC5tl更低的倍 数改变(SEQ ID NO 2的42倍与SEQ ID NO 9的24倍相比)。SEQ ID NO 9选择需要的 突变(几何平均数3. 6)比SEQ ID NO :2(几何平均数1.7)更多以达到所述更低的倍数改 变。更长的培养时间、更低的倍数改变、以及实现所述更低的倍数改变所需的更高的突变数 量，都表明与SEQ ID N0:2相比，SEQ ID NO :9显示出更不易发展体外抗性。也就是说，所 述结果说明HIV出现对SEQ ID NO 9的抗性比出现对SEQ ID NO 2的抗性需要更长的时 间。基于以前对其它肽例如SEQ ID NO :2和T1249的HIV抗性发展研究，人们可预期本发 明提供的体外结果可与体内结果合理地关联。表3 =SEQ ID NO 2 (恩夫韦肽)和SEQ ID NO 9体外选择的比较 基于以前对其它肽例如SEQ ID NO :2和T1249的HIV抗性发展研究，人们可 预期本发明提供的体外结果应与体内结果合理相关联(参见，例如Melby等人，2006， AIDS Research and Human Retroviruses 22(5) 375-385 ；Greenberg & Cammack,2004, J. Antimicrobial Chemotherapy 54 :333_340 ;Sista 等人，2004，AIDS 18:1787-1794)。实施例4一般而言，本发明提供的HIV融合抑制肽可通过两种方法中的一种合成。第一种 方法为使用标准固相合成技术和使用标准Fmoc肽化学法或其它标准肽化学法(使用化学 保护基团或CPG)的线性合成。合成本发明提供的HIV融合抑制肽的第二种方法为通过片 段缩合法。简单地说，合成2个或多个片段，每个片段包含所要制备的HIV融合抑制肽完整 氨基酸序列的相应部分。在片段合成中，如果需要，加入的氨基酸可具有被化学保护剂化学 保护的游离胺(例如侧链胺)。然后组装(以一定方式和顺序共价结合)所述片段，由此制 备(以正确的氨基酸序列)所述HIV融合抑制肽。关于肽合成，可使用肽序列合成领域技术人员熟知的技术制备各个肽片段自身， 以及由一组肽片段组合生产的本发明提供的HIV融合抑制肽。例如，在一种方法中，肽片段 可在固相中合成，然后在装配过程中在液相中组合以制备产物HIV融合抑制肽。在另一种 方法中，可使用液相合成制备肽片段，然后所述肽片段在装配过程中在固相中组合以制备 HIV融合抑制肽。在另一种方法中，各种肽片段可使用固相合成，然后在装配过程中在固相 中组合以制备HIV融合抑制肽的完整氨基酸序列。在一个实施方案中，使用本领域技术人 员熟知的固相合成法制备各个肽片段。在另一个实施方案中，使用一组肽片段并使用固相 和液相技术组合的装配过程制备具有SEQ ID NO :9氨基酸序列的HIV融合抑制肽。例如， 一组肽片段包含2到4个肽片段，合成该片段，然后装配，以完成本发明提供的HIV融合抑 制肽的合成。基于本发明的教导，对本领域技术人员显而易见的是，所述的片段装配方法可 用于、且已经被用于具有SEQ ID NO :9-16中任一序列的氨基酸序列的一些HIV融合抑制 肽。为说明通过片段缩合法制备本发明提供的HIV融合抑制肽，在合成具有SEQ ID NO 9氨基酸序列的HIV融合抑制肽的方法中，一组肽片段中的肽片段在肽片段装配过程中 共价结合。本发明提供的肽片段可包括但不限于具有如下表4所示氨基酸序列的肽片段。 本发明提供的某些肽片段可用于排除其它肽片段。还标示了各种肽片段在SEQ ID N0:9中 的对应氨基酸；因此，显示出各种肽片段由SEQ ID NO :9氨基酸序列中的多个相邻氨基酸 组成。
表 4 本发明还提供了特定的肽片段组，所述肽片段组在合成具有SEQ ID NO 9氨基酸
序列的HIV融合抑制肽的方法中作为中间体。本发明提供的肽片段组包括1-16组，如表5
所示(组的编号仅为描述方便)。某些肽片段组可用于排除其它肽片段组。表5 因此，在一个实施方案中，本发明提供了可用于合成具有SEQ ID NO :9氨基酸序列 的HIV融合抑制肽的方法、肽片段、和肽片段组。从本发明描述中还显而易见的是，所述方 法、肽片段、和肽片段组可用于合成具有SEQ IDNO :9氨基酸序列的HIV融合抑制肽，其中所 述HIV融合抑制肽包含一个或多个化学基团B-TTffEAffDRAIAEYAARIEALLRALQEQQEKNEAALREL-ZU其中一个或多个氨基末端、羧基末端、或侧链游离反应性官能团(例如内部赖氨 酸的ε胺)用化学基团(B、U、Z ；其中B、U、Z可为相同的化学基团或不同的化学基团) 修饰，所述化学基团可包括但不限于一种或多种以下基团反应性官能团、化学保护基团 (CPG)、和接头。本领域还已知可用于在肽片段N末端、或肽片段C末端、在内部氨基酸的游 离胺、或其组合处引入化学基团的技术。与制备具有SEQ ID NO :9氨基酸序列的HIV融合 抑制肽有关，被保护的肽片段(具有一个或多个化学基团的肽片段)的示例性实例包括但 不限于，表6中所列的肽片段。表6 Ac-乙酰基，NH2-氨基(但可为其它化学基团，如本发明“定义”部分详述)；CPG 为化学保护基团(例如，Fmoc或其它N末端化学保护基团，如本文“定义”部分详述)；U如 上定义。SEQ ID NO :9首先被线性合成以得到初始研究量。首先用两片段合成以生成大量 SEQ ID NO :9，基于在该过程中通过两片段方法导入的效率，该途径(图3)被用于毒理学 物质和临床物质的第一 GMP合成。也可采用三片段方法(参见，例如图7)。合成的主要途 径包括例如采用氨基酸位点1-26片段和氨基酸位点27-37片段的2片段方法，和采用氨基 酸位点1-12片段、氨基酸位点13-26片段以及氨基酸位点27-37片段的3片段方法。已经 检查了 SEQ IDNO 9初始线性合成的各种改进(实施例12)。SEQ ID NO 9在例如Sieber 酰胺树脂、rink-负载CTC树脂和Glu37侧链负载树脂上线性装配。用于装配SEQ ID NO 9的线性合成方法的其它范例包括例如采用rink-负载CTC (图4)、Sieber树脂(图5)和 Glu-负载的CTC(图6)的合成。实施例5参考表5(组1和组2)和图7，示出了使用3个特定肽片段(例如SEQ ID NO 17-19+Leu ；或SEQ ID N0:17、18和20)并使用片段缩合法合成具有SEQID NO :9氨基酸 序列的HIV融合抑制肽的方法，该片段缩合法包括将3个肽片段组合以制备HIV融合抑制 肽。每个所述肽片段显示出的物理性质和溶解度特性使该肽片段成为优选肽片段(相对 于二片段法)，以用于以高产量和高纯度合成具有SEQ ID NO :9氨基酸序列的HIV融合抑 制肽的方法，且进一步只需一种加样树脂作为起始材料(简化合成方法)。通过标准固相 合成法(使用超酸敏感树脂，例如4-羟甲基-3-甲氧苯氧基丁酸树脂、或2-氯三苯甲基氯树脂-“CTC”，图7)合成具有SEQ ID NO 17氨基酸序列且包含SEQ ID NO 9前12位氨 基酸(参见图3，“AA(1-12)”)的肽片段，该肽片段的N末端被乙酰化(“Ac”，作为化学基 团)并具有C末端羧基(-C00H)(参见图7，“Ac-AA(l-12)-0H”)。通过标准固相合成法合 成具有SEQ ID NO: 18氨基酸序列并包含SEQ ID NO :9中第13-26位氨基酸(参见图3， "AA (13-26)")的肽片段，该肽片段的N末端具有Fmoc (作为化学保护基团)且在C末端 具有_0H(参见图7，“FmoC-AA(13-26)-0H”)。通过标准固相合成法合成具有SEQ ID NO 19氨基酸序列并包含SEQ ID NO 9中第27-37位氨基酸(参见图7, "AA (27-37) ”)的肽 片段，该肽片段的N末端具有Fmoc (作为化学保护基团)且在C末端具有_0H(参见图7， “Fmoc-AA(27-37)-0H”)。使用本领域技术人员熟知的裂解剂、溶剂和技术将各个肽片段从 所用的固相合成树脂上裂解。然后如下分离各个肽片段通过蒸馏去除大部分上述溶剂，并 通过加入水(含有或不含有含醇助溶剂)沉淀所述肽片段。所得固体通过过滤分离、洗涤、 在水或乙醇/水中重新制浆、再过滤、并在真空炉中干燥。 如图7所示，通过液相合成制备肽片段，其中将具有SEQ ID N0:19氨基酸序列的肽片段(参见图7，“FmocAA(27-37)-0H”)与SEQ ID NO 9第38位氨基酸亮氨酸(已 在液相中被酰胺化)化学结合，从而生成具有SEQ ID NO :20氨基酸序列的肽片段(包 含SEQ ID NO :9中第27-38位氨基酸)，该肽片段C末端被酰胺化(作为化学基团)(参 见图7，“Fmoc-AA(27-38)-NH2”)。在一种合成方法中，本发明提供的酰胺化肽片段(包 括但不限于肽片段H-AA(27-38)-NH2)可使用酰胺树脂直接合成。总结所述液相反应，在 DIEA(二异丙基乙胺)和亮氨酰胺(例如，偶联剂和消旋抑制剂的组合)的存在下分别使 用HBTU(0-苯并三氮唑1-基-N，N, N' , N'-四甲基脲六氟磷酸酯)或TBTU(0-苯并三 氮唑-1-基-N，N，N' , N'-四甲基脲四氟硼酸酯)、以及H0BT、6-C1 Η0ΒΤ、或Η0ΑΤ，分离 的肽片段Fmoc-AA (27-37)-OH的羧基末端被转换成HOBT (1-羟基苯并三唑水合物)、6_C1 Η0ΒΤ*Η20、或HOAT (1-羟基-7-偶氮苯并三唑)的活性酯。所述反应在O到30°C在极性非 质子溶剂例如DMF( 二甲基甲酰胺)、DMAc (二甲基乙酰胺)或NMP (N-甲基吡咯烷酮)中进 行。所述偶联反应完成时，将哌啶、碳酸钾、DBU或本领域技术人员熟知的其它碱加入到所述 反应中(加或不加另外的助溶剂)以有效去除末端Fmoc保护基团。所述反应完成时，加入 醇或可与水混溶的溶剂和/或水以沉淀肽片段，该肽片段具有SEQ ID N0:20氨基酸序列， 并在C末端被酰胺化(H-AA (27-38) -NH2)。 如图7示例所示，为在液相过程中使用肽片段Fmoc-AA (27-37) -OH与亮 氨酰胺(参见图3，“H-Leu-NH2”)组合制备肽片段H-AA (27-38)-NH2,将肽片段 Fmoc-AA (27-37)-OH (571g,205mmol, 1 当量)、H-Leu-NH2 (32. Og，246mmol，1. 2 当量)和 6-C1 H0BT(41. 7g，246mmol，1. 2 当量)加入到 DMF(4568ml，8 体积)中，用 DIEA(53. 6ml， 307. 5mmol, 1. 5当量)处理并在室温搅拌直至溶解(约20分钟)。将所述溶液冷却，并 加入181^(79.(^，246讓01，1.2当量)。将所述反应在0°C搅拌，然后在25 °C搅拌。