专利名称：蛇毒细胞毒素-ctx1在制备具有镇痛作用药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及蛇毒细胞毒素-CTX1在制备具有镇痛作用药中的应用，具体涉及蛇毒细胞毒素-CTX1在制备对伤害性刺激导致的躯体痛、内脏痛以及对吗啡成瘾后疼痛具有镇痛作用的药中的应用。
背景技术：
蛇毒是一个巨大的生物资源宝库。自1968年英国科学家首先研制成功了治疗血管闭塞性疾病的蛇毒制剂-ARIN，投放市场后不久即获得了巨大的经济回报。近十年来，随着多达数十种蛇毒药品的面世，并且取得了不俗的临床疗效和销售业绩，从蛇毒中开发出价廉、物美的特效药正在成为各国生物学家、药学家及制药企业争相追逐的新热点。
舟山眼镜蛇(Naja atra Cantor)，以颈部背面有白色眼镜架状斑纹为其最明显的特征，体长可达2米，主要分布于我国长江以南诸省及台湾等地。舟山眼镜蛇所分泌的蛇毒液中含有多种神经毒素(neurotoxin，NT)及细胞毒素(Cytotoxin，CTX)，由于CTX对多种组织细胞膜均有较强的破坏共性，尤其对心肌细胞更为显著，故又称为膜毒素(Membrane toxin)或心脏毒素(cardiotoxin)。从我国大陆及台湾产舟山眼镜蛇毒中至少已分离出了5～7种不同的CTX，均由60～63个氨基酸残基组成，相对分子质量为6000～7000kDa。
二十世纪70年代以来，蛇毒中有效单体-NT在镇痛的基础研究方面已有较多报道，其镇痛机制可能与胆碱能、内源性阿片肽等多种系统有关。与传统镇痛药物吗啡相比，NT的镇痛具有用量少、止痛时间长、无成瘾性等特点，对顽固性疼痛、神经性疼痛和恶性肿瘤痛均有效。但鉴于NT的神经毒性较大，致死活性较强，其的安全性一直有较大争议。
1975年，Hayashi首次报道了从台湾眼镜蛇毒Naja naja atra中纯化出一种CTX，是一种强碱性多肽毒素pI 9.0，相对分子质量为6693kDa，有60个氨基酸残基LKCNKLIPIA SKTCPAGKNL CYKMFMMSDL TIPVKRGCIDVCPKNSLLVK YVCCNTDRCN，并命名为CTX1；进一步研究发现泰国眼镜蛇(Naja naja siamensis)毒中亦含此毒素。目前CTX1是否有镇痛的功能，至今未见相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供蛇毒细胞毒素-CTX1在制备具有镇痛作用药中的应用，该细胞毒素-CTX1对伤害性刺激导致的躯体痛、内脏痛及吗啡成瘾后疼痛均有较好的镇痛作用，将其开发为新的镇痛药具有较好的应用前景。
实际上，本发明蛇毒细胞毒素-CTX1在制备具有镇痛作用药中的应用。
优选的，本发明所述的应用是指在制备对伤害性刺激导致的躯体痛具有镇痛作用药的应用。
优选的，本发明所述的应用是指在制备对伤害性刺激导致的内脏痛具有镇痛作用药的应用。
优选的，本发明所述的应用是指在制备对吗啡成瘾后疼痛具有镇痛作用药的应用。
本发明所述的蛇毒细胞毒素-CTX1通过中国大陆舟山眼镜蛇蛇毒的分离和纯化获得，其具体过程为 (1)凝胶过滤采用Sephacryl S-100HR填料，将舟山眼镜蛇毒样本通过AKTA explorer 100快速纯化工艺开拓系统进行分子筛过滤，获得I、II、III三个毒性组分，分别用G-50预装柱HiPrep 26/10Desaltin脱盐，冻干，备用； (2)离子交换将步骤(1)所得三个毒性组分根据毒性强弱初筛，选取毒性最强的组分III，采用CM Sepharose FF填料，通过AKTA explorer 100快速纯化工艺开拓系统进行离子交换，获得单一毒性的多肽CTX1，并用G-50预装柱HiPrep 26/10Desaltin脱盐，冻干即可。
