专利名称：：一种枸杞中提取绿原酸的方法
技术领域：
：本发明涉及一种绿原酸提取技术，具体地说是涉及一种从枸杞中提取绿原酸的方法。
背景技术：
：绿原酸(chlorogenicacid)是植物体在有氧呼吸过程中合成的一种苯丙素类物质，分子式为C16H18O9，分子量为345.30。它是许多中草药如金银花、杜仲、茵陈等的主要有效成分之一，也是众多水果蔬菜中的重要活性成分。绿原酸具有清除自由基、抗菌消炎、抗病毒、降糖、降脂、保肝利胆等多种功效，尤其近年来发现绿原酸类物质有抗癌、抗艾滋病的作用，可做为先导设计开发抗癌、抗艾滋病药物。同时，作为良好的抗氧化剂，绿原酸不仅应用于医药行业上，在日用化工、食品等领域都有广泛的应用。目前绿原酸大多以金银花、杜仲叶为原料进行提取，而以枸杞为原料提取绿原酸在国内还未见报道。
发明内容本发明的目的是提供一种以企业生产下脚料——枸杞果渣为原料，提取枸杞绿原酸的方法。本发明一种枸杞中提取绿原酸的方法通过下述技术方案予以实现本发明一种枸杞中提取绿原酸的方法包括如下步骤1)枸杞果前处理步骤枸杞子首先置烘箱进行干燥，取出后放入干燥室中静置24h，粉碎后置普通回流装置中回流脱脂，滤出溶剂，残渣风干备用。2)提取枸杞多糖步骤以乙醇为溶剂，采用超声波辅助法，提取液经过浓缩、醇沉、干燥，得到枸杞多糖粗粉；其工艺条件为乙醇体积分数为60%，料液比为130，提取时间为60min，提取次数为3次。3)提取枸杞绿原酸步骤提取枸杞多糖后的残渣，以乙醇为溶剂，超声波辅助法提取枸杞中绿原酸，大孔树脂对所提取绿原酸进行分离纯化，反相高效液相色谱对枸杞中绿原酸进行分析；其工艺条件为乙醇体积分数为55%85%，料液比为125140，溶液的PH值为35，提取时间为301IOmin，提取次数为24次。本发明一种枸杞中提取绿原酸的方法与现有技术相比较有如下有益效果本发明是以企业生产下脚料一枸杞果渣为原料，从枸杞中提取绿原酸的方法，提取成本低、时间短，延长了枸杞产业链，提高了枸杞产品的附加值，并且实现了原料的优化配置。本发明采用超声波提取可以产生强烈振动、高加速度、强烈空化作用及搅拌作用，用于溶剂辅助提取时，可以加速绿原酸进入溶剂，从而缩短提取时间、节约溶剂，避免高温导致绿原酸分解。本发明从枸杞中提取绿原酸为相关企业开发生产预防和治疗肿瘤、降低血糖、保肝利胆等作用的药品和保健食品提供了优质生产原料。绿原酸还具有增香和护色的作用，可用于食品保鲜，也可用在多种保健食品及饮料中。本发明一种枸杞中提取绿原酸的方法有如下附图图1为本发明一种枸杞中提取绿原酸方法工艺流程图；图2为本发明一种枸杞中提取绿原酸的方法绿原酸对照品曲线图；图3为本发明一种枸杞中提取绿原酸的方法提取物绿原酸曲线图；图4为本发明一种枸杞中提取绿原酸的方法乙醇体积分数对绿原酸得率的影响曲线图；图5为本发明一种枸杞中提取绿原酸的方法料液比对绿原酸得率的影响曲线图；图6为本发明一种枸杞中提取绿原酸的方法提取时间对绿原酸得率的影响曲线图；图7为本发明一种枸杞中提取绿原酸的方法提取次数对绿原酸得率的影响曲线图；图8为本发明一种枸杞中提取绿原酸的方法pH值对绿原酸得率的影响曲线图具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明一种枸杞中提取绿原酸的方法技术方案作进一步描述。如图1所示，本发明一种枸杞中提取绿原酸的方法包括如下步骤1)枸杞果前处理步骤枸杞子首先置烘箱进行干燥，取出后放入干燥室中静置24h，粉碎后置普通回流装置中回流脱脂，滤出溶剂，残渣风干备用。2)提取枸杞多糖步骤以乙醇为溶剂，采用超声波辅助法，提取液经过浓缩、醇沉、干燥，得到枸杞多糖粗粉；其工艺条件为乙醇体积分数为60%，料液比为130，提取时间为60min，提取次数为3次。3)提取枸杞绿原酸步骤提取枸杞多糖后的残渣，以乙醇为溶剂，超声波辅助法提取枸杞中绿原酸，大孔树脂对所提取绿原酸进行分离纯化，反相高效液相色谱对枸杞中绿原酸进行分析；其工艺条件为乙醇体积分数为55%85%，料液比为125140，溶液的PH值为35，提取时间为301IOmin，提取次数为24次。