当 HPLC分析显示所述反应完成时，加入哌啶(81ml，820mmol，4当量)以去除所述肽片段 Fmoc-AA (27-38) -NH2的Fmoc保护基团(也可使用其它碱，例如碳酸钾、DBU等)。将反应在 30°C搅拌，直至HPLC显示反应完成。然后将所述反应混合物冷却至5°C以下，并缓慢加入 预冷水(8体积，4568mL)保持所得浆体温度低于10°C。将悬浮液搅拌30分钟，然后过滤并 用25%乙醇/水洗涤2次(每次2284mL，4体积)。通过在乙醇/水(加或不加稀酸)和/或MTBE/庚烷或其它类似溶剂混合物中重新制浆以去除残留哌啶和哌啶二苄基富烯。如 图7所示，产物为分离的肽片段H-AA(27-38)-NH2的制备物。如图7所示，然后进行液相反应，其中肽片段H-AA (27-38) -NH2 (SEQ IDNO 20)与肽片段Fmoc-AA (13-26) -OH (SEQ ID NO 18)组合，并去保护从而产生肽片段 H-AA (13-38)-NH2 (SEQ ID NO :35，在N末端和C末端都具有化学基团)。将肽片段Fmoc-AA(13-26)-0H(460g，167mmol，l 当量)、肽片段 H-AA (27-3 8)-NH2 (460g, 172mmol, 1. 03 当量)和 6-C1 HOBT (34g, 200mmol, 1. 2 当量)加入到 DMF (6900ml，15体积)中，用DIEA (47ml，267mmol，.1.6当量)处理，并搅拌以溶解所有固 体。将所得溶液冷却至5°C以下。向反应中加入181^(648，200讓01，1.2当量)，并将反应在 0°C搅拌，然后在25°C搅拌。一旦HPLC分析显示所述反应完成，加入哌啶(58ml，668mmol，4 当量)以去除Fmoc，然后搅拌所述反应直至HPLC显示反应完成。将溶液冷却至5°C以下， 并以一定速率缓慢加入水(6900mL，15体积)使得温度不会升到10°C以上。将所得悬浮液 搅拌30分钟后，通过过滤收集固体并用水洗涤(2次，每次2300mL，5体积)并干燥。通过 在乙醇/水(加或不加稀酸)和/或MTBE/庚烷或其它类似溶剂混合物中重新制浆去除 残留哌啶和哌啶二苄基富烯。通过过滤收集固体、洗涤、并干燥以产生基本纯的白色固体 H-AA (13-38)-NH2 (SEQ IDNO :35)，纯度用高效液相色谱(HPLC)分析确定。如图7所示，肽片段H-AA(13-38)-NH2(SEQ ID NO :35)在液相反应中与肽片段 Ac-(1-12)-OH(SEQ ID NO 17)装配而产生具有SEQ ID NO :9氨基酸序列的HIV融合抑制肽 (参见，例如图 7，Ac-(1-38)-NH2)。将肽片段 Ac-AA (1-12)-0H(130g，58. 5mmol，1 当量)研 磨成细粉并与肽片段H-AA (13-38)-NH2 (303g，58. 5mmol，l当量)混合。将所述混合物缓慢 加入到 2 1 0011/1)1^(20体积，260011^)和0比4(25.511^，14611111101，2.5当量)温热溶液中。 加入H0AT(15. 9g，117mmol,2. O当量)且搅拌所述混合物以溶解所有固体。将所得溶液冷 却至5°C以下，并加入TBTU (28. 2g，87. 8mmol, 1· 5当量)。将溶液在0°C搅拌30分钟，然后 在25°C搅拌，直至HPLC显示反应完成。将所述溶液加热到30-35°C，并加入额外的DCM(13 体积，1740mL)，接着加入水(1820mL，14体积)。将所述混合物搅拌5分钟，然后允许分层。 去除水层并替换为新鲜水(1820ml，14体积)。分层重复总计5次。将有机层蒸馏至原体积 的1/3，并加入异丙醇(IPA;1820ml，14体积)。继续蒸馏以去除残留DCM。将所得浆体冷 却至5°C以下，并缓慢加入水(1820ml，14体积)。形成的固形通过过滤收集，用水洗涤2次 (每次520mL，4体积)，并干燥以产生分离的HIV融合抑制肽Ac-AA (1_38) -NH2 (SEQ ID NO 9)的制备物，纯度用HPLC分析确定。如图7所示，可通过酸解或本领域技术人员熟知的其它通过去除侧链化学保护基 团将肽去保护的方法去除HIV融合抑制肽Ac-AA(1-38)-NH2的侧链化学保护基团。在本实 施例中，HIV 融合抑制肽 Ac-AA (1-38)-NH2 (60g，8. Immol)用 TFA (三氟乙酸)DDT (二硫 苏糖醇)水(90 10 5 ;570ml)处理，并在室温搅拌6小时。将该溶液冷却至10°C以 下，并以一定速率缓慢加入预冷MTBE(25体积，1500ml)使得温度保持低于10°C。生成的固 体通过过滤收集，用MTBE洗涤，并干燥。然后将所得粉末在乙腈(ACN;10体积，600mL)中 制浆，用DIEA和乙酸调节pH至4到5之间，以使所述肽脱羧基。一旦HPLC显示所述反应 完成，通过过滤收集固体，用ACN洗涤，并干燥以产生去保护且脱羧基的肽制备物，然后所 述肽制备物通过HPLC或其它合适的色谱技术纯化，以产生具有SEQ ID NO :9氨基酸序列的分离的HIV融合抑制肽的制备物。实施例6参考表5 (组3和组4)和图8，显示了使用2个特定肽片段(例如SEQ ID NO 29 和30+Leu ；或SEQ ID NO 29和31)并使用片段装配法合成具有SEQ IDNO 9氨基酸序列的 HIV融合抑制肽的方法，该片段装配法包括将2个肽片段通过化学结合(“装配”)进行组 合以生成具有SEQ ID NO :9氨基酸序列的HIV融合抑制肽。每种所述肽片段显示出的物理 性质和溶解度特性使它们在使用2个肽片段以高产量和高纯度合成具有SEQ ID N0:9氨基 酸序列的HIV融合抑制肽的方法中是可用的或优选的。在选择用于二片段装配方法的肽片 段时，发现被装配在一起的2个片段之间的接合点(例如，具有SEQ ID N0:29氨基酸序列 的肽片段C末端，和具有SEQ ID NO :31氨基酸序列的肽片段末N端)处具有亮氨酸和/或 谷氨酸有利于以高产量装配和获得的纯度水平。通过标准固相合成法合成具有SEQ ID NO 29氨基酸序列并包含SEQ IDNO :9前 20位氨基酸(“ΑΑ(1-20)”)的肽片段，该肽片段N末端被乙酰化(“Ac”，作为化学基团) 且C末端 具有羟基(_0!1)(参见表6;本发明也被称为1(344(1-20)-0!1”)。通过标准固 相合成法合成具有SEQ ID NO :30氨基酸序列并包含SEQ ID NO :9中第21-37位氨基酸 (“AA (21-37)”)的肽片段，该肽片段的N末端具有Fmoc (作为化学保护基团)其C末端具 有-OH (参见表6 ；本发明也被称为“Fmoc-AA (21-37)-0H”)。如表5组3和组4以及图8所示，通过液相合成制备肽片段，其中肽片段 Fmoc-AA(21-37)-OH化学结合到已在液相中酰胺化的SEQ ID NO 9的第38位氨基酸亮氨 酸上以生成具有SEQ ID NO :31氨基酸序列的肽片段(包含SEQ ID NO :9中第21-38位 氨基酸)，该肽片段的C末端被酰胺化(作为化学基团)(“Fmoc-AA(21-38)-NH2”)。为 了在液相过程中使用肽片段Fmoc-AA(21-37)-0H与亮氨酸(“H-Leu-NH2”)组合制备 肽片段 Fmoc-AA (21-38)-NH2,将肽片段 Fmoc-AA (21-37)-OH (30g，7. 43mmol, 1· O 当量)、 H-Leu-NH2*HC1(1. 36g，8. 16mmol, 1. 2 当量)禾口 HOAT(1. 52g, 11. 2mmol, 1. 5 当量)溶解于 DMF(450ml，15体积)中，用DIEA(6. 5ml, 37. 3mmol，5当量)处理并在室温搅拌直至溶解(约 30分钟)。将该溶液冷却至O士5°C，并加入TBTU(2. 86g，8. 91mmol，1. 2当量)，在O士5°C搅 拌5分钟，然后在25 士 5°C反应2小时或直至HPLC显示反应完成。在分离片段H-AA (21-38) -NH2之前去除肽片段Fmoc-AA (21-38) -NH2的Fmoc化学 保护基团。加入哌啶(7. 3mL，73. Smmol, 10当量)，且将所述溶液在25士5°C搅拌1小时或直 至HPLC分析显示基本所有Fmoc已从所述肽片段去除。冷却反应器，加入水(1000ml，30体 积)，在10°C以下搅拌自由流动的浆体30分钟，然后通过过滤分离。用1 1乙醇/水洗涤 收集的固体，并在真空炉中在35士5°C干燥。然后将肽片段在1 1乙醇/水(450mL，15体 积)中重新制浆3小时。收集并干燥固体。然后所述肽片段在3 1正己烷MTBE(450mL， 15体积)中制浆过夜，然后通过过滤分离并重新干燥。如需要，所述MTBE重新制浆可重复 以去除多余的哌啶。所得产物是分离的肽片段H-AA(21-38)-NH2制备物(参见图8)。然后进行了液相反应，其中将肽片段H-AA(21-38)_NH2(SEQ ID NO :31)与肽片段 Ac-AA (1-20)-OH(SEQ ID NO 29)组合，以生成具有SEQ ID NO :9氨基酸序列的HIV融合抑 制肽(参见图 8，Ac-(1-38)-NH2)。将肽片段 H-AA (21-38)-NH2 (3. 40g，0. 86mmol，1 当量)、 肽片段 Ac-AA(l-20)-0H(3. 00g，0. 86mmol，1.0 当量)以及 HOAT(0. 177g, 1. 3mmol, 1. 5 当量)和DIEA(0. 599ml, 3. 44mmol，4当量)溶解于DMAc ( 二甲基乙酰胺；100ml，33体积)，冷 却至0士5°C。向反应中加入TBTU(0. 331g，1.03mmol，1.2当量)。将所述反应在0士5°C搅 拌5分钟，并在25 士 5 °C搅拌3小时或直至HPLC显示所述反应完成。冷却反应器，缓慢加入 水(200ml，66体积)。形成浆体并在10°C以下搅拌至少30分钟。固体通过过滤分离并用 另外的水洗涤。在真空炉中在35士5°C干燥收集的固体。所得产物是完全保护的、分离的 HIV融合抑制肽Ac-AA (1-38)-NH2 (SEQ ID NO 9)制备物，纯度用HPLC分析确定。然后使用 本发明实施例5所述的方法或本领域技术人员熟知的其它去保护和脱羧基方法对所述HIV 融合抑制肽去保护(通过去除侧链化学保护基团)并脱羧基(在色氨酸残基)，然后纯化 (例如通过HPLC)。所得产物是具有SEQ ID NO :9氨基酸序列的HIV融合抑制肽(在本说 明中，N末端被乙酰化，C末端被酰胺化)制备物(去保护且脱羟基的)。使用相似的技术和条件，使用其 它 涉及2片段装配或3片段装配的片段装配法制 备具有SEQ ID NO 9氨基酸序列的HIV融合抑制肽(参见，例如表4和5)。