本发明的有益效果是 (1)该蛇毒细胞毒素CTX1对各种急、慢性疼痛的具有良好的镇痛作用，尤其是CTX1对伤害性刺激导致的躯体痛(somatalgia)、内脏痛(visceral pain)及吗啡成瘾后疼痛(疼痛症状群)均有较强镇痛作用。
(2)由于CTX1分子中并不存在类似于内源性阿片肽的氨基酸序列(TGGP)片断，对吗啡成瘾的动物不但能发挥较强的镇痛效应，并且连续用药12天亦未见成瘾、耐受现象，故将其开发为新的镇痛药有较好的应用前景。
图1是CTX1在CM Sepharose FF离子交换色谱图； 图2是质谱分析法(MALDI-TOF)测定CTX1的质谱图。
具体实施例方式 以下实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容均可实现本发明的目的。
第一部分蛇毒细胞毒素-CTX1的制备及其分子量和氨基酸序列的测定 1.1蛇毒细胞毒素-CTX1的制备 从大陆舟山眼镜蛇自然野生分布优势区域之一的湛江地区野外采集舟山眼镜蛇毒样本，进行以下分离和纯化得到CTX1 (1)凝胶过滤采用Sephacryl S-100HR填料，将舟山眼镜蛇毒样本通过AKTA explorer 100快速纯化工艺开拓系统(制备型高效液相色谱仪)进行分子筛过滤，获得I、II、III三个毒性组分，分别用G-50预装柱HiPrep 26/10 Desaltin脱盐，冻干，备用； 其中柱规格为26×100mm，先用0.05M pH6.4磷酸缓冲液两个柱体积平衡凝胶柱，蛇毒样品溶液通过AKTA explorer-100色谱仪的上样泵上样，泵速为0.6ml/min，洗脱泵速0.6ml/min，紫外检测波长280nm，每管收集量6ml/min。
(2)离子交换将步骤(1)所得三个毒性组分通过初筛，选取毒性最强的组分III，采用CM Sepharose FF填料，通过AKTA explorer 100快速纯化工艺开拓系统进行离子交换，获得单一毒性的多肽CTX1，并用G-50预装柱HiPrep 26/10Desaltin脱盐，冻干即可。
其中，柱规格26×100mm，先用0.05M pH6.4磷酸缓冲液两个柱体积平衡凝胶柱，组分III100mg样品溶液通过AKTA explorer-100色谱仪的上样泵上样，泵速为0.8ml/min，用1000mL含0.5mol/L NaCl的0.02mol/L pH为8.0的PBS和1000mL0.02mol/L pH为8.0的PBS进行梯度洗脱，洗脱泵速0.8ml/min，紫外检测波长280nm，每管收集量8ml/min，获得CTX1的色谱图如附图1所示。
1.2蛇毒细胞毒素-CTX1的分子量及氨基酸序列的测定 用质谱分析法(MALDI-TOF)测定CTX1的分子量为6697.915kDa，其质谱图如附图2所示； 用埃德曼降解法(Edman degradation)测定CTX1的氨基酸序列为LKCNKLIPIA SKTCPAGKNL CYKMFMMSDL TIPVKRGCID VCPKNSLLVKYVCCNTDRCN。
与从台湾舟山眼镜蛇毒中纯化出的CTX1相比，来源于大陆湛江地区舟山眼镜蛇毒CTX1的分子质量有约3kDa的差异，二者的氨基酸序列一致。
第二部分蛇毒细胞毒素-CTX1的镇痛作用 实施例1 本实施例通过醋酸扭体法测试CTX1对小鼠的因伤害性刺激导致的内脏痛的镇痛作用。
动物经腹腔注射醋酸溶液后，可以模拟腹腔炎症引起的腹腔内脏痛症状，常用于新镇痛药物的筛选。通过观察药物处理组与对照组扭体症状的差别，可以确定该药物是否具有镇痛效应以及其剂量-效应曲线。