所述的提取绿原酸工艺条件为乙醇体积分数为74%，料液比为135，溶液的PH值为4.2，提取时间为70min，提取次数为3次。所述枸杞多糖粗品的提取是经超声提取后的混合液，离心分离后，残渣继续用适当浓度乙醇溶液进行多次超声提取，过滤，合并滤液。滤液经浓缩、醇沉、洗涤后，即得枸杞多糖粗品；其工艺条件为乙醇体积分数为60%，料液比为130，提取时间为60min，提取次数为3次。实施例1。1)枸杞果前处理步骤枸杞子首先置烘箱进行干燥，取出后放入干燥室中静置24h，粉碎后置普通回流装置中回流脱脂，滤出溶剂，残渣风干备用。2)提取枸杞多糖步骤以乙醇为溶剂，采用超声波辅助法，提取液经过浓缩、醇沉、干燥，得到枸杞多糖粗粉；其工艺条件为乙醇体积分数为50%，料液比为120，提取时间为50分钟，提取次数为2次；3)提取枸杞绿原酸步骤提取枸杞多糖后的残渣，以乙醇为溶剂，超声波辅助法提取枸杞中绿原酸，大孔树脂对所提取绿原酸进行分离纯化，反相高效液相色谱对枸杞中绿原酸进行分析；其工艺条件为乙醇体积分数为55%，料液比为125，溶液的pH值为3，提取时间为30min，提取次数为2次。本实施例的绿原酸得率为58.4%。实施例2。1)枸杞果前处理步骤枸杞子首先置烘箱进行干燥，取出后放入干燥室中静置24h，粉碎后置普通回流装置中回流脱脂，滤出溶剂，残渣风干备用。2)提取枸杞多糖步骤以乙醇为溶剂，采用超声波辅助法，提取液经过浓缩、醇沉、干燥，得到枸杞多糖粗粉；其工艺条件为乙醇体积分数为60%，料液比为130，提取时间为60min，提取次数为3次。3)提取枸杞绿原酸步骤提取枸杞多糖后的残渣，以乙醇为溶剂，超声波辅助法提取枸杞中绿原酸，大孔树脂对所提取绿原酸进行分离纯化，反相高效液相色谱对枸杞中绿原酸进行分析；其工艺条件为乙醇体积分数为74%，料液比为135，提取次数为3次，提取时间为70min，溶液的pH值为4.2。本实施例的绿原酸得率为71.3%。实施例3。1)枸杞果前处理步骤枸杞子首先置烘箱进行干燥，取出后放入干燥室中静置24h，粉碎后置普通回流装置中回流脱脂，滤出溶剂，残渣风干备用。2)提取枸杞多糖步骤以乙醇为溶剂，采用超声波辅助法，提取液经过浓缩、醇沉、干燥，得到枸杞多糖粗粉；其工艺条件为乙醇体积分数为70%，料液比为140，提取时间为70分钟，提取次数为4次；3)提取枸杞绿原酸步骤提取枸杞多糖后的残渣，以乙醇为溶剂，超声波辅助法提取枸杞中绿原酸，大孔树脂对所提取绿原酸进行分离纯化，反相高效液相色谱对枸杞中绿原酸进行分析；其工艺条件为乙醇体积分数为85%，料液比为140，溶液的pH值为5，提取时间为110分钟，提取次数为4次；本实施例的得率为62.3%。1、本发明的工艺过程分为两大部分。枸杞子首先置烘箱进行干燥，取出后放入干燥室中静置24h，粉碎后置普通回流装置中回流脱脂，滤出溶剂，残渣风干备用。第一部分，以乙醇为溶剂，采用超声波辅助法，提取液经过浓缩、醇沉、干燥，得到枸杞多糖粗粉。第二部分，对于提取枸杞多糖后的残渣，以适宜浓度的乙醇为溶剂，超声波辅助法提取枸杞中绿原酸，大孔树脂对所提取绿原酸进行分离纯化，反相高效液相色谱对枸杞中绿原酸进行分析。工艺流程如图1所示。2、操作要点1)鲜果的采收及干制待枸杞子成熟8成至9成(红色)，严禁采收青果、黄果、霉果、病果；采摘时要轻采、轻拿、轻放、树上采静、地上拣静。采后的鲜果运到加工场所，倒入专用筛中，浸入已配好的脱蜡冷浸液中浸泡30秒，提起控干后，倒入专用果栈上，每果栈约15公斤，均勻铺平，厚度2-3厘米。2)枸杞的干燥及粉碎干制工艺结束，枸杞大部分水分已基本除去。将干制的枸杞置烘箱进行干燥，取出后放入干燥室中静置24h，粉碎后回流脱脂，滤出溶剂，残渣风干备用。3)超声波提取由于绿原酸结构中有酯键、不饱和双键及多元酚等不稳定因素，在提取过程中，因水解和分子内酯基迁移易发生异构化。因此提取时应避免高温、强光及长时间加热。超声波可以产生强烈振动、高加速度、强烈空化作用及搅拌作用，因此用于溶剂辅助提取时，可以加速绿原酸进入溶剂，从而缩短提取时间、节约溶剂，避免高温导致绿原酸分解。4)绿原酸的分离纯化与检测经超声波提取后的混合液，用PK-121R离心机高速(4000转/min)离心分离，得上清液。