从本文描述应 理解，用于通过本发明的方法制备具有SEQ ID NO :9氨基酸序列的HIV融合抑制肽的优选 肽片段可用于排除优选肽片段以外的肽片段。同样地，用于通过本发明的方法制备具有SEQ ID NO :9氨基酸序列的HIV融合抑制肽的优选肽片段组可用于排除优选肽片段组以外的肽 片段组。实施例7本发明的另一实施方案涉及可用于合成具有SEQ ID NO 10氨基酸序列的HIV融 合抑制肽的方法、肽片段、和肽片段组。从本文描述中还显而易见的是，所述方法、肽片段、 和肽片段组可用于合成具有SEQ ID NO :10氨基酸序列的HIV融合抑制肽，其中所述HIV融 合抑制肽包含一个或多个化学基团B-TTffEAffDRAIAEYAARIEALLRAAQEQQEKLEAALREL-ZU其中氨基末端或羧基末端之一或两者用化学基团(B、U、Z ；其中B、U、Z可为相同的 化学基团或不同的化学基团)修饰，所述化学基团可包括但不限于一种或多种以下基团 反应性官能团、化学保护基团(CPG)、和接头。涉及到制备具有SEQ ID N0:10氨基酸序列 的HIV融合抑制肽时，肽片段、肽片段组、和被保护的肽片段(具有一个或多个化学基团的 肽片段)的示例性实例包括但不限于表7、8、和9中分别所列的肽片段。表 7 本发明进一步提供了特定的肽片段组，该肽片段组在合成具有SEQ IDNO 10氨基 酸序列的HIV融合抑制肽的方法中作为中间体。本发明提供的肽片段组包括表8所示的组 1-14 (组的编号只为描述方便)。某些肽片段组可用于排除其它肽片段组。表8 表9 参考表8(组3和组4)，显示了使用2个特定肽片段(例如SEQ ID NO :29和 48+Leu ；或SEQ ID NO 29和49)并使用片段装配法合成具有SEQ ID NO 10氨基酸序列的 HIV融合抑制肽的方法，该片段装配法包括通过化学结合(“装配”)组合2个肽片段以制 备具有SEQ ID NO :10氨基酸序列的HIV融合抑制肽。为了在液相过程中使用具有SEQ ID N0:48的肽片段("Fmoc-AA(21-37)-0H")与亮氨酸("H-Leu-NH2”)组合制备具有SEQ ID NO -49 的肽片段(“Fmoc-AA(21-38)-NH2”)，将肽片段 Fmoc-AA(21-37)-0H(30. Olg, 7. 98mmol, 1. O 当量)、H-Leu_NH2*HCl (1. 48g，8. 78mmol，1. 1 当量)禾口 HOAT (1. 63g, 11. 97mmol，1. 5 当量)溶于 DMF (450ml，15 体积)中，用 DIEA (7. 0ml，39. 91mmol，5 当量)处理并在室温搅拌直至溶解(约30分钟)。将所述溶液冷却至0士5°C，并加入TBTU(3.09g， 9. 58mmol, 1. 2当量)，在0士5°C搅拌5分钟，然后在25士5°C反应2小时或直至HPLC显示 所述反应完成。在分离片段H-AA (21-38) -NH2之前去除肽片段Fmoc_AA (21-38) -NH2的Fmoc化学 保护基团。加入哌啶(8. 0ml, 79. 8mmol, 10当量)，并将所述溶液在25士5°C搅拌1. 5小时或 直至HPLC分析显示基本所有Fmoc都被从所述肽片段去除。将反应器冷却，加入水(1000ml， 30体积)，在10°C以下搅拌自由流动的悬浮液30分钟，然后通过过滤分离。收集的固体 用1 3乙醇/水洗涤，并在真空炉中于35士5°C干燥。然后将肽片段在1 3乙醇/水 (400mL，13体积)中重新制浆3小时。收集并干燥固体，然后将所述肽片段在3 1正己 烷MTBE(400mL，13体积)中制浆过夜，通过过滤分离并重新干燥。如需要，所述MTBE重 新制浆可重复以去除多余的哌啶。所得产物是分离的肽片段H-AA(21-38)-NH2制备物(参 见表 9，SEQ ID NO 49)。然后进行液相反应，其中肽片段H-AA(21-38)_NH2(SEQ ID N0:49)与肽片段 Ac-AA(l-20)-0H(SEQ ID N0:29，表9)结合，以生成具有SEQ ID NO 10氨基酸序列的HIV融 合抑制肽(参见，例如 Ac-(1-38)-NH2)。将肽片段 H-AA(21-38)-NH2(3. 14g，0. 86mmol, 1 当 量)、肽片段 Ac-AA(l-20)-0H(3. 00g，0. 86mmol, 1. 0 当量)以及 H0AT(0. 18g, 1. 3mmol, 1. 5 当量)和 DIEA(0. 599ml, 3. 44mmol，4 当量)溶解于 DMAc (100ml，33 体积)，冷却至 0士5°C。 向反应中加入TBTU(0. 331g，1. 03mmol, 1. 2当量)。将所述反应在0士5°C搅拌5分钟，并 在25士5°C搅拌3小时或直至HPLC显示所述反应完成。冷却反应器，缓慢加入水(250ml， 83体积)。浆体形成并在10°C以下搅拌至少30分钟。固体通过过滤分离并用额外的水洗 涤。收集的固体在真空炉中于35士5°C干燥。所得产物是完全保护的、分离的HIV融合抑制 肽Ac-AA(1-38)-NH2(SEQ IDN0 10)制备物，纯度用HPLC分析确定。然后使用本发明实施 例4所述的方法或本领域技术人员熟知的其它去保护和脱羧基方法对所述HIV融合抑制肽 Ac-AA(1-38)-NH2去保护(通过去除侧链化学保护基团)并脱羧基(在色氨酸残基)。纯 化后，所得产物是分离的具有SEQ ID NO :10氨基酸序列的HIV融合抑制肽(N末端被乙酰 化，C末端被酰胺化)制备物(去保护且脱羟基的)，这通过HPLC确定。使用相似的技术和条件，使用其它涉及2片段装配或3片段装配的片段装配法制 备具有SEQ ID NO: 10氨基酸序列的HIV融合抑制肽(参见，例如表8和9)。从本文描述应 理解，用于通过本发明提供的方法制备具有SEQ IDN0 10氨基酸序列的HIV融合抑制肽的 肽片段可用于排除其它肽片段。同样地，用于通过本发明提供的方法制备具有SEQ ID NO 10氨基酸序列的HIV融合抑制肽的肽片段组可用于排除其它肽片段组。实施例8已开发了采用 Ac-AA (1-26)-0H 和 Fmoc-AA (27-38)-0H 合成 SEQ ID N0 :9 肽的两 片段方法。SEQ ID NO :9的片段Ac-AA (1-26)-0H和Fmoc-AA (27-37)-0H首先通过标准固 相合成技术合成。为了合成 Fmoc-AA (27-37)-0H，将树脂(2-CTC，2kg，3. lmol 活性 C1)在 DCM(10 体 积，20L)中25 士 5°C下溶胀15-30分钟，然后排干，同时制备Fmoc_Glu (Otbu) _0H*H20 (0. 45 当量，619g，1. 40mol)和 DIEA(相对于 Glu 为 3 当量，4. 19mmol, 729mL)的 DCM(5 体积， 10L)溶液。将树脂在DCM(5体积，10L)中重新浆化，向树脂中添加氨基酸溶液，并将浆液
45在25士5°C下搅拌2小时。排干容器，将树脂在NMP(4体积，8L)中浆化。添加封端溶液9 l(V/V)MeOH/DIEA(6体积，12L)，并将浆液在25士5°C下搅拌40-50分钟。排干容器，并 用DCM(2X6体积，各900mL)洗涤树脂。然后用NMP(4体积，600mL)洗涤树脂，并在10°C下贮存。将树脂在25 士 5°C下在NMP(10体积，20L)中溶胀30-60分钟，然后排干。在 30士5°C下用NMP中的2X20-40minX5体积10% PIP脱保护进行所述片段的装配。然后 用NMP洗涤树脂，直至得到阴性四氯苯醌测试。0-5°C下在DMF(6体积)中用1. 5当量受保 护的氨基酸、1. 5当量6-C1 HOBtU. 7当量DIEA和1. 5当量TBTU预活化15分钟后启动结 合。添加结合溶液后，进行DMF(2体积)洗涤，然后使反应在30士5°C下进行长达4小时，直 至用Kaiser测试显示反应完全。如果在3小时后未完全，则进行重结合。一旦结合完全， 在用NMP (3 X 6体积，12L)分别洗涤树脂5分钟。将所述完成树脂结合的片段用8体积NMP(16L)洗涤两次，并用8体积DCM(16L) 洗涤4次。将树脂在2体积(4L)DCM中浆化，并添加预冷至< 5°C的含于DCM(5体积，10L) 的TFA。将浆液搅拌5分钟，然后过滤至含吡啶的大玻璃瓶中(相对于TFA为1. 26体 积，126mL)。添加另一份预冷至< 5°C的含于DCM(5体积，10L)的1 % TFA,搅拌，如前排干 (不发生2体积预溶胀)。进行额外的3次TFA/DCM处理(总计5次)。将树脂在DCM(5体 积，10L)中浆化5分钟，排干，并通过HPLC检测滤出液中的产物。继续DCM洗涤，直至洗液 中的产物量最小。通过蒸馏从预冷的DCM滤出液中去除DCM，直至剩余的溶液少于4体积水 平(8L)。加入异丙醇(8体积，16L)，继续蒸馏，直至IPA浆液中的残余DCM含量< 1%。将 浓缩物冷却至< 10°C，添加预冷的水(8体积，16L)并快速搅拌以沉淀产物，搅拌的速率使 温度保持在10°C以下。将浆液温热至10-15°C，并熟化。过滤分离产物并用水(2X4体积) 洗涤。将固体空气干燥，然后在20% IPA/水(10体积)中重新浆化。过滤分离产物，用水 (2体积)洗涤，并在真空炉中30-40°C干燥至恒重。回收到2618g(72. 6% )白色粉末。为了合成片段Ac-AA (1-26)-0H，如上所述使树脂(2-CTC，1. 5kg，2. 3mol 活性 Cl) 负载片段Fmoc-AA (27-37)-OH。如上所述装配片段Ac-AA (1_26)-树脂，并以类似的方式裂 解。回收到2841g(61.6% )白色粉末。通过溶液相合成生成片段H-AA (27-38) -NH2,其中在溶液相中将肽片段 Fmoc-AA (27-37) -OH 化学结合至 H-Leu-NH2 (氨基酸 38)，以得到 Fmoc-AA (27-38) -NH2,然后 去除N末端Fmoc保护基团，从而得到H-AA(27-38)-NH2。可使用替代性的碱(K2C03、DBU、 N-甲基哌啶和DEA ( 二乙胺))。为了生成肽片段 Fmoc-AA(27-38)-NH2，将肽片段 Fmoc-AA(27-37)_0H(2618g， 940mmol, 1. O 当量)、H-Leu-NH2 (153g, 1. 18mol, 1. 25 当量)(H-Leu-NH2HCl 盐也曾被使用) 和 6-Cl-H0BT(183g, 1. 08mol, 1. 15 当量)溶解于 DMF(18. 3L，7 体积)，用 DIEA(287ml, 1.65mol，1.75当量)处理并搅拌至溶解，同时冷却至< 2. 