专利名称：含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质、转基因载体及制备方法
技术领域：
本发明涉及阳离子脂质、含阳离子脂质的转基因载体及其制备方法。 随着生物化学与分子生物学的不断发展，人们对核酸(DNA， RNA)功能的认识不断 加深，同时也对各种疾病的分子机理有了进一步的认识。在已知的人类疾病中有数千种疾 病是与基因相关的，其中包括与单基因相关的先天性遗传疾病和与多基因相关的后天性疾 病。大部分后天性疾病是各种内外因素作用于人体的遗传物质使其功能发生紊乱而造成 的。导致疾病的原因主要是基因缺陷和基因缺失，把适当的外源基因引入人体细胞内，以弥 补缺陷或缺失的基因，表达出相应的蛋白质，从根本上消除产生疾病症状的内在因素，由此 产生了一种新的治疗方法_基因治疗。 基因治疗的成功，关键是要把用于治疗的基因高效的地导入细胞内，然而裸基因 进入血清或细胞内会被血清内的网状内皮系统所吞噬或被细胞内的内涵体内的核酸酶降 解。另外单独用裸基因进行转染，基因难于被细胞吸收。因此，开发安全有效的基因转染载 体是基因治疗成功的前提条件。转基因载体包括病毒载体和非病毒载体，病毒载体尽管转 染效率高，但是存在免疫原性、致癌性、宿主基因插入整合等弊端，从而限制了它们的应用。 非病毒载体无免疫原性，便于大规模生产，但转染效率低于病毒载体。然而由于非病毒载体 所具有的优点使其成为一类非常具有开发潜力的转基因载体。 现在研究的非病毒载体中，阳离子脂质体是其中一种最具开发前景的载体之
一。本专禾U申请发明人的前其月石开究(A novel macrocyclic polyamine cationic lipid containing animidazolium salt group :Synthesis， characterization and its transfection activity as a genedelivery vector. Chem. Biol. Drug Des. ，2008，71(3):
224-229.)发现，含有咪唑嗡盐和大环多胺的化合物在一定的氮磷比(N/P)时对基因具有 很强的包裹浓縮能力，且有一定的转染能力，但细胞毒性较大。
发明内容
本发明的目的在于提供细胞毒性低、基因转染效率高的转基因载体，制备转基因 载体的阳离子脂质及其合成方法，以促进基因治疗的发展。 本发明所述阳离子脂质为含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质，其结构式如下
背景技术：
<formula>formula see original document page 4</formula>
上述结构式中，R为胆固醇基或皂素基，胆固醇基的结构式如下 皂素基的结构式如下
本发明所述转基因载体，为上述含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质、胆固醇和 去离子水形成的溶液，所述溶液中，含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质浓度为lmmo1/ L 4mmol/L，含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质与胆固醇的摩尔比为1 2 : 1。
本发明所述含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质的合成方法，按照下面的反应路
线合成
Boc、 /~\ ,N N
,O一R
N、H
Kl, DMSO, CHCI3
.O一R
、N N; Boc' V_7 Boc
O
CHCI3 or CH3CN
Boc、 /~\
、N
.O—R
TFA, CH2CI2
O一R
上述反应式中，R为胆固醇基或皂素基，胆固醇基的结构式如下 皂素基的结构式如下
说明化合物1为合成的目标化合物——含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子 脂质；化合物2为已知化合物，包括2a和2b， 2a为胆固醇氯乙酸酯(Cholesteryl chloroacetate) ， 2b为阜素氯乙酸酉旨(Diosgenin chloroacetata)，根据文献"Steroidal lariat ethers :a new class ofmacrocycles and the crystal structure of N_ (cholesteryloxycarbonyl) aza_15_crown_5. J. Org. Chem. 1987. 52 :2963-2968，， 合成； 化合物3由化合物2、咪唑、碘化钾合成，合成方法下面将进行描述；化合物4为l-对溴 甲基苯甲基-4，7，10-三(叔丁氧羰基)_1，4，7，10-四氮杂环十二烷(1-bromomethyl benzoyl-4， 7，10_tri (tert-butyloxycarbonyl)_1， 4， 7，10-tetraazacyclododecan)， 根据文献"Selective and efficient recognition of thymidylylthymidine(TpT)by bis(ZnII_cyclen)andthymidylylthymidylyl-thymidine(Tp Tp T)by tris(ZnII_cyclen) at neutral pH in aqueous solution. Chem. Eur. J. ， 1999， 11 :3113-3123，，合成；化合物5 由化合物3和化合物4合成，合成方法下面将进行描述。
(1)化合物3的合成 原料包括胆固醇氯乙酸酯或皂素氯乙酸酯、咪唑、碘化钾和溶剂，胆固醇氯乙酸酯
或皂素氯乙酸酯咪唑碘化钾=i : io 20 : o. os，所述比例为摩尔比，溶剂由二甲基 亚砜和无水氯仿组成，二甲基亚砜与无水氯仿的体积比为i : 4 6，溶剂的量以胆固醇氯
乙酸酯或皂素氯乙酸酯、咪唑和碘化钾三种物质能完全溶解为限；在室温、常压下将溶剂、
胆固醇氯乙酸酯或皂素氯乙酸酯、咪唑和碘化钾加入反应容器中并进行搅拌混合，待固体