选择LS-45、LS-300、NKA-9、LS-303、XDA-5五种大孔树脂对上清液中的绿原酸进行纯化，以绿原酸质量分数为标准进行判断。应用反相高效液相色谱对经大孔树脂纯化的绿原酸进行检测。5)枸杞多糖粗品的提取经超声提取后的混合液，离心分离后，残渣继续用适当浓度乙醇溶液进行多次超声提取，过滤，合并滤液。滤液经浓缩、醇沉、洗涤后，即得枸杞多糖粗品。3、绿原酸含量的测定3.1.1色谱条件色谱柱KromasilC18柱(25(kimX4.6mm,7μm)；柱温25"C；流动相V(乙腈)V(0.4%磷酸水溶液)=1288；流速=ImL·mirT1；检测波长:327歷。3.1.2标准曲线的制备精密称取绿原酸对照品适量，置棕色容量瓶中，加50%甲醇制成每ImL含35.8μg的对照品溶液，精密吸取对照品溶液2，4，6，10，14，18μL，分别注入液相色谱仪。按上述色谱条件测定峰面积，以峰面积积分值(A)对进样量进行回归，得回归曲线方程Y=2468.4Χ-16.205，r=0.9996。结果表明，绿原酸在0.07160.6444μg与峰面积呈良好的线性关系。3.1.3样品溶液含量测定精密吸取样品溶液ImL置IOOmL容量瓶中，蒸馏水定容，摇勻，过0.45μm微孔滤膜，精密吸取续滤液10μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件用峰面积外标法计算样品中绿原酸的含量。3.2稳定性试验精密吸取同一供试溶液5μL，0，4，9，12，15h测定，峰面积积分值RSD为0.68%。3.3精密度试验精密吸取绿原酸对照品溶液10μL，分别重复进样5次。峰面积积分值RSD平均为0.55%。3.4重复性试验取同一样品5份，分别按含量测定项的方法测定，记录绿原酸分面积积分值，RSD为0.95%。3.5加样回收率分别取5份20%乙醇洗脱液样品约0.IOg,分别精密加入绿原酸对照品，按照样品测定方法测定，平均回收率为97.16%，RSD为1.34%。绿原酸对照品回归曲线图如图2所示，本发明提取物绿原酸回归曲线图如图3所示4、工艺参数的筛选4.1枸杞中绿原酸的提取本项目采用超声波法对枸杞中绿原酸进行提取，在提取过程中，分别对各影响因素进行筛选，对影响较大的因素进行试验，确定出提取最佳因素水平组合。4.1.1提取单因素试验超声波提取法提取目标产物时，确定5个单因素为乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取次数、PH。试验因素水平表见表4-1。表4-1试验因素水平表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>4.1.2响应面分析试验根据Box-Benhnken中心组和试验设计原理，采用三因素三水平的响应面分析方法，根据单因素试验结果选取因素水平。试验因素水平设计见表4-2。表4-2试验因素水平表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>4.2提取单因素试验结果4.2.1乙醇体积分数对绿原酸得率的影响如图4所示，乙醇体积分数增大，绿原酸的得率也增大。这与所提取物质的结构有关。乙醇体积分数增大，提取物的溶解性增大。因此，得率随乙醇体积分数的增大而增加；但是当乙醇体积分数过高时，枸杞色素等其它组分也大量溶出，另一方面也增加了成本，并为乙醇回收带来困难，综合考虑乙醇体积分数以70%左右较好。4.2.2料液比对绿原酸得率的影响如图5所示，料液比对绿原酸得率有影响。当料液比小于135时，绿原酸得率增加较快，当料液比大于135时，得率有所下降。这可能是由于溶剂添加量增大，有效成分在由固体组织向外扩散的过程中，浓度梯度增大，扩散速率提高，有利于提高得率。当料液比兆国最佳值时，得率的下降可能与绿原酸的分解有关，因此选择料液比为135适宜。4.2.3提取时间对绿原酸得率的影响如图6所示，不同提取时间对绿原酸得率影响不大。这是由于超临界提取，能够使细胞在很短的时间内破碎，溶剂能迅速渗透到细胞内部，而且绿原酸这种有机酸能够快速达到溶解平衡，因此提取时间较短。