5°C。将TBTU(347g，1. 08mol， 1.15当量)在DMF(1体积，2.6L)中浆化后添加，将溶液在O士5°C下搅拌15分钟，然后在 35士5°C下反应至HPLC显示反应完全。在分离片段H-AA (27-38) -NH2前去除肽片段Fmoc-AA (27-38) -NH2的Fmoc化学保 护基团。添加哌啶(372mL，3. 76mol，4当量)，并将溶液在35士5°C下搅拌至HPLC分析显 示基本所有的Fmoc均从所述肽片段中去除。将溶液冷却至< 10°C，并缓慢添加预冷却的水(20.8L，8体积)以沉淀产物。将该自由流动的浆液在10-15°C下熟化，然后通过过滤分 离。用25% EtOH/水洗涤收集的固体并空气干燥。将肽片段在25% EtOH//水(20. 8L，8 体积)中重新浆化>2小时。收集固体，洗涤并空气干燥。然后将该湿润的固体在MTBE/ 庚烷(1 1，8体积，20.8L)中重新浆化，过滤收集，用MTBE/庚烷(2 X 4体积，各自10. 4L) 洗涤，并空气干燥。再进行一次MTBE/庚烷重新浆化，然后将固体在真空炉中35士5°C干燥。 得到2475g(98. 4% )分离肽片段H-AA(27-38)-NH2的制备物。为了制备Ac-AA (1-38) -NH2片段，进行溶液相反应，其中肽片段H-AA (27-38) -NH2 与肽片段Ac-AA(1-26)-OH组合以生成 Ac-(1-38)-NH20 将肽片段Ac-AA(1-26)-OH(1. 18kg， 0. 25mol, 1. 0 当量)、肽片段H-AA(27-38)-NH2 (836g，0. 31mol, 1. 25 当量)、6-Cl_H0BT (57g， 338mmol, 1. 35 当量)和 DIEA(78mL，0. 45mol, 1. 8 当量)溶解于 DMF (8. 9L, 7. 5 体积)，并冷 却至< 2. 50C ο向反应中添加在DMF (0. 5体积，0. 6L)中浆化的TBTU(108g, 338mmol, 1. 35 当量)。将反应物在0士5°C下搅拌5分钟，并在30士5°C下搅拌至HPLC显示反应完全。冷 却反应器，在迅速搅拌下添加预冷却的水(9. 4L，8体积)。过滤分离所得的固体并用额外的 水洗涤。将该固体在20%乙醇/水(7. 1L，6体积)中重新浆化，通过过滤重新收集并用水 洗涤。收集的固体在真空炉中35士5°C下干燥。所得的是2005g(108%)全保护的、分离的 HIV融合抑制剂肽Ac-AA (1-38)-NH2的制备物。作为粗制SEQ ID NO :9肽的合成方法的一方面，HIV融合抑制剂肽 Ac-AA(1-38)-NH2的侧链化学保护基团可通过酸解或本领域技术人员已知的用于通过去除 侧链化学保护基团而使肽脱保护的任意其它方法去除。例如，用TFA(三氟乙酸)DTT(二 硫苏糖醇)水(90 15 5; 10体积)处理HIV融合抑制剂肽Ac-AA (1-38)-NH2 (678g， 92mmol)，并在20+/-2°C下搅拌5小时。在优选的实施方案中，使用10-15当量而非5当量 的DTT来优化结果。将溶液冷却至10°C以下，优选5°C以下，缓慢添加预冷却的MTBE (25体 积，17L，< O0C，优选< -15°C )，添加的速率使得温度保持在10°C以下，优选在7至8°C。使 浆液在10-15°C下熟化，过滤收集所得的固体，用MTBE洗涤，并空气干燥。然后在乙腈(CAN; 10体积，6. 8L)中浆化所得的粉末，并用DIEA和乙酸将pH调节至4_5之间，优选接近5，并 在25士5°C下搅拌该浆液以使该肽脱羧。一旦HPLC显示反应完全，过滤收集固体，用ACN洗 涤，并干燥得到脱保护和脱羧肽的制备物(414g，100% )。在一个实施方案中，纯化所述1144肽SEQ ID NO :9，浓缩并直接从浓缩柱沉淀。 在水性/乙腈缓冲液中通过RP-HPLC三次注射纯化SEQ ID N0:9(270g)。汇集可接受的 组分，用水稀释，直至缓冲液中乙腈的总含量约为28%。将溶液重新加载至HPLC柱，用 1 INaOAc水溶液/乙腈缓冲液洗脱肽。将汇集组分的pH调节至5-6，然后通过向溶液添 加乙腈将乙腈的总含量调节至85%以上。通过真空过滤收集沉淀的固体，用90%乙腈/水 洗涤，真空炉干燥得到78g纯SEQ ID NO 9肽。实施例9在使用2片段Rink- 负载CTC策略的方法中，通过标准固相合成 H-AA (27-38) -Rink-OH (表 1，序列 27)，其 N 末端是 H 且在 C 末端用 Rink 接头-OH (p- [ (R， S) _ α _氨基_2，4- 二甲氧基苄基]-苯氧基乙酸)作为化学保护基团。然后进行溶液相反应，其中将肽片段H-AA(27-38)-Rink-0H(SEQ ID N0:18)与 肽片段Ac-AA (1-26)-OH (SEQ ID NO 10)组合得到具有SEQ ID NO :9的氨基酸序列的HIV融合抑制剂肽。将肽片段 Ac-AA(1-26)-0H(1. Og, 0. 21mmol, 1. 0 当量)、6-Cl_H0BT (39mg，
0.23mmol, 1. 1 当量)和 DIEA (55 μ 1,0. 32mmol, 1. 5 当量)溶解于 DMF(10ml，10 体积)，并 冷却至0-5°C。将TBTU(71mg，0. 22mmol, 1. 05当量)添加至反应。将反应在0_5°C下搅拌 15 分钟，加入单独溶解在 DMF(2mL)中的肽片段 H-AA(27-38)-Rink-OH(628mg，0. 21mmol, 1.0当量)和DIEA(37y 1，0. 21mmol，1.0当量)，冷却至0-5°C。将反应物在0_5°C下搅拌 15分钟，在25士5°C下搅拌3小时或直至HPLC显示反应完全。冷却反应器，在迅速搅拌下 添加水(10体积)。过滤分离所得的固体并用额外的水洗涤。将固体在水/异丙醇中重新 浆化，通过过滤重新收集，用水洗涤。收集的固体在真空炉中35士5°C下干燥。所得的是
1.55g(95. 7% )全保护的、分离的HIV融合抑制剂肽Ac-AA(1-38)-Rink-OH的制备物。然 后采用上述方法或通过本领域技术人员已知的用于脱保护和脱羧的任意其它方法对该HIV 融合抑制剂肽脱保护(去除侧链化学保护基团和C末端Rink基团)和脱羧(在色氨酸残 基处)；然后纯化(例如，通过HPLC)。所得的是具有SEQ ID N0:9序列的(脱保护、脱羧并 纯化的)HIV融合抑制剂肽的制备物(在该图示中，N末端被乙酰化，且C末端被酰胺化)。实施例10在进一步的实施方案中，使用酸超敏树脂通过2片段方法生成SEQ IDNO 9肽，通 过Sieber酰胺树脂以标准固相合成法合成包含SEQ ID NO 9的氨基酸27-38的肽片段 (“H-AA (27-38)-NH2")，其 N 末端为 H，C 末端为-NH2。然后进行溶液相反应，其中将肽片段H-AA (27-38)-NH2与肽片段 Ac-M (1-26)-OH(SEQ ID NO :40)组合得到具有SEQ ID NO :9的氨基酸序列的HIV融合抑制 剂肽。将肽片段Ac-AA(1-26)-0H(lg,0. 21mmol, 1. 0 当量)、肽片段H-AA(27-8)-NH2(677mg， 0. 25mmol, 1. 2 当量)、6-Cl_H0BT (39mg，0. 23mmol, 1· 1 当量)禾口 DIEA (92 μ 1,0. 053mmol, 2· 5 当量)溶解于 DMF(10ml，10 体积)中，并冷却至 0-5"C。将 TBTU(75mg，0. 23mmol, 1. 1 当量)添加至反应。将反应物在0-5°C下搅拌15分钟，然后在25士5°C下搅拌3小时或直 至HPLC显示反应完全。冷却反应器，在迅速搅拌下添加水(10体积)。过滤分离所得的固 体并用额外的水洗涤。将固体在水/异丙醇中重新浆化，通过过滤重新收集，用水洗涤。收 集的固体在真空炉中35士5°C下干燥。所得的是1.58g(101%)全保护的、分离的HIV融合 抑制剂肽Ac-AA (1-38)-NH2的制备物。然后采用上述方法或通过本领域技术人员已知的用 于脱保护和脱羧的任意其它方法对该HIV融合抑制剂肽脱保护(去除侧链化学保护基团和 C末端Rink基团)和脱羧(在色氨酸残基处)；然后纯化(例如，通过HPLC)。所得的是具 有SEQID N0:9序列的(脱保护、脱羧并纯化的)HIV融合抑制剂肽的制备物(在该图示中， N末端被乙酰化，且C末端被酰胺化)。实施例11在进一步优选的用于合成SEQ ID NO :9的2片段方法中，从N末端为H、C末端 为-NH2且具有与CTC树脂结合的侧链Glu37的H-Glu- (CTC树脂)-Leu-NH2 (其合成见下文) 起始，通过标准固相合成法合成包含SEQ ID NO :9的氨基酸27-38 (“ AA (27-38)-NH2 “)的 片段(参见表7，也称为‘‘H-AA (27-38)-NH2游离Glu3/')。然后进行溶液相反应，其中将肽片段H-AA (27-38) -NH2游离Glu37侧链(SEQ ID NO 9)与肽片段Ac-AA(1-26)-OH(SEQ ID NO 40)组合得到具有291144的氨基酸 序列的HIV融合抑制剂肽。将肽片段Ac-AA(1-26) -OH(1. Og, 0. 21mmol, 1. 0当量)、6-Cl-H0BT(39mg,0. 23mmol, 1. 1 当量)和 DIEA(55 μ L，0. 32mmol，1· 5 当量)溶解于 DMF (10ml, 10 体积)，并冷却至 0士5°C。将 TBTU (7Img, 0. 22mmol, 1. 05 当量)添加至反应。 将反应在0士5°C下搅拌15分钟，加入单独溶解在DMF(2mL)中的肽片段H-AA(27-38)-NH2, 游离Glu37(556mg，0. 21mmol, 1 当量)和DIEA(37 μ 1,0. 21mmol, 1. 0 当量)，并冷却至0_5°C。 将反应物在0士5°C下搅拌15分钟，并在25士5°C下搅拌3小时或直至HPLC显示反应完 全。冷却反应器，在迅速搅拌下添加水(10体积)。过滤分离所得的固体并用额外的水洗 涤。将收集的固体在水/异丙醇中重新浆化，通过过滤重新分离，用 水洗涤，并在真空炉中 35士5°C干燥。得到1.43g(92% )全保护的、分离的HIV融合抑制剂肽Ac-AA(1_38)-NH2游 离G1u37(SEQ ID NO 9)的制备物，纯度通过HPLC分析测定。然后采用实施例8中所述的方 法或通过本领域技术人员已知的用于脱保护和脱羧的任意其它方法对该HIV融合抑制剂 肽脱保护(去除侧链化学保护基团和C末端Rink基团)和脱羧(在色氨酸残基处)；然后 纯化(例如，通过HPLC)。