物质完全溶解后加热至回流温度，维持此温度进行回流反应，反应时间4小时 6小时，反 应结束后冷却至室温，然后加入无水碳酸钾对反应液进行中和，无水碳酸钾的加入量以反 应液的pH = 7 8为限，继后收集反应液中的反应产物，即得到化合物3 ;
(2)化合物5的合成 原料包括步骤(1)得到的化合物3、l-对溴甲基苯甲基-4，7，10-三(叔丁氧羰 基)-1 ， 4， 7， 10-四氮杂环十二烷和溶剂，所述化合物3与1-对溴甲基苯甲基-4， 7， 10-三 (叔丁氧羰基)-l，4，7，10-四氮杂环十二烷的摩尔比为l : 1 2，溶剂为无水氯仿或无水 乙腈，所述化合物3和l-对溴甲基苯甲基-4，7，10-三(叔丁氧羰基)-l，4，7，10-四氮杂环
十二烷两种物质的总量与溶剂的配比为两种物质的总质量溶剂体积=i : 10 16，所
述两种物质的质量单位为克、溶剂的体积单位为毫升；在室温、常压下将溶剂、化合物3和 1-对溴甲基苯甲基-4， 7， 10-三(叔丁氧羰基)-1 ， 4， 7， 10-四氮杂环十二烷加入反应容器 中并进行搅拌混合，待固体物质完全溶解后加热至回流温度，维持此温度进行回流反应，反 应时间6小时 24小时，反应结束后旋干溶剂，通过柱层析分离、旋干洗脱剂、干燥即得到 化合物5 ; (3)含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质的合成 原料包括步骤(2)得到的化合物5、无水二氯甲烷和三氟醋酸，化合物5质量无
6水二氯甲烷体积=1 : 2 5，所述化合物5的质量单位为克、无水二氯甲烷的体积单位为 毫升，三氟醋酸与无水二氯甲烷的体积比为1 : 1 ;在室温、常压下将化合物5、无水二氯甲
烷加入反应容器中，当化合物5完全溶解后将反应容器置于ot:环境中，然后向反应液内滴
加三氟醋酸，三氟醋酸滴加完后，在搅拌下于室温、常压反应至少2小时，反应结束后蒸干 无水二氯甲烷和过量三氟醋酸，然后加甲醇溶解形成溶液，继后在搅拌下向所述甲醇溶液 中滴加无水乙醚使反应产物完全沉淀，经过滤、干燥即得到含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离 子脂质。 上述方法中，所述化合物3的合成时，收集反应液中的反应产物采用以下方式将 反应液过滤，将滤饼用氯仿洗涤至少1次，然后合并滤液和滤饼洗涤液，并对滤液和滤饼洗 涤液的混合液用自来水洗涤至少3次，继后分出有机相氯仿并将其用无水硫酸镁干燥，再 经过滤除去无水硫酸镁并将所获滤液通过蒸馏除去氯仿后干燥。 上述方法中，所述化合物5的合成时，柱层析分离所用洗脱剂由乙醇和二氯甲烷 组成，乙醇与二氯甲烷的体积比为1 : 12。 本发明所述转基因载体的制备方法，其原料包括上述含咪唑嗡盐和大环多胺的 阳离子脂质、胆固醇和无水氯仿，含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质与胆固醇摩尔比为 1 : l，含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质与胆固醇两种物质的总量与无水氯仿的配比
为两种物质的总质量无水氯仿体积=i : 40 100，所述两种物质的质量单位为克、无
水氯仿的体积单位为毫升；在室温、常压下将含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质、胆固醇
和无水氯仿加入反应容器中，当含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质、胆固醇完全溶解后， 旋干无水氯仿得到脂质体膜，将所述脂质体膜真空干燥去除残留的氯仿得到干燥的脂质体
膜，然后加入去离子水并搅拌至少3小时形成溶液，去离子水的加入量以溶液中权利要求1 所述含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质的浓度为lmmol/L 4mmol/L为限，将所述溶液 在4t:环境中放置8小时 12小时，再经-15°C -2(TC冷冻、4(rC 6(TC解冻至少4次后 于40°C 5(TC超声0. 5 1. 5小时即得到转基因载体，于4t:保存待用。
本发明具有以下有益效果 MTT法测试表明，本发明所述转基因载体具有非常低的细胞毒性。电泳实验表 明，本发明所述转基因载体与pEGFP-Nl质粒的复合物，当转基因载体中的阳离子脂质与 pEGFP-Nl质粒的质量比大于4 : l时，就能有效阻滞包裹pEGFP-Nl质粒，包裹能力较强，且 本发明所述转基因载体与pEGFP-Nl质粒的复合物平均粒径在80nm 120nm之间，Zeta电 位在10mv 40mv之间，非常适合于基因转染。进一步的体外转染实验表明，用本发明所述 转基因载体与pEGFP-Nl质粒形成的复合物转染A549细胞，在最佳转染条件下，其中一个转 基因载体T-lb的转染效率超过了市售转基因载体Lipofectamine2000。
图1是本发明所述转基因载体T-la、T-lb在A549细胞中的细胞毒性曲线。
图2是本发明所述转基因载体T-la与pEGFP-Nl质粒的复合物的电泳阻滞图片。
图3是本发明所述转基因载体T-lb与pEGFP-Nl质粒的复合物的电泳阻滞图片。
图4是本发明所述转基因载体T-la、 T_lb与pEGFP-Nl质粒的不同质量比复合物 的粒径曲线。
7
图5是本发明所述转基因载体T-la、 T_lb与pEGFP-Nl质粒的不同质量比复合物的Zeta电位曲线。 图6 (1)是本发明所述转基因载体T-la中阳离子脂质la与pEGFP-Nl质粒质量比
为8 : 1的复合物在A549细胞中的转染图片，图6(2)是图6(1)的明场图片。 图7(1)是本发明所述转基因载体T-lb中阳离子脂质lb与pEGFP-Nl质粒质量比
为8 : 1的复合物在A549细胞中的转染图片，图7(2)是图7(1)的明场图片。 图8(1)是转基因载体Lipofectamine 2000与pEGFP-Nl质粒质量比为8 : 1的
复合物在A549细胞中的转染图片，图8(2)是图S(l)的明场图片。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下实施例，凡基于本发明上述内容的技术方案均属于本发明的保护范围。 实施例1 :化合物3a的合成 化合物3a由化合物2a——胆固醇氯乙酸酯、咪唑、碘化钾合成，化合物3a结构式