取小鼠(体重20-25g，雌雄均可)经腹腔注射不同剂量CTX1(实验组)、吗啡(阳性对照组)或生理盐水(阴性对照组)，30min后，各组动物再经腹腔注射0.1ml 0.6％的醋酸(acetic acid)溶液。醋酸溶液处理后，小鼠分别置于玻璃烧杯内使其适用5min，然后观察10min，记录该时段出现典型扭体症状的次数，为了便于记录，腹部和后肢因刺激而伸展一次定义为一次扭体反应。
表1醋酸扭体法测试CTX1对小鼠的镇痛作用
备注*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，与控制组相比较。
如上表1所示的实验结果表明提前30min应用CTX1，高(0.4mg/kg)、中(0.2mg/kg)、低(0.1mg/kg)3个剂量组对醋酸所致小鼠扭体次数与生理盐水对照组比较明显减少，具有显著差异(p＜0.01～0.001)，剂量-效应关系明显，该结果提示CTX1对醋酸所致小鼠内脏疼痛有明显抑制作用。
以上药理学实验研究表明，CTX1对伤害性刺激导致的内脏痛(visceral pain)有较强镇痛作用，在治疗疼痛方面有新用途。
实施例2 本实施例通过热板法测试CTX1对大鼠的因伤害性刺激导致的躯体痛及吗啡成瘾后疼痛(疼痛症状群)的镇痛作用。
热板法是镇痛药物筛选，检测中常用的一种方法，也是一种能确定区分中枢神经和末梢神经镇痛机理的方法，有较宽的使用范围，小鼠受热刺激后可出现舔后足或缩爪等典型躯体痛觉反应。测定热痛反应潜伏期的长短(s)，与动物的痛阈变化相一致。
取正常及吗啡成瘾后大鼠(雄性，体重180～220g)放置于UGO痛觉测试仪的金属热板(表面温度为55±0.5℃)上，开始记时，直至大鼠舔后足或缩爪，停止记时，这段时间为该只大鼠的潜伏期。实验中，给药前先测定大鼠基础潜伏期，潜伏期大于30s则淘汰。各组大鼠在实验中不同阶段测定给药后潜伏期，为了避免大鼠后足被烫伤，确定55s为中断时。
表2热板法测试CTX1对大鼠的镇痛作用(x±s)
备注*p＜0.05，**p＜0.01，与控制组相比较。
如上表2所示的实验结果表明强效镇痛药吗啡及CTX1(0.2mg/kg)均可显著提高痛阈，延长热痛反应时间，该结果提示CTX1对伤害性热刺激所致的躯体痛有明显的抑制作用。
以上药理学实验研究表明，CTX1对伤害性刺激导致的躯体痛(omatalgia)及吗啡成瘾后疼痛(疼痛症状群)均有较强镇痛作用，在治疗疼痛方面有新用途。
由于CTX1分子中并不存在类似于内源性阿片肽的氨基酸序列(TGGP)片断，对吗啡成瘾的动物不但能发挥较强的镇痛效应，并且连续用药12天亦未见成瘾、耐受现象，故将其开发为新的镇痛药有较好的应用前景。
实施例3 本实施例通过机械刺激法测试CTX1因大鼠对吗啡成瘾引起疼痛的镇痛作用。
机械刺激机械缩腿阈值(paw withdrawal threshold，PWT)测定参照文献报道的“Up-Down”法，将大鼠置于金属网上，盖以透明的有机玻璃罩。首先让大鼠适应环境15min，待大鼠梳理和探究活动基本消失后，用一系列标准化的vonFrey测试探针刺激大鼠神经损伤侧后肢足底中部，使其弯曲成S形，持续6～8S，观察缩足反应，大鼠在刺激时间内或在移开vonFrey针时立即出现快速的缩足反应，记为阳性反应，而身体活动引起的缩足反应不记做阳性反应。直至找到该鼠出现50％测量10次至少有连续5次缩足)缩足反应的探针，记录其压力值(g)，此值即为该鼠损伤侧的缩腿阈值。
表3CTX1不同剂量对吗啡成瘾大鼠痛域的影响(％)(x±s)