所得的是具有SEQ ID N0:9序列的(脱保护、脱羧并纯化的)HIV 融合抑制剂肽的制备物(在该图示中，N末端被乙酰化，且C末端被酰胺化)。实施例12在此说明了采用线性固相合成步骤来合成具有1144氨基酸序列(SEQ IDNO 9)的 HIV融合抑制剂肽的方法。具有SEQ ID NO :9的HIV融合抑制剂肽可在固相支持物上以线 性方式高产率和高纯度地合成，其仅需要一种负载树脂作为起始原料，且不涉及片段的溶 液缩合和相应片段在溶液相中的脱保护，从而简化了合成方法。SEQ ID NO 9肽可通过标准固相合成法合成得到(采用酰胺树脂，例如Sieber树 脂或Rink树脂(也可用其它树脂，例如Ramage)；或者修饰的树脂，例如rink-接头-负 载的CTC树脂，或者Y -谷氨酰基(Leu-酰胺)-负载的CTC树脂)，其在N末端被乙酰化 (“Ac”，作为化学基团)，同时在C末端具有酰胺基团(-NH2)。该肽从用于其固相合成的树 脂裂解，且HIV融合抑制剂肽Ac-AA (1-38) -NH2的侧链化学保护基团可通过酸解或本领域 技术人员已知的通过去除侧链化学保护基团为肽脱保护的任意其它方法去除。然后通过 HPLC或其它合适的层析技术纯化该脱保护和脱羧的肽，以得到分离HIV融合抑制剂SEQ ID NO :9肽的制备物。rink-接头-负载的CTC树脂可通过以本领域技术人员已知的方法将Fmoc-rink 接头加载至CTC树脂获得。在该实施例中，显示了 Fmoc-Y-谷氨酰基(Leu-酰胺)及 其向 CTC 树脂的加载。将 Fmoc-Glu (OtBu)-OH(22. 175g,50mmol)、6-Cl_H0Bt (10. 176g, 60mmol)、DIEA(21. 78ml, 125mmol)和 H-Leu-NH2 (9. 764g,75mmol)溶解于 DMF(220L，10 体 积)，并冷却至5°C以下，然后将添加TBTU(19. 266g,60mol)至该反应烧瓶中。将反应混合 物在5°C以下搅拌30分钟，并在室温下搅拌1小时或直至HPLC显示反应完全。用水沉淀 Fmoc-Glu (OtBu)-Leu-NH2，用 0. 2%N HCl 洗涤，并在 20% IPA 禾Π 4% NaHCO3 中重新菜化。通 过用95% TFA/水处理去除t-Bu保护基团后，通过本领域已知的方法将Fm0c-Glu-Leu-NH2 加载至CTC树脂以提供、~谷氨酰基(Leu-酰胺)-负载的CTC树脂。 Fmoc-Rink-CTC 树脂Fmoc- γ -谷氨酰基(Leu_NH2) -CTC 树脂(rink-负载的CTC树脂) (Y -谷氨酰基(Leu-酰胺)-负载的CTC树脂)实施例13在分离和纯化SEQ ID NO 9肽的方法中，将纯冻干的Ac-AA (1_38) -NH2 (908mg)在 8 2乙腈水(18ml，20体积)(10-30体积可接受)中20 士 5 °C下浆化3小时(1_5小时 可接受)。通过过滤重新分离该产物，用8 2乙腈水洗涤，并在35士5°C下真空干燥得 至Ij 854mg(94% )纯的、脱盐 Ac-AA(1-38) _NH2。还可通过将纯SEQ ID NO 9加载至S^hadex柱并以9 1水/ACN洗脱，或者通 过重新加载回RP-HPLC柱并用5mM NH40Ac/ACN 1 1洗脱，来明显减少SEQ ID NO 9的盐 含量(使得其适于制剂)。在这两种情况下，该肽可通过冻干重新分离。冻干的SEQ ID NO 9肽的沉淀1.将1144 (SEQ ID NO 9)固体(186. 2g，已通过冻 干分离)溶解于9312mL含于水中的20% ACN，用TFA(46mL)将pH降低至 1.6。然后用 IN Na0H(583mL)将pH提高至最终pH 4.76。将烧瓶在冰浴中冷却2小时，然后过滤固体， 并在真空炉中35士5°C干燥，得到179. 5g(96% )纯的脱盐的Ac-AA(1_38)_NH2。冻干的SEQ ID NO 9肽的沉淀2.将1144 (SEQ ID NO 9)固体(已通过冻干分离) 以50mg/ml的浓度溶解于50%乙腈-水中，并将pH调节至8_9。然后在添加更多的乙腈以 将乙腈总浓度上升至85%以上之前，将溶液的pH调回5-6。通过真空过滤收集沉淀的固体， 用90%乙腈/水洗涤，并在真空炉中干燥。在另一实施方案中，将1144(SEQ ID NO 9)固体(已通过冻干分离)以70mg/ml 的浓度溶解于50%乙腈-水(14体积)中，并用NH4OH将pH调节至6-9。精过滤后，将溶 液添加至乙腈(48体积)中，再用2体积50%乙腈/水洗涤该溶解罐和管道。在真空过滤 前将所得的浆液搅拌10分钟。使用10体积90%乙腈/水和直接的乙腈(各10体积)洗 涤该固体。在真空炉中将收集的肽干燥至恒重。在另一实施方案中，将含于50% ACN,50% IOmM NaOAC 的纯 1144(SEQIDN0 9)溶 液酸化至PH 5-6，并用乙腈稀释以沉淀该产物。通过分离所得的固体，并用90%乙腈/水 洗涤，然后用直接的乙腈洗涤(各10体积)。在真空炉中将收集的肽干燥至恒重。实施例14本发明进一步提供了在HIV感染和/或AIDS的治疗、疗法或作为治疗方案的一部 分中施用抗病毒肽(例如，HIV融合抑制剂肽，其自身或作为本发明所提供的组合物的活性 药物成分)的方法。HIV融合抑制剂肽的抗病毒活性可被用于抑制HIV向靶细胞传递的方 法中，该方法包括将病毒和/或细胞与一定量的能有效抑制HIV感染细胞(更优选地，抑制 病毒和靶细胞之间发生HIV-介导的融合)的HIV融合抑制剂肽接触。该方法可用于治疗 HIV感染患者(治疗性)或治疗新近暴露于HIV或具有暴露于HIV的高风险(例如，通过使 用毒品或高风险性行为)的患者(预防性)。因此，例如，对于HIV-I感染的患者，HIV融合 抑制剂肽的有效量应该是(其自身和/或与给药方案结合)足以降低被治疗患者的HIV病毒载量的剂量。如本领域技术人员已知，存在多种测量HIV病毒载量的标准方法，其包括但 不限于通过外周血单核细胞的定量培养和通过血浆HIV RNA测量。该HIV融合抑制剂肽可 以以单次施用、间歇性、周期性或连续性的方式施用，这可由医疗人员通过例如病毒载量的 监测进行确定。取决于本发明所提供的含HIV融合抑制剂肽的具体组合物，以及本发明所 提供的该具体组合物是否进一步包含药学可接受的载体和/或大分子载体等因素，该HIV 融合抑制剂肽可在数天至数周或可能更长的范围内周期性施用。此外，HIV融合抑制剂肽 可用于抗病毒疗法，以与其它用于治疗HIV的抗病毒药物或预防剂联用或用于使用其它用 于治疗HIV的抗病毒药物或预防剂的治疗方案(例如，同时使用，或在循环开始时与一种药 物而在循环结束时与另一种药物一起使用)。一种常用的涉及抗病毒剂组合的治疗称为HAART(高效抗逆转录病毒疗法)。 HAART通常将三种或更多种具有HIV抗病毒活性的药物组合，并通常包括一个类别以上的 药物(“类别”指作用机制或者该药物靶向的病毒蛋白或过程)。因此，本发明所提供的包 含HIV融合抑制剂肽的组合物可单独施用(例如，作为单一疗法)，或可在治疗方案中施用， 或与用于治疗HIV感染和/或AIDS的额外治疗剂组合以共施用，这在本发明有更具体的描 述。例如，在一个实施方案中，一种或多种治疗剂在治疗中可与本发明所提供的组合 物中的HIV融合抑制剂肽组合。该组合除了该HIV融合抑制剂肽之外还包含至少一种抗病 毒剂。该种组合可例如由有效量的已被批准或将被批准的抗病毒剂(用于治疗HIV感染) 制备得到，该抗病毒剂包括但不限于选自如下的一种或多种额外的治疗剂抗病毒剂，如细 胞因子，例如rIFN a、rIFN 3、rIFN y ；逆转录酶抑制剂，包括但不限于阿巴卡韦、AZT (齐 多夫定)、ddC(扎西他滨)、奈韦拉平、ddl (地达诺新)、FTC(恩曲他滨)、(+)和(-)FTC、 reverset、3TC(拉米夫定)、GS 840、GW-1592、GW-8248、GW_5634、HBY097、地拉韦定、依法韦 仑、d4T(司他夫定)、FLT、TMC125、阿德福韦、替诺福韦以及阿洛夫定；蛋白酶抑制剂，包括 但不限于安泼那韦、CGP-73547、CGP-61755、DMP-450、印地那韦、那非那韦、PNU-140690、利 托那韦、沙奎那韦、替利那韦、替拉那韦、阿扎那韦、洛匹那韦、ABT378、ABT538和MK639 ；病 毒mRNA加帽抑制剂，例如三氮唑核苷；作为具有抗-HIV活性的脂质结合分子的两性霉素 B ；作为糖蛋白加工抑制剂的澳粟精胺；病毒进入抑制剂，如融合抑制剂(恩夫韦肽、T1249、 其它融合抑制剂肽以及小分子)、SCH-D、UK-427857 (Pfizer), TNX-355 (Tanox Inc.)、 AMD-070 (AnorMED) 、Pro 140、Pro 542 (Progenies)、FP-21399 (EMD Lexigen) 、BMS806、 BMS-488043 (Bristol-Myers Squibb)、maraviroc (UK-427857)、0N0—4128、GW—873140、 AMD-887、CMPD-167 以及 GSK-873, 140 (GlaxoSmithKline) ；CXCR4 拮抗剂，例如 AMD-070)； 脂质和/或胆固醇相互作用调节剂，例如盐酸普鲁卡因(SP-01和SP-01A)；整合酶抑制剂， 包括但不限于L-870和810 ；RNAseH抑制剂；rev或REV的抑制剂；vif的抑制剂(例如， vif-衍生的脯氨酸富集肽、HIV-1蛋白酶N-末端衍生肽)；病毒加工抑制剂，包括但不限于 白桦苷和二氢白桦苷衍生物(例如PA-457)；以及免疫调节剂，包括但不限于AS-101、粒细 胞巨噬细胞集落刺激因子、IL-2、丙戊酸以及胸腺喷丁。如HIV感染和/或AIDS治疗领域 技术人员所能理解，组合药物治疗可包括两种或多种具有相同作用机制的治疗剂，或者可 包括两种或多种具有不同作用机制的治疗剂。这些可与HIV融合抑制剂肽组合的示范性的额外治疗剂和/或本发明所提供的组合物的有效剂量为本领域所公知。此外，待施用的本发明所提供的HIV融合抑制剂肽或药 物组合物的有效剂量可通过本领域技术人员公知的步骤确定，例如通过测定效力、生物半 衰期、生物利用度和毒性进行确定。在一个实施方案中，有效量的HIV融合抑制剂肽及其 剂量范围可由本领域技术人员采用通过本领域技术人员公知的常规体外和体内研究所得 的数据确定。例如，如本发明所述的抗病毒活性体外传染性测定使得本领域技术人员能够 确定所述化合物作为唯一活性成分或与其他活性成分组合时抑制预定的病毒传染性范围 (例如，50%抑制IC5tl ；或90%抑制，IC90)或病毒复制所需的平均抑制浓度(IC)。