如下
原料包括胆固醇氯乙酸酯、咪唑、碘化钾和溶齐U，胆固醇氯乙酸酯0. Olmol (4. 74g)，咪唑0. 2mo1 (13. 62g)，碘化钾0. 0005mol (0. 08g)，溶剂由二甲亚砜和无水氯仿组成，二甲亚砜10ml，无水氯仿60ml。在室温(25°C )、常压下将上述溶剂、胆固醇氯乙酸酯、咪唑和碘化钾加入反应容器中并进行搅拌混合，待固体物质完全溶解后加热至回流温度，维持此温度进行回流反应，反应时间4小时，反应结束后冷却至室温，然后加入无水碳酸钾2. 80g对反应液进行中和，调节反应液的pH = 7 8 ;继后将反应液过滤，将滤饼用氯仿10ml洗涤1次，合并滤液和滤饼洗涤液，并对滤液和滤饼洗涤液的混合液用自来水洗涤3次(每次洗水用量为50mL)，再后分出有机相氯仿并将其用无水硫酸镁干燥，再经过滤除去无水硫酸镁，将所获滤液通过蒸馏除去氯仿后放入烘箱中干燥(温度6(TC、时间3小时)即得到化合物3a 4. 4g，收率89X。 IR(KBr， cm—1) :1746， 1509， 1464， 1377， 1291，1216， 1078， 1003,662.力NMR(400MHz， CDC13， TMS) :S = 0. 67 (s， 3H， CH3in cholesterol),0. 85-2. 02 (m， 39H， cholesterol) ， 2. 34 (d， 2H， CH2) ， 4. 66 (m， 3H， C0CH2and OCH) ， 5. 37 (t， 1H，C = CH)， 6. 95(d，1H， imidazole-H)， 7. 10(d，1H， imidazole-H)， 7. 50(s，1H， imidazole-H)。HR-MS(ESI) :Calcd for :C32H5。N202 : 49 5 . 39 54[M+H]+ ;Found :495. 3951[M+H] + 。
实施例2 :化合物3b的合成 化合物3b由化合物2b——皂素氯乙酸酯、咪唑、碘化钾合成，化合物3b其结构式如下
原料包括皂素氯乙酸酯、咪唑、碘化钾和溶剂，皂素氯乙酸酯0.013mo1(6. 30g)，咪唑O. 13mol(9. lOg)，碘化钾0. 00065mol(0. 10g)，溶剂二甲亚砜和无水氯仿组成，二甲亚砜10ml，无水氯仿40ml。在室温(25°C )、常压下将上述溶剂、皂素氯乙酸酯、咪唑和碘化钾加入反应容器中并进行搅拌混合，待固体物质完全溶解后，加热至回流温度，维持此温度进行回流反应，反应时间6小时，反应结束后冷却至室温，然后加入无水碳酸钾3. OOg对反应液进行中和，调节反应液的pH = 7 8 ;继后将反应液过滤，将滤饼用氯仿10ml洗涤1次，合并滤液和滤饼洗涤液，并对滤液和滤饼洗涤液的混合液用自来水洗涤4次(每次洗水用量为50mL)，再后分出有机相氯仿并将其用无水硫酸镁干燥，再经过滤除去无水硫酸镁，将所获滤液通过蒸馏除去氯仿后放入烘箱中干燥(温度6(TC、时间3小时)即得到化合物3b 5.44g，收率80X。 IR(KBr， cm—1) :1746， 1509， 1464， 1377， 1291， 1216， 1078， 1003，662。 NMR(400MHz， CDC13， TMS) : S = 0.80， (s，6H， CH3) ， 0. 97-2. 00 (m， 28H， s即onin)，2. 34 (d， 2H， CH = C_CH2) ， 3. 35 (d， 1H， OCH2) ， 3. 45 (d， 1H， OCH2) ， 4. 41 (m， 1H， OCH) ， 4. 67 (m， 3H，COCH2and OCH)， 5. 37(t，1H， C = CH)， 6. 95(d，1H， imidazole-H)， 7. 10(d，1H， imidazole-H)，7.50(s，lH， imidazole-H) 。 HR-MS(ESI) :Calcd for :C32H46N204 :523. 3536[M+H] + ;Found :523. 3552[M+H]+。 实施例3 :化合物5a的合成 化合物5a由化合物3a和l-对溴甲基苯甲基-4，7，10-三(叔丁氧羰基)_1， 4， 7，
10-四氮杂环十二烷合成，化合物5a的结构式如下
Boc"" / 、Boc 原料包括实施例l制备的化合物3a、l-对溴甲基苯甲基-4，7，10-三(叔丁氧羰基)-1，4，7， 10-四氮杂环十二烷和溶剂无水乙腈，化合物3a 2. 00,1 (1. 04g) ， 1-对溴甲基苯甲基-4， 7， 10-三(叔丁氧羰基)-1， 4， 7， 10-四氮杂环十二烷3. 30,1 (2. 16g)，无水乙腈40mL。在室温(25tO、常压下将上述无水乙腈、化合物3a和l-对溴甲基苯甲基-4，7， 10-三(叔丁氧羰基)-1， 4， 7， 10-四氮杂环十二烷加入反应容器中并进行搅拌混合，待固体物质完全溶解后，加热至回流温度，维持此温度进行回流反应，反应时间8小时，反应结束后旋干溶剂，用乙醇、二氯甲烷组成的洗脱剂(乙醇与二氯甲烷的体积比为l : 12)进
9行柱层析分离，然后旋干洗脱剂、放入烘箱中干燥(温度6(TC、时间3小时)即得到泡沫状固体化合物5a 1.6g，收率70X。 IR(KBr， cm—1) :3424， 2940， 1748， 1690， 1564， 1461， 1415，1365， 12481164， 1106， 1027，978，859，772，625.力NMR(400MHz， CDC13， TMS) :S =o.67(s，3H， CH3 in cholesterol) ， 0. 85—2. 02 (m， 65H， cholesterol and 30C0C (CH3) 3) ， 2. 34 (d， 2H，CH2) ， 2. 37-2. 64 (m， 4H， CH2NCH2) ， 3. 30-3. 70 (m， 12H， NCH2CH2NCH2CH2NCH2CH2) ， 3. 73 (m， 2H，ArCH2) ， 4. 70 (m， 1H， 0CH) ， 5. 36-5. 38 (t， 3H， C = CH and ArCH2) ， 5. 48 (s， 2H， C0CH2) ， 7. 12 (d，1H， imidazole-H)，7. 32-7. 35(m，5H， imidazole-H and Ar)，10.85 (s，1H， imidazole-H) HR-MS(ESI) :Calcd for :C63H101BrN608 :1069. 7681 [M_Br]+ ;Found :1069. 7616[M_Br] + 。