延长提取时间并不能明显增加绿原酸得率。因此，提取时间选择70min为宜。4.2.4提取次数对绿原酸得率的影响如图7所示，提取次数为13次时，绿原酸得率增加迅速，当提取次数大于4次时，绿原酸得率反而降低，其原因之一可能是提取液体积较大时，浓缩时受热时间长，使绿原酸破坏；原因之二可能是提取次数多时，提取出的水溶性物质较多，加乙醇时形成的沉淀多，由于沉淀对绿原酸的吸附而使其损失。为了节约溶剂、节省浓缩时间，采用2次提取适且。4.2.5pH对绿原酸得率的影响如图8所示，pH值的变化对绿原酸的提取影响很大，这与绿原酸本身为一种有机酸有关。酸性条件有利于绿原酸的提出，碱性条件下一部分绿原酸可能发生电离、水解，导致绿原酸的得率下降。溶液的PH值约为4时，绿原酸得率最高。4.3响应面试验结果与分析4.3.1试验结果选取乙醇体积分数、提取次数、pH，以绿原酸得率为响应值Y，试验设计与结果见表4-3。其中112是析因试验，1315是中心试验，用来估计实验误差。表4-3试验设计与结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>4.3.2回归方程乙醇体积分数(Xl)、提取次数(Χ2)、ρΗ(Χ3)对绿原酸得率影响的曲面拟合方程为Y=O.78-0.024875*Χ1+0.004125*Χ2_0.02375*Χ3_0.069875*Χ1*Χ1+0.00675*Χ1*Χ2+0.019*Χ1*Χ3-0.106375*Χ2*Χ2-0.042*Χ2*Χ3-0.098125*Χ3*Χ3由回归方程得出，在所选的各因素水平范围内，按照对结果的影响排序Χ2>Χ3>Χ1，即提取次数>11>乙醇体积分数。经SAS软件运行得出，最佳工艺参数是乙醇体积分数为74%，提取次数为3次，ρΗ为4.2。权利要求一种枸杞中提取绿原酸的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤1)枸杞果前处理步骤枸杞子首先置烘箱进行干燥，取出后放入干燥室中静置24h，粉碎后置普通回流装置中回流脱脂，滤出溶剂，残渣风干备用。2)提取枸杞多糖步骤以乙醇为溶剂，采用超声波辅助法，提取液经过浓缩、醇沉、干燥，得到枸杞多糖粗粉；其工艺条件为乙醇体积分数为60％，料液比为1∶30，提取时间为60min，提取次数为3次。3)提取枸杞绿原酸步骤提取枸杞多糖后的残渣，以乙醇为溶剂，超声波辅助法提取枸杞中绿原酸，大孔树脂对所提取绿原酸进行分离纯化，反相高效液相色谱对枸杞中绿原酸进行分析；其工艺条件为乙醇体积分数为55％～85％，料液比为1∶25～1∶40，溶液的pH值为3～5，提取时间为30～110min，提取次数为2～4次。2.根据权利要求1所述的枸杞中提取绿原酸的方法，其特征在于，所述的提取绿原酸工艺条件为乙醇体积分数为74%，料液比为135，提取次数为3次，提取时间为70min，溶液的PH值为4.2。全文摘要本发明涉及一种绿原酸提取技术，具体地说是涉及一种从枸杞中提取绿原酸的方法。本发明一种枸杞中提取绿原酸的方法包括如下步骤1)枸杞果前处理步骤；2)提取枸杞多糖步骤；3)提取枸杞绿原酸步骤。本发明方法有如下有益效果本发明是以企业生产下脚料——枸杞果渣为原料，从枸杞中提取绿原酸的方法，提取成本低、时间短，延长了枸杞产业链，提高了枸杞产品的附加值，并且实现了原料的优化配置。本发明采用超声波提取可以产生强烈振动、高加速度、强烈空化作用及搅拌作用，用于溶剂辅助提取时，可以加速绿原酸进入溶剂，从而缩短提取时间、节约溶剂，避免高温导致绿原酸分解。本发明从枸杞中提取绿原酸为相关企业开发生产预防和治疗肿瘤、降低血糖、保肝利胆等作用的药品和保健食品提供了优质生产原料。绿原酸还具有增香和护色的作用，可用于食品保鲜，也可用在多种保健食品及饮料中。文档编号C07C67/56GK101817749SQ20091021629公开日2010年9月1日申请日期2009年11月18日优先权日2009年11月18日发明者任蓓蕾,何剑生,刘洪智,山永凯,年璟远,张辉,才仁扎西,李宁,李树志,杨莉华,薛萍,马宁安申请人:青海青美生物资源研究开发有限公司