然后，本 领域技术人员可采用由一个或多个标准模型得到的药代动力学数据选择合适的剂量，从而 使得到的该活性成分的最小血浆浓度(C[min])等于或大于抑制病毒感染或病毒复制的预 定值。尽管剂量范围通常取决于所选的施用途径和给用的剂型(施用途径包括但不限于皮 下、肠胃外、皮内或口服施用)，但作为活性成分的化合物的示范性剂量范围可以是约Img/ kg体重至约100mg/kg体重；更优选地不少于lmg/kg体重至不超过10mg/kg体重。在一个 实施方案中，可通过注射施用(例如，皮下注射)，在一个实施方案 中，HIV融合抑制剂肽。因此，提供了一种抑制HIV向细胞传递的方法，其包括给予抑制所述细胞被HIV感 染有效量的包含HIV融合抑制剂肽的本发明所述的组合物。该方法可进一步包括通过向所 述个体给予(同时或先后，或作为治疗方案的一部分)包含有效量的本发明所提供的HIV 融合抑制剂肽或药物组合物的治疗剂的组合，以向患者给予本发明所述的组合物与用于治 疗HIV感染和/或AIDS的其它治疗剂的组合。还提供了抑制HIV进入的方法，其包括向有 此需要的患者给予抑制病毒进入靶细胞有效量的包含HIV融合抑制剂肽的本发明所述的 组合物。该方法可进一步包括给予本发明所提供的组合物与有效量的一种或多种可用于治 疗HIV感染的额外抑制剂(例如，病毒进入抑制剂)的组合。实施例15下文阐述了制备本发明所提供的组合物的方法。此外还描述了示范性的组合物。材料蔗糖醋酸异丁酸酯(SAIB)由Eastman Chemicals获得。聚丙交酯(PLA)和 聚丙交酯-共-乙交酯(PLGA)由Lakeshore Biomateials.获得。PLA和PLGA的丙交酉旨 乙交酯比例、分子量及其末端基团不同。本研究中所用的所有PLGA为50 50丙交酯乙 交酯。分子量以名称中的数字分级。分子量约为该数值的10000倍。末端基团为羧酸(A)、 甲酯(M)或月桂酯基(L)。N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)由Spectrum获得。苯甲酸苄酯和 三乙酰甘油酯由Sigma获得。盐酸胍由Amresco获得。Tris-HCl由Sigma获得。4_(2_吡 啶偶氮)雷琐酚由Sigma获得。甲醇由VWR获得。七水合硫酸锌由Sigma获得。氯化锌由 Sigma获得。T1144肽物质的制备T1144肽物质可参照如下方案制备。喷雾干燥将Tl 144肽在小于4或大于6的ρΗ下溶解，通常溶于水。采用IN NaOH 或IN HCl调节ρΗ。通过雾化喷嘴将肽溶液喷入加热室中。人工收集干燥的肽颗粒。可进一步通过上述喷雾干燥法制备肽，但向该喷雾干燥溶液添加赋形剂，从而将 该赋形剂和该肽混合。盐或ρΗ沉淀将肽在小于4或大于6的ρΗ下溶解，通常溶于水中。采用IN NaOH 或IN HCl调节ρΗ。添加盐溶液或强酸/碱以引起沉淀。过滤收集沉淀物，冻干并过200 μ m 筛网以控制颗粒大小。
溶媒沉淀参照如下方案制备溶媒。SAIB溶媒沉淀将能得到所需最终浓度的适当量的SAIB加热并添加至NMP，混合 至均勻。SAIB/PLA溶媒制备将能得到所需最终浓度的适当量的PLA溶解于NMP、苯甲酸苄 酯或三乙酰甘油酯。将能得到所需最终浓度的适当量的SAIB加热并添加至该PLA溶液，混 合至均勻。PLA、PLG和PLGA溶 媒制备将能得到所需最终PLA、PLG和PLGA浓度的适当量的 PLA、PLG 和 PLGA 溶解于 NMP。组合物可通过本领域技术人员已知的任意方法制备。在本实施例中，肽物质(沉 淀或喷雾干燥形式的)被添加至管瓶中。将溶媒添加至该管瓶，将内含物混合至均勻。在 某些情况下，需要温热至 40°C以确保适当混合。配方以肽重量/配方重量为mg/g进行定量。以类似于Edelhoch法的方式基于色氨酸和酪氨酸吸收测定肽含量。简言之，将 Img肽物质溶解于ImL 8M盐酸胍。在276、280和288nm下测定该溶液的UV吸收。使用 测得的吸收值，以及已知的样本重量、样本体积、肽中色氨酸和酪氨酸残基数量以及肽分子 量，测得固体中的肽含量(％ w/w)。金属阳离子含量通过采用4-(2_吡啶偶氮)雷琐酚(PAR)(已知与M2+形成2 1 络合物的金属显色指示剂)的UV/vis吸收测定进行检测。简言之，将 Img固体溶解于含 6M盐酸胍的ImL Tris-HCl缓冲液中(pH 8)。(使用相同的缓冲液)稀释该溶液，使得最终 的金属阳离子浓度为1-10 μ M。将50yL 0. IM PAR添加至950 μ L稀释的溶液。平衡后， 在500nm下检测该测试溶液的UV/vis吸收。金属阳离子浓度基于同日获得的标准曲线的 最小二乘分析计算得到，从而确定该样本的金属阳离子含量)。通过LC-MS测定血浆中的肽浓度。用3体积含0. 5% (ν/ν)甲酸的乙腈稀释该血 浆样本，离心，直接测定上清液。采用梯度洗脱(IOmM醋酸铵，pH 6.8 乙腈，0. 6mL/min) 进行层析，总运行时间为6分钟。在采用4X 2mm PhenomenexSecurityGuard C8保护柱保 护的 Phenomenex Luna C8 (2) 50 X 2mm 柱上进行分离。在 Sciex API4000 或 API4000 Qtrap 仪器上运行质谱(ESI+)，该质谱通常为single-quad模式，检测[M+3H]3+或[M+4H]4+离子。 由30ng/mL至30ng/mL构建T1144校正曲线。结果表示为随时间的血浆肽浓度。采用了如 下缩写=Cmax =最大血浆肽浓度；tmax = Cfflax的时间；tai =血浆肽浓度降至低于0. 1 μ g/ml 的时间；以及ta(11 =归一化血浆浓度降至0. 01 μ g/mL以下的时间。在一些情况下，血浆浓 度归一化至3mg/公斤动物体重，以便于比较。动物按如下方式给药。将过量的含T1144组合物通过16G针头抽入Icc注射器。 将针头换为18G或21G针头，将注射器排空至正确剂量。在肩胛骨的皮下空间向动物给药。 向大鼠(400g)给用400 μ L，每剂量组三只动物。向短尾猴(2. 5kg)给用400 μ L或1000 μ L， 每组三只动物采用大鼠或猴采集所有的药代动力学数据。在一些情况下，血浆浓度归一化至 3mg/公斤动物，以便于比较。制备如下含肽组合物。T1144/锌沉淀物A.将T1144溶解于水中，pH调节至 6. 2，并添加水至浓度为25mg/ml。将溶液通过0. 22 ii m过滤器。将2mL 0. 1M ZnS04添加至80mL T1144溶液。离 心所得的悬浮液，倾析上清液，并冷冻沉淀物。该沉淀物被冻干并通过200 y m筛。T1144/锌沉淀物B.将T1144溶解于水中，pH调节至 6. 2，并添加水至浓度为 25mg/ml。将溶液通过0. 22 ii m过滤器。将60mL 0. 1M ZnS04添加至120mL T1144溶液。离 心所得的悬浮液，倾析上清液，并冷冻沉淀物。该沉淀物被冻干并通过200 y m筛。T1144/锌沉淀物C.将T1144溶解于水中，pH调节至 5. 7，并添加水至浓度为 40mg/ml。将溶液通过0. 22iim过滤器。将< lOOmg ZnCl2添加至20mLT1144溶液。离心 所得的悬浮液，倾析上清液，并用lmL水洗涤沉淀物。该沉淀物被冷冻、冻干并通过200 ym 筛。T1144/锌沉淀物D.用5mL水洗涤沉淀物B，离心并倾析上清液。将该步骤重复两 次。将所得沉淀物冷冻、冻干并通过200 ym筛。T1144/锌沉淀物E.将445mg ZnS04*7H20溶解于2mL水中。将1. 0g沉淀物D在 该锌溶液中浆化。该浆液被冷冻、冻干并通过200 y m筛。T1144/沉淀物F.将T1144溶解于水中，pH调节至 6. 2，并添加水至浓度为25mg/ ml。将溶液通过0. 22 y m过滤器。添加5mL IN醋酸，将pH降至 5。离心所得的悬浮液， 倾析上清液，并冷冻沉淀物。该沉淀物被冻干并通过200 y m筛。T1144/锌沉淀物G.将230mg ZnS04*7H20溶解于2mL水中。将500mg沉淀物F在 该锌溶液中浆化。该浆液被冷冻、冻干并通过200 y m筛。T1144/锌沉淀物H.将T1144溶解于水中，pH调节至 8. 4，并添加水至浓度为 50mg/ml。将溶液通过0.22 iim过滤器。添加甲醇至浓度为25mg/mL (50 50甲醇水)。 将 lml 0. 1M ZnS04添加至该20mL TRI-1144溶液。离心所得的悬浮液，倾析上清液，并 冷冻沉淀物。该沉淀物被冻干并通过200 ym筛。T1144/沉淀物I.将T1144溶解于水中，pH调节至 8. 4，并添加水至浓度为50mg/ ml。将溶液通过0.22 iim过滤器。添加甲醇至浓度为25mg/mL(50 50甲醇水)，将pH调 节为 5。离心所得的悬浮液，倾析上清液，并冷冻沉淀物。该沉淀物被冻干并通过200 ym 筛。T1144/锌沉淀物J.将T1144溶解于水中，pH调节至 6. 2，并添加水至浓度为 25mg/ml。将溶液通过0. 22 ii m过滤器。将60mL 0. 1M ZnS04添加至120mL T1144溶液。离 心所得的悬浮液，倾析上清液，并冷冻沉淀物。该沉淀物被冻干并通过150 y m筛。T1144/锌沉淀物K.将T1144溶解于水中，pH调节至 6. 2，并添加水至浓度为 25mg/ml。将溶液通过0. 22 ii m过滤器。将lmL 0. 1M ZnS04添加至40mL T1144溶液。离 心所得的悬浮液，倾析上清液，并冷冻沉淀物。该沉淀物被冻干并通过150 y m筛。T1144/锌沉淀物L.用30mL水洗涤1. 0g沉淀物J，离心并倾析上清液。重复该步 骤。将所得沉淀物冷冻、冻干并通过200 ym筛。T1144/锌沉淀物M.将T1144溶解于水中，pH调节至 -6. 3，并添加水至浓度为 25mg/ml。将溶液通过0. 22 ym过滤器。通过雾化喷嘴(以类似于喷雾干燥的方式)将25mL T1144溶液喷入50mL剧烈搅拌的0.3M ZnS04溶液。离心所得的悬浮液，倾析上清液，并冷 冻沉淀物。该沉淀物被冻干并通过200 ym筛。T1144/锌沉淀物N.将T1144溶解于水中，pH调节至 6. 3，并添加水至浓度为
5450mg/ml。添加甲醇至最终T1144溶液浓度为25mg/mL。将溶液通过0. 22 μ m过滤器。通 过雾化喷嘴(以类似于喷雾干燥的方式)将25mL T1144溶液喷入50mL剧烈搅拌的0. IM ZnSO4溶液。将所得的悬浮液离心并倾析。用IOmL水洗涤沉淀物三次。离心该悬浮液，倾
析上清液，并冷冻沉淀物。该沉淀物被冻干并通过200 μm筛。