实施例4 :化合物5b的合成 化合物5b由化合物3b和l-对溴甲基苯甲基-4，7，10-三(叔丁氧羰基)_1， 4， 7，
10-四氮杂环十二烷合成，化合物5b的结构式如下
<formula>formula see original document page 10</formula> 原料包括实施例2制备的化合物3b、l_对溴甲基苯甲基-4， 7， 10-三(叔丁氧羰基)-1， 4， 7， 10-四氮杂环十二烷和溶剂无水氯仿，化合物3b 2. OOmmol (1. 00g) ， 1-对溴甲基苯甲基-4， 7， 10-三(叔丁氧羰基)-1， 4， 7， 10-四氮杂环十二烷2. 30,1 (1. 50g)，无水氯仿40mL。在室温(25°C )、常压下将上述无水氯仿、化合物3b和1-对溴甲基苯甲基-4，7， 10-三(叔丁氧羰基)-1， 4， 7， 10-四氮杂环十二烷加入反应容器中并进行搅拌混合，待固体物质完全溶解后，加热至回流温度，维持此温度进行回流反应，反应时间20小时，反应结束后旋干溶剂，用乙醇、二氯甲烷组成的洗脱剂(乙醇与二氯甲烷的体积比为1 : 12)进行柱层析分离，然后旋干洗脱剂、放入烘箱中干燥(温度6(TC、时间3小时)即得到泡沫状固体化合物5b 1.7g，收率85X。 IR(KBr， cm—0 :3424， 2940， 1748， 1690， 1564， 1461，1415，1365，12481164，1106，1027，978，859，772，625.力NMR(400MHz， CDC13， TMS) :S =0. 78 (s， 6H， CH3) ， 0. 96—2. 00 (m， 57H， s即onin and30C0C (CH3) 3) ， 2. 37 (d， 2H， CH = C_CH2)，2. 51-2. 70 (m， 4H， CH2NCH2) ， 3. 30-3. 70 (m， 12H， NCH2CH2NCH2CH2NCH2CH2 and 0CH2) ， 3. 73 (m，2H， ArCH2) ， 4. 41 (m， 1H， 0CH) ， 4. 70 (m， 1H. 0CH) ， 5. 34-545 (t， 3H， C = CH and ArCH2) ， 5. 50 (s，2H， C0CH2) ，7. 12(d， 1H， imidazole—H) ， 7. 32—7. 35 (m， 5H， imidazole—H and Ar)，10.85(s，1H， imidazole-H). HR-MS (ESI) :Calcd for :C63H97BrN6010 :1097. 7266 [M-Br] + ;Found :1097.7002[M-Br]+。 实施例5 :阳离子脂质la的合成 阳离子脂质la由化合物5a、无水二氯甲烷和三氟醋酸合成，阳离子脂质la的结构
式如下
原料包括实施例3制备的化合物5a、无水二氯甲烷和三氟醋酸，化合物5a 1. 00g， (0.85mmol)，无水二氯甲烷2mL，三氟醋酸2mL。在室温(25°C )、常压下将化合物5a、无 水二氯甲烷加入反应容器中，当化合物5a完全溶解后将反应容器置于冰水浴中，然后向 反应液内滴加三氟醋酸，三氟醋酸滴加完后，在室温、常压下搅拌反应2. 5小时，反应结 束后蒸干无水二氯甲烷和过量三氟醋酸，然后加甲醇lmL溶解形成溶液，继后在搅拌下 向所述甲醇溶液中滴加无水乙醚使反应产物完全沉淀，经离心过滤、真空干燥(真空度 0. 095Mpa，干燥时间12小时，温度25°C )即得到含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质la 0.80g，收率80 %。 IR(KBr， cm—1) :3436， 2950， 2866， 1745， 1680， 1564， 1514， 1456， 1413， 1375， 1202， 1174， 1130， 831， 800， 721， 518.'H NMR(400MHz， CDC13， TMS) :S = 0.86(s，3H， CH3in cholesterol) ， 0. 89—2. 00 (m， 47H， cholesterol) ， 2. 34 (d， 2H， CH2) ， 2. 86—3. 15 (m， 14H， CH2NCH2CH2NCH2CH2NCH2CH2) ， 3. 73 (m， 2H， ArCH2) ， 4. 70 (m， 1H， 0CH) ， 5. 10 (m， 2H， ArCH2)， 5. 29-5. 34 (m， 3H， C = CH and C0CH2) ， 7. 33 (m， 4H， Ar) ， 7. 46 (d， 1H， imidazole—H) ， 7. 61 (d， 1H， imidazole-H) ，9. 48 (s， 1H， imidazole-H). HR-MS (ESI) :Calcdfor :C54H80BrF9N608 : 769. 6108[M-Br-3CF3C00H]+ ;Found :769. 4712 [M_Br-3CF3C00H] + 。
实施例6 :阳离子脂质lb的合成 阳离子脂质lb由化合物5b、无水二氯甲烷和三氟醋酸合成，阳离子脂质lb的结构
式如下