表10 肽物质组合物 按照如下所述将上述组合物施用至大鼠或猴。预期在大鼠和猴中所得的结果与人 类的结果合理关联。沉淀物D 以 100mg/g 在 74 11 15SAIB PLA3L NMP 中配制，并以 1000 μ L 施用至短尾猴。如图9所示(一 一)，血浆浓度超过目标值1 μ g/mL达12天，超过了目标 时间7天。沉淀物J以50mg/g在40 60PLA3L NMP中配制，并以400 μ L施用至短尾猴。 如图9所示(一 ■ 一)，血浆浓度超过目标值1 μ g/mL达7天；更大的剂量，例如1000 μ L的lOOmg/g的沉淀物J，可潜在地得到目标血浆浓度达10-12天。这表明了 T1144可在SAIB/PLA或PLA溶媒中被皮下传递，并提供超过目标值(即，lyg/mL)的血浆浓度达一周以上。沉淀物D 以 100mg/g 在 74 11 15SAIB PLA3L NMP 中配制，并以 400 μ L 施用至大鼠。如图10所示(一 一)，血浆浓度超过目标值1 μ g/mL达6天，接近达到目标 时间7天。沉淀物J以50mg/g在40 60PLA3L NMP中配制，并以400 μ L施用至大鼠。 如图10所示(一 ■ 一)，血浆浓度超过目标值1 μ g/mL达7天。这表明了该配方在啮齿动 物和灵长动物模型中提供了类似的T1144持续传递。SAIB =PLA比例对大鼠中药代动力学特性的影响。沉淀物A以50mg/g在 SAIB PLA3M NMP溶媒中配制，并以400 μ L施用至大鼠。如图11所示，SAIB PLA比 例的下降(即更多的PLA)降低了 Cmax，升高了 tmax并升高了 ta(ll。沉淀物B同样以50mg/ g在SAIB PLA3M NMP溶媒中配制，并以400 μ L施用至大鼠。如图12和13所示，结果 从性质上类似于沉淀物A的结果。然而，SAIB PLA比例对沉淀物B的传递的影响程度小 于其对沉淀物A的传递的影响。这表明了降低SAIB PLA比例促进了 TRI-1144的持续传 递，且沉淀物特性(特别是锌在沉淀物中的量)可影响传递速率。基质溶剂比例对大鼠中药代动力学特性的影响。沉淀物B以50mg/g在 SAIB PLA3M NMP溶媒中配制，并以400 μ L施用至大鼠。如图14所示，约10%的PLA 水平可相对于更低的PLA水平减缓肽传递。溶剂类型对大鼠中药代动力学特性的影响。沉淀物B以50mg/g在 75 5 20SAIB PLA3M 溶剂(即三乙酰甘油酯、苯甲酸苄酯或NMP)中配制，并以 400 μ L施用至大鼠。如图15所示，随着溶剂类型变化，Cmax下降，tmax上升，且、^上升。 NMP比三乙酰甘油酯提供了更理想的药代动力学特性，而后者的表现优于苯甲酸苄酯。这表 明溶剂类型影响肽传递。肽浓度对大鼠中药代动力学特性的影响。沉淀物B在 75 5 20SAIB PLA3M NMP溶媒中配制，并以400 μ L施用至大鼠。结果显示于图16， 其表明，在该溶媒中，可增加肽浓度而不对肽传递产生不利影响。注射体积对大鼠中药代动力学特性的影响。沉淀物B以100mg/g在
74 11 15SAIB PLA3M NMP溶媒中配制，并以施用至大鼠。如图17所示，给药体积 对持续传递参数没有明显影响；然而，400 μ L给药在一定程度上优于200 μ L给药(均被归 一化)。沉淀物C在77 15 8SAIB NMP 乙醇溶媒中配制，并向大鼠给药。如图17 所示，在控制肽剂量时的前三天内给药体积对持续传递参数没有明显影响；然而，三天后 400 μ L给药在一定程度上优于200 μ L给药。这表明了增加注射体积可以促进持续传递。SAIB溶媒中的PLA类型对大鼠中药代动力学特性的影响。沉淀物A以50mg/g在
75 5 20SAIB PLA NMP溶媒中配制，并以400 μ L施用至大鼠。如图18所示，将PLA 类型由3L变为3Μ可降低Cmax，增加tmax，并增加ta(ll。这表明PLA类型影响持续传递。肽沉淀物形式对大鼠中药代动力学特性的影响。沉淀物A、B、E和G分别以50mg/ g在75 5 20SAIB PLA3M NMP溶媒中配制，并以400 μ L施用至大鼠。如图19所 示，在初始沉淀过程中锌含量的增加可降低Cmax，提高tmax，并提高ta(ll (Α和B)。向低锌沉淀 物添加硫酸锌作为冻干盐可降低Cmax，提高tmax，并提高ta(ll(A和E)。当最终的沉淀物含硫 酸锌作为冻干盐时，用锌取代PH沉淀不影响持续传递参数(E和G)。即使总锌浓度相近，沉淀物E和G在该溶媒中的表现均不如沉淀物B。这表明了锌结合进入沉淀物的方式(例 如，如何沉淀或喷雾)明显影响肽的持续传递。聚合物类型和给药体积对猴的药代动力学特性的影响。沉淀物D在 SAIB PLA NMP溶媒中配制并施用至短尾猴。如图20所示，将溶媒由75 5 20变 为74 11 15 (400 yL剂量)不明显影响持续传递参数；然而，两者的表现均优于水性溶 液。在74 11 15中将给药体积增加至lOOOyL将降低C_，降低t_，并提高ta(11。这 表明改变给药体积将影响持续传递。PLA和PLGA凝胶系统基质溶剂比例对大鼠中药代动力学特性的影响。沉淀物A和D分别以50mg/g在 PLGA1A NMP溶媒中配制，并以400 iiL施用至大鼠。如图21所示，提高基质溶剂比例(更 多的PLGA)将降低Cmax，提高t_，并提高ta(ll。这表明溶媒中聚合物的量影响持续传递。聚合物类型对大鼠中药代动力学特性的影响。沉淀物A和D分别以50mg/g在聚 合物NMP溶媒中配制，并以400 iiL施用至大鼠。如图21所示，增加聚合物丽和L G比 例可同时降低Cmax，提高tmax，并提高ta(11。沉淀物B以50mg/g在聚合物NMP溶媒中配制， 并以400 iiL施用至大鼠。如图22所示，提高L G比例可降低Cmax，提高tmax，并提高、.^ 提高聚合物棚可降低C_，提高t_，并提高ta(ll。这表明溶媒中的聚合物类型影响持续传 递。溶剂类型对大鼠中药代动力学特征的影响。沉淀物B以50mg/g在PLGA1A 溶剂 溶媒中配制，并以400 y L施用至大鼠。如图22所示，将溶剂由NMP改变为三乙酰甘油酯， 仅提高ta(ll。这表明溶媒中的溶剂类型影响持续传递。肽浓度对大鼠中药代动力学特性的影响。沉淀物B在50 50PLGA1A NMP溶 媒中配制，并以400 yL施用至大鼠。如图23所示，提高剂量将降低C_，提高t_，并降低 taQ1 (均被归一化)。沉淀物H在40 60PLA3L NMP溶媒中配制，并以400 y L施用至大 鼠。如图23所示，提高剂量将降低C_，提高t_，并降低ta(ll (均被归一化)。这表明PLA 和PLGA溶媒可提供高剂量肽的持续传递。肽形式(无锌)对大鼠中药代动力学特性的影响。沉淀物I和喷雾干燥物质以 50mg/g在40 60PLA3L NMP溶媒中配制，并以400 y L施用至大鼠。如图24所示，改变 为不含锌肽形式不改变持续传递参数。这表明不含锌的肽的物理形式不明显影响持续传 递。肽形式对大鼠中药代动力学特性的影响。沉淀物H、J、K和L以50mg/g在 40 60PLA3L NMP溶媒中配制，并以400 y L施用至大鼠。如图25所示，洗涤该沉淀物以 降低锌含量不改变持续传递参数(J和L)。洗涤后的沉淀物的表现明显不同于未洗涤的低 锌沉淀物(K和L)。从50 50甲醇水溶液沉淀可降低C_并提高t_。这表明在该溶媒 中，与肽沉淀的锌的量并不影响持续传递；然而，沉淀肽的溶液不明显影响传递。阳离子类型对大鼠中药代动力学特性的影响。数种钙和铁沉淀物在 40 60PLA3L NMP溶媒中配制，并以400 y L施用至大鼠。如图26所示，所有的制剂均显 示了一定的持续传递，铁制剂的表现优于钙制剂。这表明除了锌以外的其它阳离子沉淀物 可提供肽的持续传递。聚合物类型和肽形式对猴的药代动力学特性的影响。沉淀物在聚合物NMP溶媒中配制，并施用至短尾猴。如图27所示，同时将40 60PLGA1A NMP溶媒和沉淀A改为 40 60PLA3L NMP溶媒和沉淀物J可降低Cmax，降低tmax，并提高ta。这表明聚合物特 性(例如，类型和分子量)以及制备肽的方式对于持续传递非常重要。沉淀方法对大鼠中药代动力学特性的影响。沉淀物H、J、M和N分别在 40 60PLA3L NMP溶媒中配制，并以400 μ L施用至大鼠。如图28所示，标准沉淀物J和 H分别类似于 (即具有类似的肽和锌含量)喷雾沉淀物M和N。在每种情况下，该喷雾的沉 淀物显示了提高的Cmax和tmax。喷雾沉淀物在该周末尾的血浆浓度大于或等于标准沉淀物。 这表明喷雾沉淀物可相对标准沉淀物提供更高的持续传递潜力。原位形成凝胶以下实施例阐述了包含本发明的肽的原位形 成凝胶制剂的制备。在以下的实施例 中，该原位形成凝胶制剂基于来自Atrix制药的Atrigel技术和来自DURECT制药的SABER 技术。在一个实施例中，将所述药物物质悬浮于热塑性系统中，其中固体、线性链、可生 物降解的聚合物或共聚物(例如，聚-丙交酯_共-乙交酯酸(PLGA))被溶解于溶剂(N-甲 基吡咯烷酮(NMP))中以形成液体溶液。一旦该聚合物溶液被置于具有充足的水的体内，该 溶剂从该聚合物中扩散，使得聚合物固化为固体结构。随着PLGA降解，该药物物质缓慢释 放。商用产品的范例为Eligard 或悬浮于Atrigel 的醋酸亮丙瑞林。在另一实施例中，采用SABER技术，将所述药物物质悬浮于蔗糖醋酸异丁酸酯 (SAIB)中，其与乙醇混合以降低该溶液的粘度。SAIB是非聚合的、非水溶性的高粘度液体 材料，其不在环境或生理条件下结晶。一旦该肽-SAIB溶液被置于具有充足的水的体内，该 溶剂从该SAIB中扩散，使得SAIB固化为固体结构。随着SAIB降解，该药物物质缓慢释放 进入血流。可用的商用产品的范例为Posidur 或悬浮于SAIB中的丁哌卡因。实施例16在此说明了包含本发明的肽的原位凝胶制剂的制备的其它实施例。初始时将 TRI-1144喷雾干燥或通过添加冰醋酸沉淀。然后从硫酸锌水溶液沉淀TRI-1144，以形成 Zn:TRI-1144络合物。在分析锌和肽含量时，该Zn TR-1144比例为1. 1 1。在其它实 施例中，TR-1144被溶解于50 50水甲醇溶液中，然后添加硫酸锌沉淀。SAIB购自MalIinckrodt。将TRI-1144沉淀物悬浮于不同的SAIB PLGA 乙醇 (表11)溶液中，然后施用至大鼠/猴。将PLGA溶解于乙醇中，然后添加至SAIB以实现所 需的％ wt/wt。基于动物PK研究的结果，优化沉淀物类型和溶剂。表11. SAIB PLGA 乙醇溶剂系统研究(％ Wt/Wt) 所有的PLA/PLGA 聚合物来自 Lakeshore Biomaterials，Mobile，Alabama。将锌 沉淀物悬浮于不同的PLA NMP和PLGA NMP溶液中(表12)，然后施用至大鼠/猴。总 体而言，可通过将PLA/PLGA溶解于NMP中制备该溶剂，然后根据需要添加其它的亲水溶剂。 基于动物PK研究的结果，优化沉淀物类型和溶剂。表12. PLA NMP和PLGA NMP溶剂系统研究 表13.动物药代动力学研究索引 结果/讨论用SAIB形成的TRI-1144的原位形成凝胶显示了第一周的持续释放。图29显示 了 TRI-1144 SAIB凝胶在大鼠中的TRI-1144释放。随着SIAB浓度升高，TRI-1144释放时间更长。然而，在与PLA/PLGA NMP中的TRI-1144原位形成凝胶比较时，TRI-1144的释放 时间没有那么长。图30显示了 Atrigel系统和SABER形成的原位形成凝胶的比较。SABER 凝胶具有相对较高的喷出(burst)，且在100小时内基本上释放了所有的TRI-1144。然而， 用Atrigel系统形成的TRI-1144凝胶在一周后仍释放TRI-1144。此外，采用Atrigel技 术的TRI-1144制剂的粘度小于采用SABER技术的制剂。这可在如图31所示的猴PK研究 #527的结果中得到证明。这两种制剂中TRI-1144释放的持续时间相同。然而，由于具有相 对更低的粘度，悬浮于PLGA的TRI-1144给药更为容易。Zn-TRM 144沉淀物优化TRI-1144的持续释放可通过用硫酸锌沉淀TRI-1144来进一步提高。分析锌含 量时，锌与TRI-1144以1. 1 1比例络合。初始制剂包含最大100倍的可及锌。在图31 中所示的猴PK研究#结果以及由图8中大鼠PK研究#530的制剂782-102的结果表明 Zn-TRI-1144络合物增强了持续释放。然而，该结果类似于图32中大鼠PK研究#531的制 剂782-099的结果所示的最小量的锌与TRI-1144络合的情况。Zn-TRI-1144沉淀物可通过 在用硫酸锌沉淀前将TRI-1144溶解于50 50水甲醇溶液中被进一步优化。TRI-1144 溶解于水的沉淀的沉淀物是精细的白色、流动性粉末，而TRI-1144溶解于有机溶液时形成 的Zn-TRI-1144沉淀物是团块固体，其需要在悬浮于给药溶剂之前进行研磨。在通过x射 线粉末衍射分析时，来自水溶液的Zn-TRI-1144沉淀物是无定形的，而来自有机溶液的沉 淀物具有约10%的结晶。PLA/PLGA 优化聚合物链长和类型也被优化。总体而言，PLA比PLGA具有更长时间的持续释放，而 具有更长的链长度的聚合物具有更长时间的持续释放。这与聚合物降解和所述给药溶液的 溶液粘度成正比。在图33中，与采用PLGA2. 5A和PLGA3A的制剂相比，PLGA2A溶解于NMP 时的制剂具有更高的喷出，以及更少的持续释放时间。采用PLA-PEG 1500和PLGA-PEG 1500的原位形成凝胶还采用具有PEG 1500的PLA共聚物和具有PEG 1500的PLGA共聚物制备 Zn-TRI-1144的原位形成凝胶制剂。该理论为PEG 1500将使得聚合物变得更为亲水。这将 允许NMP的更快耗散，从而辅助凝胶的凝结(setting)。图34中所示的大鼠PK研究#的结 果显示了由采用PLA-PEG和PLGA-PEG 1500共聚物的原位形成凝胶一周内TRI-1144的零 级释放。这些制剂首次证明了 TRI-1144的一次/周给药制剂的可行性。亲水性溶剂优化尽管NMP是可被接受的皮下注射溶剂，目前在制剂研究中的NMP量高于一次/ 天给药和潜在的一次/周给药的药学可接受的限度。因此，基于使用PLA-PEG 1500和 PLGA-PEG 1500共聚物形成该原位形成凝胶的大鼠PK研究#553的结果，已设计了一系列研 究来优化其它具有能溶解PLA/PLGA聚合物的MP的亲水溶剂。大鼠PK研究#560和#561 的结果分别显示于图35和36，其显示了向PLA/PLGA稀释剂添加亲水溶剂可使该原位形成 凝胶更快凝结，从而维持TRI-1144的释放。对于所研究的溶剂，PEG400显示为所研究的最 佳溶剂(图 36，803-073-3 和 803-073-4)。PLGA 优化PLA 3L和PLGA 3A最初在研究中被用于优化所述溶剂系统，因为PLA3L和PLGA3A具有更好的持续释放。任何由于不同溶剂系统造成的TRI-1144的释放的差异将更易于 分辨。然而，PLA 3L在6个月内降解，而PLGA 3A在一个月内降解，两者均不适于TRI-1144 的一次/周给药。在大鼠PK研究#560和#561中优化的溶剂系统为包含以40 60% wt/ wt的比例溶解于NMP PEG400 (50 50)的PLA 3L/PLGA 3A的系统。能更快降解的聚合 物是必要的。图37显示了大鼠PK研究#585的结果。在该研究中，所述制剂含有溶解于 NMP PEG 1500 的 PLGA 1A、PLGA 2A 禾口 PLGA 2. 5A。用 PLGA IA 禾口 PLGA 2A 的原位形成凝 胶具有类似的结果，不适于TRI-1144的一次/周给药。用PLGA2. 5A的原位形成凝胶在一 周内具有假一级释放，其适于TRI-1144的一次/周给药。用单和双乳液的TRI-1144的持续释放制剂需要进行研究，以进一步确定其是否 适于TRI-1144的一次/周给药。肽的加载妨碍了微球体的正确形成。在进行体内分析时， 这些制剂导致了 TRI-1144的喷出，然后是TRI-1144的缓慢释放。这些制剂的体内释放特 征与TRI-1144立即释放的液体制剂相当。TRI-1144的一次/周给药的原型制剂可采用悬 浮在溶解于50 50NMP PEG400的50 50PLGA 2. 5A中的锌-TRI-1144沉淀物的原位 形成凝胶实现。该50 50PLGA 2. 5A将在注射位点保留两 周。该NMP PEG 400溶剂系 统在NMP的药学可接受的限度内。本发明所提供的特定实施方案为说明的目的进行了详细描述。结合该描述和说 明，本领域其它技术人员可采用现有技术容易地修改和/或调整所述实施方案以用于各种 应用，而不偏离所述基本概念，因此该修改和/或调整倾向于包含在附加权利要求的含义 和范围内。此处引用的各种参考文献，其公开在此全文通过引用并入本文。
权利要求
合成包含氨基酸序列SEQ ID NO9的肽的方法，所述方法包括缩合肽片段，所述肽片段包含选自SEQ ID NO58-77的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括缩合两个肽片段。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述肽片段包含氨基酸序列SEQIDN0:72和58;SEQ ID NO 70 和 59 ；SEQ ID NO 64 和 60 ；或者 SEQ ID NO 63 和 62。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述合成采用rink-负载CTC树脂、Sieber树脂、 Ramage树脂、Glu-负载CTC树脂或Glu37侧链负载树脂实施。
5.如权利要求1所述的方法，其进一步包括脱保护以在所述肽的N末端形成乙酰基基 团的步骤。
6.如权利要求1所述的方法，其进一步包括脱羧基以在所述肽的C末端形成酰胺基基 团的步骤。
7.如权利要求1所述的方法，其进一步包括脱保护以在所述肽的N末端形成乙酰基基 团的步骤；和脱羧基以在所述肽的C末端形成酰胺基基团的步骤。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述方法包括缩合三个肽片段。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述肽片段包含氨基酸序列SEQ10而72、74和20; SEQ ID NO :71、75 和 20 ；SEQ ID NO :70、76 和 20 ；或者 SEQ ID NO :68、77 和 20。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述合成采用rink-负载CTC树脂、Sieber树脂、 Ramage树脂、Glu-负载CTC树脂或Glu37侧链负载树脂实施。
11.如权利要求8所述的方法，其进一步包括脱保护以在所述肽的N末端形成乙酰基基 团的步骤。
12.如权利要求8所述的方法，其进一步包括脱羧基以在所述肽的C末端形成酰胺基基 团的步骤。
13.如权利要求8所述的方法，其进一步包括脱保护以在所述肽的N末端形成乙酰基基 团的步骤；以及脱羧基以在所述肽的C末端形成酰胺基基团的步骤。
14.合成包含SEQID NO :9的肽的方法，所述方法包括缩合肽片段，其中所述肽片段包 含氨基酸序歹Ij SEQ ID NO :72、74 和 19 ；SEQ ID NO :71、75 禾口 19 ；SEQ ID NO :70、76 禾口 19 ； 或者 SEQ ID NO :68、77 和 19。
15.如权利要求14所述的方法，其进一步包括在所述肽片段缩合前将包含氨基酸序列 SEQ ID NO: 19的肽片段与亮氨酸氨基酸残基共价偶联的步骤。
16.合成包含SEQID NO :9的肽的方法，所述方法包括缩合两个肽片段，其中所述肽片 段包含氨基酸序列SEQ ID N0:40和SEQ ID NO :20，所述合成采用rink-负载CTC树脂、 Sieber树脂或Glu-负载CTC树脂实施。
17.合成包含SEQID NO :9的肽的方法，所述方法包括采用rink树脂、修饰酸树脂、 rink-连接-负载CTC树脂或Y-谷氨酰基(Leu-酰胺基)-负载CTC树脂的线性固相合 成。
18.用于合成SEQID NO 9的肽片段组，包括选自如下的组(a)Ac-AA(1-26)-OH和 AA(27-37)-Rink-OH ；(b)Ac-AA(1-26)-OH 和 AA(27-38)-Rink-OH ；(c)Ac-AA(1-12)-OH,Fmoc-AA (13-26)-OH和 AA(27-37)-Rink-ΟΗ ；(d)Ac-AA(l-12)-0H,Fmoc-AA (13-26)-OH 和 AA (27-38)-Rink-OH ；或(e)Ac-AA(l-26)-0H和 H-AA (27-38) _NH2 游离 Glu37。
19.由氨基酸序列 SEQ ID NO :58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、 74、75、76或77组成的肽。
全文摘要
本发明提供了合成肽的方法。具体而言，本发明提供了合成治疗性抗病毒肽的方法。
文档编号C07K14/16GK101874038SQ200880117670
公开日2010年10月27日 申请日期2008年9月25日 优先权日2007年9月25日
发明者保罗·E·弗雷德里, 尼古莱·A·特韦摩耶斯, 布莱恩·L·布雷, 张虎翼, 斯蒂芬·E·施耐德, 芭芭拉·A·约翰斯顿 申请人:特里梅里斯公司