原料包括实施例4制备的化合物5b、无水二氯甲烷和三氟醋酸，化合物5b l.OOg， (0. 87mmol)，无水二氯甲烷3mL，三氟醋酸3mL。在室温(25°C )、常压下将化合物5b、无水 二氯甲烷加入反应容器中，当化合物5b完全溶解后将反应容器置于冰水浴中，然后向反应 液内滴加三氟醋酸，三氟醋酸滴加完后，在室温、常压下搅拌反应2小时，反应结束后蒸干 无水二氯甲烷和过量三氟醋酸，然后加甲醇lmL溶解形成溶液，继后在搅拌下向所述甲醇 溶液中滴加无水乙醚使反应产物完全沉淀，经离心过滤、真空干燥(真空度0. 095Mpa，干 燥时间12小时，温度25tO即得到含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质lb 0.89g，收率85%。 IR(KBr，cm—0 :3424,2940， 1748， 1690， 1564， 1461， 1415， 1365， 12481164， 1106， 1027， 978， 859， 772， 625.'H NMR (400MHz ， CDC13， TMS) :S =0.78(s，6H， CH3) ， 0. 96—2. 00 (m， 32H， saponin) ， 2. 37 (d， 2H， CH = C_CH2) ， 2. 89-3. 17 (m， 16H， CH2NCH2CH2NCH2CH2NCH2CH2and 0CH2)， 3. 50 (t， 2H， NCH2) ， 3. 64 (m， 2H， Ar) ， 4. 39 (m， 1H， 0CH) ， 4. 60 (m， 1H， OCH) ， 5. 15 (m， 2H， ArCH2)， 5. 30-5. 35 (m， 3H， C = CH andC0CH2) ， 7. 35 (m， 4H， Ar) ， 7. 47 (d， 1H， imidazole—H) ， 7. 65 (d， 1H， imidazole-H) ，9. 54(s， 1H， imidazole-H) HR-MS (ESI) :Calcd for :C53H74BrF9N6010 : 797. 5693[M-Br-3CF3C00H]+ ;Found :797. 3882[M_Br-3CF3C00H] + 。
实施例7 :含阳离子脂质la的转基因载体(简称T-la)的制备
原料包括实施例5制备的含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质la、胆固醇和无水 氯仿，阳离子脂质la 0. Olmmol (0. 0077g)，胆固醇0. Olmmol (0. 0039g)，无水氯仿0. 5mL。在 室温(25°C )、常压下将所述阳离子脂质la、胆固醇和无水氯仿加入反应容器中，当阳离子 脂质la、胆固醇完全溶解后，用旋转蒸发仪(转速为60r/min)旋干得到脂质体膜，再经真空 干燥(真空度0. 095Mpa，干燥时间12小时，温度25°C )去除残留氯仿得到干燥脂质体膜， 以上述阳离子脂质la的摩尔量(0. Olmmol)计算，向此干燥脂质体膜加入去离子水2. 5mL 配成含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质4mmol/L的溶液，搅拌3小时，继后将所配制的溶 液在4t:冰箱内放置12小时，再经冰盐浴冷冻固化、水浴6(TC解冻液化5次，最后在功率为 100兆、水浴温度为50°C的超声波水浴中超声0. 5小时即得到含阳离子脂质la的转基因载 体T-la，放置于4t:冰箱内保存备用。 实施例8 :含阳离子脂质lb的转基因载体(简称T-lb)的制备 原料包括实施例6制备的含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质lb、胆固醇和无水
氯仿，阳离子脂质lb 0. Olmmol (0. 0079g)，胆固醇0. Olmmol (0. 0039g)，无水氯仿lmL。在室
温(25°C )、常压下将所述阳离子脂质lb、胆固醇和无水氯仿加入反应容器中，当阳离子脂
质lb、胆固醇完全溶解后，用旋转蒸发仪(转速为60r/min)旋干得到脂质体膜，再经真空
干燥(真空度0. 095Mpa，干燥时间12小时，温度25°C )去除残留氯仿得到干燥脂质体膜，
以上述阳离子脂质lb的摩尔量(0. Olmmol)计算，向此干燥脂质体膜加入去离子水2. 5mL
配成含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质4mmol/L的溶液，搅拌3小时，继后将所配制的溶
液在4t:冰箱内放置8小时，再经冰盐浴冷冻固化、水浴4(TC解冻液化6次，最后在功率为
100兆、水浴温度为4(TC的超声波水浴中超声1. 5小时即得到含阳离子脂质lb的转基因载
体T-lb，放置于4t:冰箱内保存备用。 实施例9 :转基因载体的细胞毒性实验 1材料和方法 1. 1材料和仪器 转基因载体T-la、 T-lb :由上述实施例7、实施例8制备。 MTT :购于美国Sigma公司，使用时用PBS配制成5mg/mL溶液，pH值7. 4，经 0. 22iim滤膜过滤。 A549和293细胞株来源于美国ATCC。 Bio RAD model 550酶标仪美国Bio-RAD公司生产。 1640培养基美国Gibico公司生产 DMEM培养基美国Gibico公司生产
12
C02培养箱法国JOUAN公司生产。 细胞培养板美国Corning公司生产。 溶剂DMSO :美国Sigma公司生产。 胰酶美国Amresco公司生产。 PBS缓冲由国产分析纯试剂配制为HI值7. 4 1. 2方法 将上述实施例7制备的转基因载体T-la用含抗生素1640完全培养基(青霉素 100IU/mL+链霉素lOOmg/mL)稀释为含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质la25 y g/mL、 50 u g/mL、75u g/mL、100u g/mL、125u g/mL、150u g/mL、175u g/mL、200u g/mL的不同浓度 的溶液； 将上述实施例8制备的转基因载体T-lb用含抗生素1640完全培养基(青霉素 100IU/mL+链霉素lOOmg/mL)稀释为含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质lb25 y g/mL、 50 u g/mL、75u g/mL、100u g/mL、125u g/mL、150u g/mL、175u g/mL、200u g/mL的不同浓度 的溶液。 用胰酶消化收取对数生长期A549细胞株，调整细胞数量约为每孔1. 5X 104个在 96孔细胞培养板上培养。37°C、5% C02条件下培养约24h，使细胞生长至70% _80%汇合 度，弃孔内原有培养基，用缓冲液PBS (PH值7. 4)洗1 2次，在每孔中分别加入含不同浓度 咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质la、lb的转基因载体溶液T-la、T-lb 100yL，每个浓度 梯度设置四个平行孔；采用不含转基因载体T-la、 T-lb的含抗生素1640培养基100 y L作 为对照，考察其在上述实验条件下的细胞毒性。在37°C、5% C02条件下继续培养24h后用 缓冲液PBS(ra值7. 4)洗涤1 2次，再向每孔加入100 ii L无血清无抗生素1640培养基 [含20iiL MTT溶液(5ng/mL in PBS，pH 7. 4)]，孵育4h，移除培养基。生成的蓝紫色结晶 用150iiL匿SO溶解。在吸收波长490nm处用酶标仪测定溶液吸光值。转基因载体T-la、 T-lb组细胞与对照组细胞的相对存活率按下式计算
[A]test/[A]control X100 上式中，[A] test为测试孔的吸光值，[A]control为对照孔的吸光值。
2实验结果和讨论 实验结果见图1，由图1可见，当本发明所述转基因载体T-la、T-lb中含咪唑嗡盐
和大环多胺的阳离子脂质la、 lb的浓度接近200 g/mL时，细胞存活率可达40%以上，因此
本发明所述转基因载体的细胞毒性非常低，具有潜在开发价值。 实施例10 :转基因载体与pEGFP-Nl质粒复合物的凝胶电泳实验 l材料和方法 1. 1材料和仪器 转基因载体T-la、 T-lb :由上述实施例7、实施例8制备。 pEGFP-Nl质粒购于美国Clontech公司 琼脂糖美国Amor公司生产。 TAE缓冲液由分析纯化学试剂配制。 电泳仪美国Bio-RAD公司生产。 凝胶成像系统(GelDoc 2000):美国BIO-RAD公司生产。
染料Goldview :上海赛百盛基因技术有限公司生产。
葡萄糖溶液太极集团西南药业股份有限公司生产。
1.2方法 1. 2. 1转基因载体T-la、 T-lb与pEGFP-Nl质粒复合物的制备
取IO个EP管标记为1号 IO号，在标记为1号 5号的EP管中分别加入转基因 载体T-la中阳离子脂质la与pEGFP-Nl质粒的质量比为1 : 1、2 : 1、4 : 1、6 : 1、8 : 1 的转基因载体T-la并用葡萄糖溶液(0. 36mM/L)定容至50ul。在标记为6号 10号的EP 管中分别加入转基因载体T-lb中阳离子脂质lb与pEGFP-Nl质粒的质量比为l : 1、2 : 1、 4 : 1、6 : 1、8 : l的转基因载体T-lb并用葡萄糖溶液(O. 36mM/L)定容至50ul。另取一 个EP管标记为11号，加入含有100 iig pEGFP-Nl质粒的溶液，并用葡萄糖定容至500ul， 轻柔吹打混匀，然后从11号管分别取50ul pEGFP-Nl质粒的溶液依次加入上述10个EP管 中，于液面处轻柔吹打3次混匀，所得到的100ul脂质体与pEGFP-Nl质粒的复合物溶液4°C 孵育过夜。 1. 2. 2琼脂糖凝胶的制备 将0. 40g琼脂糖加入到100mL锥形瓶中，再加入40mLTAE缓冲液，加热使琼脂糖 颗粒完全溶解，得无色透明液体。冷却至5(TC-e(TC，按照染料Goldview : TAE缓冲液二 1 : 20(体积比)的用量加入染料Goldview，混匀后缓慢倒入带有梳子并事先调节为水平 的制胶槽中。室温静置，待凝胶完全凝固后小心拔出梳子，并将带有凝胶的制胶槽放入电泳 槽中，加入TEA缓冲液，TEA缓冲液的量以没过胶面lmm为宜，令样品孔自然充满TEA缓冲 液。 1. 2. 3阳离子脂质转基因载体与pEGFP-Nl质粒复合物的电泳实验 分别取上述制备的转基因载体T-la、 T-lb与pEGFP-Nl质粒的复合物(装于标记
为1号 10号的EP管)和pEGFP-Nl质粒空白对照10ul与1. 67ul 6xloading buffer混
匀加入凝胶上的加样孔内。盖上电泳槽，室温(25°C )下100V电压电泳约30min后停止，取
出凝胶在凝胶成像系统中曝光后采图。 2实验结果和讨论 实验结果见图2和图3。由图2可见，当转基因载体T-la中阳离子脂质la与 pEGFP-Nl质粒的质量比为4 : 1时，部分pEGFP-Nl质粒滞留在加样孔，部分pEGFP-Nl质粒 由负极向阳极移动，表明阳离子脂质转基因载体T-la能部分包裹pEGFP-Nl质粒，当转基因 载体T-la中阳离子脂质la与pEGFP-Nl质粒的质量比为6 : 1时，pEGFP-Nl质粒全部被 滞留，表明转基因载体T-la能全部包裹pEGFP-Nl质粒。 由图3可见，当转基因载体T-lb中阳离子脂质lb与pEGFP-Nl质粒的质量比为 4 : 1时，部分pEGFP-Nl质粒滞留在加样孔，部分pEGFP-Nl质粒由负极向阳极移动，表明 阳离子脂质转基因载体T-lb能部分包裹pEGFP-Nl质粒，当转基因载体T-lb中阳离子脂质 lb与pEGFP-Nl质粒的质量比为6 : 1时，pEGFP-Nl质粒全部被滞留，表明转基因载体T-Ib 能全部包裹pEGFP-Nl质粒。 实施例11 :转基因载体与pEGFP-Nl质粒复合物的的粒径和Zeta电位实验
l材料和方法
1. l材料和仪器
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转基因载体T-la、 T-lb :由上述实施例7、实施例8制备。 pEGFP-Nl质粒购于美国Clontech公司。 葡萄糖溶液太极集团西南药业股份有限公司生产。 纳米粒度及电位分析仪(ZEN 3600) :Malvern Inc公司生产。 1.2方法 1. 2. 1转基因载体T-la、T-lb与pEGFP-Nl质粒复合物的制备
取IO个EP管标记为1号 IO号，在标记为1号 5号的EP管中分别加入转基因 载体T-la中阳离子脂质la与pEGFP-Nl质粒的质量比为1 : 1、2 : 1、4 : 1、6 : 1、8 : 1 的转基因载体T-la并用葡萄糖溶液(0. 36mM/L)定容至50ul。在标记为6号 10号的EP 管中分别加入转基因载体T-lb中阳离子脂质lb与pEGFP-Nl质粒的质量比为l : 1、2 : 1、 4 : 1、6 : 1、8 : l的转基因载体T-lb并用葡萄糖溶液(O. 36mM/L)定容至50ul。另取一 个EP管标记为11号，加入含有100 ii gpEGFP-Nl质粒的溶液，并用葡萄糖定容至500ul，轻 柔吹打混匀，然后从11号管分别取50ulpEGFP-Nl质粒的溶液依次加入上述10个EP管中， 于液面处轻柔吹打3次混匀，所得到的100ul脂质体与pEGFP-Nl质粒的复合物溶液4t:孵 育过夜。 1. 2. 2转基因载体与pEGFP-Nl质粒复合物的粒径和电位实验 将上述转基因载体T-la、 T-lb与pEGFP-Nl质粒的复合物分别用葡萄糖溶液
(0. 36mM/L)定溶至lmL。用纳米粒度及电位分析仪测其粒径和Zeta电位。 2实验结果和讨论 实验结果见图4和图5。由图4可见，转基因载体T-la与pEGFP-Nl质粒的复合 物在转基因载体T-la阳离子脂质la与pEGFP-Nl质粒的质量比为l : l时，粒径较大，约 320nm，当T-la阳离子脂质la与pEGFP-Nl质粒的质量比为8 : 1和10 : 1时，粒径较小， 约为100nm ;而转基因载体T-lb与pEGFP-Nl质粒的复合物在转基因载体T-lb阳离子脂质 lb与pEGFP-Nl质粒的质量比为4 : l时，粒径最大，约570nm，当阳离子脂质lb与pEGFP-Nl 质粒的质量比为10 : 1时粒径较小，约为200nm ;需要说明的是，因为纳米粒度分析仪测定 粒径受干扰因素影响很大，因此不能用来衡量复合物粒径的绝对大小。
由图5可见，转基因载体T-la、T-lb与pEGFP-Nl质粒的复合物在阳离子脂质转基 因载体T-la、T-lb中阳离子脂质la、lb与pEGFP-Nl质粒的质量比为l : 1时，电位为负值， 而当阳离子脂质la、lb与pEGFP-Nl质粒的质量比为4 : 1以上时，电位都在20mV 30mV 之间，此时因为复合物带正电荷，有利于转染过程中复合物与细胞壁的静电结合靠近，增加 复合物进入细胞的几率。 实施例12 :转基因载体的体外基因转染实验
l材料和方法
1. l材料和仪器 转基因载体T-la、 T-lb :由上述实施例7、实施例8制备。 pEGFP-Nl质粒购于美国Clontech公司 A549细胞株来源于ATCC。 PBS缓冲由国产分析纯试剂配制。 1640培养基GIBICO公司生产。
DMEM培养基GIBIC0公司生产
胰酶美国Amresco公司生产转基因载体Lipofectamine 2000 :美国invitrogen公司生产 细胞培养板美国Corning公司生产。 倒置荧光显微镜日本Olympus公司生产。 EndoFree Plasmid Kit :TIANGEN公司生产。 C02培养箱法国J0UAN公司生产。 生物安全柜法国JOUAN公司生产。 1.2方法 1. 2. 1转基因载体与pEGFP-Nl质粒复合物的制备 取4个EP管标记为1号 4号，在标记为1号 2号的EP管中分别加入转基因 载体T-la中阳离子脂质la与pEGFP-Nl质粒的质量比为6 : 1、8 : 1的转基因载体T_la 并用无血清无抗生素的新鲜1640培养基定容至100ul。在标记为3号 4号的EP管中分 别加入转基因载体T-lb中阳离子脂质lb与pEGFP-Nl质粒的质量比为6 : 1、8 : 1的转 基因载体T-lb并用无血清无抗生素的新鲜1640培养基定容至100ul。另取一个EP管标 记为5号，加入含有32ugpEGFP-Nl质粒的溶液，并用无血清无抗生素的新鲜1640培养基定 容至400ul，轻柔吹打混匀，然后从5号管分别取100ulpEGFP-Nl质粒的溶液依次加入上述 4个EP管中，于液面处轻柔吹打3次混匀，所得到的200ul脂质体与pEGFP-Nl质粒的复合 物溶液室温孵育20分钟备用。 1. 2. 2转基因载体与pEGFP-Nl质粒复合物的体外转染实验 用胰酶消化收取对数生长期A549细胞株，调整细胞数量约为每孔7. OX 104 8. OX 104个在24孔细胞培养板上培养。37°C、5 % C02条件下培养约24h，使细胞生长至 70% _80%汇合度，弃孔内原有培养基，用PBS洗1 2次，分别加入上述4管中复合物溶 液lOOul，使每种材料与pEGFP-Nl质粒同质量比的处理组均有两个复孔，再补充不含血清 及抗生素的新鲜1640培养基使每孔内的总体系为250ul。 37°C、5% C02条件下继续孵育4h 后弃转染用培养基，用PBS洗涤1 2次重新加入含有10%血清的新鲜1640培养基在相同 条件下培养24h，其后取出细胞板在倒置荧光显微镜下观察EGFP蛋白的表达情况，并采图。
按照上述实施例12中1. 2. 1的方法制备转基因载体Lipofectamine2000 与pEGFP-Nl质粒的复合物，按照上述实施例12中1. 2. 2的方法将转基因载体 Lipofectamine2000与pEGFP-Nl质粒的复合物在A549细胞中进行体外转染实验。
2实验结果和讨论 实验结果见图6、图7和图8。由图6和图8可见，转基因载体T-la与pEGFP-Nl 质粒的复合物在阳离子脂质la与pEGFP-Nl质粒的质量比为8 : 1时，在A549细胞中有明 显转染效果，但转染效率低于Lipofectamine2000 ;而由图7和图8可见，转基因载体T-lb 与pEGFP-Nl质粒的复合物在阳离子脂质lb与pEGFP-Nl质粒的质量比为8 : 1时，在A549 细胞中转染非常明显，转染效率高于Lipofectamine2000，并且如实施例9所述，转基因载 体T-lb细胞毒性很低，因此本发明提供了一种高效低毒的转基因载体。
权利要求
含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质，其特征在于所述阳离子脂质的结构式如下上述结构式中，R为胆固醇基或皂素基，胆固醇基的结构式如下皂素基的结构式如下F2009102164626C0000011.tif,F2009102164626C0000012.tif,F2009102164626C0000013.tif
2. 转基因载体，其特征在于该转基因载体为由权利要求1所述含咪唑嗡盐和大环多胺 的阳离子脂质、胆固醇和去离子水形成的溶液，所述溶液中，权利要求1所述含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质摩尔浓度为lmmol/L 4mmol/L，权利要求1所述含咪唑嗡盐和大环 多胺的阳离子脂质与胆固醇的摩尔比为1 2 : 1。
3. 权利要求1所述含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质的合成方法，其特征在于合成 步骤如下(1) 化合物3的合成原料包括胆固醇氯乙酸酯或皂素氯乙酸酯、咪唑、碘化钾和溶剂，胆固醇氯乙酸酯或皂素氯乙酸酯咪唑碘化钾=i : io 20 : o. os，所述比例为摩尔比，溶剂由二甲亚砜和 无水氯仿组成，二甲亚砜与无水氯仿的体积比为i : 4 6，溶剂的量以胆固醇氯乙酸酯或 皂素氯乙酸酯、咪唑和碘化钾三种物质能完全溶解为限；在室温、常压下将溶剂、胆固醇氯乙酸酯或皂素氯乙酸酯、咪唑和碘化钾加入反应容器 中并进行搅拌混合，待固体物质完全溶解后加热至回流温度，维持此温度进行回流反应，反应时间4小时 6小时，反应结束后冷却至室温，然后加入无水碳酸钾对反应液进行中和， 无水碳酸钾的加入量以反应液的pH = 7 8为限，继后收集反应液中的反应产物，即得到 化合物3 ;(2) 化合物5的合成原料包括步骤(1)得到的化合物3、l-对溴甲基苯甲基-4，7，10-三(叔丁氧羰基)-l， 4， 7， 10-四氮杂环十二烷和溶剂，所述化合物3与1-对溴甲基苯甲基-4， 7， 10-三(叔丁氧 羰基)-l，4，7，10-四氮杂环十二烷的摩尔比为1 : 1 2，溶剂为无水氯仿或无水乙腈，所述化合物3和1-对溴甲基苯甲基-4， 7， 10-三(叔丁氧羰基)-1 ， 4， 7， 10-四氮杂环十二烷两种物质的总量与溶剂的配比为两种物质的总质量溶剂体积=i : 10 16，所述两种物质的质量单位为克、溶剂的体积单位为毫升；在室温、常压下将溶剂、化合物3和1-对溴甲基苯甲基-4， 7， 10-三(叔丁氧羰基)-1 ， 4， 7， 10-四氮杂环十二烷加入反应容器中并进行搅拌混合，待固体物质完全溶解后加热至 回流温度，维持此温度进行回流反应，反应时间6小时 24小时，反应结束后旋干溶剂，通 过柱层析分离、旋干洗脱剂、干燥即得到化合物5 ;(3)含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质的合成原料包括步骤(2)得到的化合物5、无水二氯甲烷和三氟醋酸，化合物5质量无水二 氯甲烷体积=1 : 2 5，所述化合物5的质量单位为克、无水二氯甲烷的体积单位为毫升， 三氟醋酸与无水二氯甲烷的体积比为1:1;在室温、常压下将化合物5、无水二氯甲烷加入反应容器中，当化合物5完全溶解后将反应容器置于ot:环境中，然后向反应液内滴加三氟醋酸，三氟醋酸滴加完后，在搅拌下于室温、常压反应至少2小时，反应结束后蒸干无水二氯甲烷和过量三氟醋酸，然后加甲醇溶 解形成溶液，继后在搅拌下向所述甲醇溶液中滴加无水乙醚使反应产物完全沉淀，经过滤、 干燥即得到含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质。
4. 根据权利要求3所述的含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质的合成方法，其特征在 于化合物3的合成时，收集反应液中的反应产物采用以下方式将反应液过滤，将滤饼用氯 仿洗涤至少1次，然后合并滤液和滤饼洗涤液，并对滤液和滤饼洗涤液的混合液用自来水 洗涤至少3次，继后分出有机相氯仿并将其用无水硫酸镁干燥，再经过滤除去无水硫酸镁 并将所获滤液通过蒸馏除去氯仿后干燥。
5. 根据权利要求3或4所述的含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质的合成方法，其特 征在于化合物5的合成时，柱层析分离所用洗脱剂由乙醇和二氯甲烷组成，乙醇与二氯甲 烷的体积比为1 : 12。
6. 权利要求2所述转基因载体的制备方法，其特征在于原料包括权利要求1所述含咪 唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质、胆固醇和无水氯仿，权利要求1所述含咪唑嗡盐和大环 多胺的阳离子脂质与胆固醇摩尔比为l : l，权利要求l所述含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质与胆固醇两种物质的总量与无水氯仿的配比为两种物质的总质量无水氯仿体积=1 : 40 100，所述两种物质的质量单位为克、无水氯仿的体积单位为毫升；在室温、常压下将权利要求i所述含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质、胆固醇和无 水氯仿加入反应容器中，当权利要求i所述含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质、胆固醇 完全溶解后，旋干无水氯仿得到脂质体膜，将所述脂质体膜真空干燥去除残留的氯仿得到干燥的脂质体膜，然后加入去离子水并搅拌至少3小时形成溶液，去离子水的加入量以溶 液中权利要求1所述含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质的浓度为lmmol/L 4mmol/L为 限，将所述溶液在4。C环境中放置8小时 12小时，再经-15°C -20"冷冻、40" 60°C 解冻至少4次后于40°C 5(TC超声0. 5 1. 5小时即得到权利要求2所述转基因载体。
全文摘要
本发明提供的含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质，其结构式如下上述结构式中，R为胆固醇基或皂素基。以含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质、胆固醇和去离子水制备转基因载体，所述转基因载体中，含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质摩尔浓度为1mmol/L～4mmol/L，所述含咪唑嗡盐和大环多胺的阳离子脂质与胆固醇的摩尔比为1～2∶1。
文档编号C07J71/00GK101732730SQ20091021646
公开日2010年6月16日 申请日期2009年12月1日 优先权日2009年12月1日
发明者余孝其, 朱文, 黄清东 申请人:四川大学