备注*p＜0.05，**p＜0.01，与吗啡成瘾前相比较 如上表3所示的实验结果表明各组大鼠给药前痛域无明显差异(P＞0.05)，吗啡组与CTX1各剂量组在连续8天吗啡位置偏爱训练后，大鼠对吗啡成瘾后第10～18天，吗啡组大鼠在痛觉测试仪上抬脚时间缩短，痛觉敏化，对痛觉反应强；而CTX1各组对吗啡成瘾大鼠痛觉敏化有较强的镇痛作用，有一定的剂量依赖性，连续8天给药后镇痛作用显著，CTX1(0.4mg/kg)增长到244.8±17.5％，CTX1(0.2mg/kg)也增长到249.5±37.1％，CTX1(0.1mg/kg)增加到168.9±15.5％，与N.S组比较明显增加(P＜0.05)与大鼠成瘾给CTX1处理前相比有显著性差异(P＜0.01)，以吗啡成瘾后第一天痛域值为100观察其余各天痛域的增加百分值。发现CTX1(0.2mg/kg)和CTX1(0.4mg/kg)组吗啡成瘾后痛敏的镇痛作用比CTX1(0.1mg/kg)强(p＜0.05)，但二者镇痛作用组间差异性不大.在停止给CTX1后，CTX1镇痛作用降低。但CTX1(0.4mg/kg)降低幅度较小说明剂量较大时镇痛维持效果好。结果表明CTX1对于吗啡成瘾后痛觉过敏有良好的镇痛作用，对于长期吸毒的患者在刚戒毒时出现痛觉过敏较强不能自持而去寻药有良好的控制作用。
以上实施例表明蛇毒细胞毒素-CTX1具有镇痛作用，即该细胞毒素-CTX1对伤害性刺激导致的躯体痛、内脏痛及吗啡成瘾后疼痛均有较强的镇痛作用，且连续用药12天未见成瘾、耐受现象，将其开发为新的镇痛药具有较好的应用前景。
权利要求
1.蛇毒细胞毒素-CTX1在制备具有镇痛作用药中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用是指在制备对伤害性刺激导致的躯体痛具有镇痛作用药中的应用。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用是指在制备对伤害性刺激导致的内脏痛具有镇痛作用药中的应用。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用是指在制备对吗啡成瘾后疼痛具有镇痛作用药中的应用。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的蛇毒细胞毒素-CTX1通过中国大陆舟山眼镜蛇蛇毒的分离和纯化获得，其具体过程为
(1)凝胶过滤采用Sephacryl S-100HR填料，将舟山眼镜蛇毒样本通过AKTA explorer 100快速纯化工艺开拓系统进行分子筛过滤，获得I、II、III三个毒性组分，分别用G-50预装柱HiPrep 26/10 Desaltin脱盐，冻干，备用；
(2)离子交换将步骤(1)所得三个毒性组分根据毒性强弱初筛，选取毒性最强的组分III，采用CM Sepharose FF填料，通过AKTA explorer 100快速纯化工艺开拓系统进行离子交换，获得单一毒性的多肽CTX1，并用G-50预装柱HiPrep 26/10 Desaltin脱盐，冻干即可。
全文摘要
本发明公开了蛇毒细胞毒素-CTX1在制备具有镇痛作用药中的应用，尤其是蛇毒细胞毒素-CTX1在制备对伤害性刺激导致的躯体痛、内脏痛以及对吗啡成瘾后疼痛具有镇痛作用的药中的应用，该细胞毒素-CTX1对伤害性刺激导致的躯体痛、内脏痛及吗啡成瘾后疼痛均有较好的镇痛作用，且连续用药12天未见成瘾、耐受现象，将其开发为新的镇痛药具有较好的应用前景。
文档编号C07K1/36GK101757610SQ200910215379
公开日2010年6月30日 申请日期2009年12月23日 优先权日2009年7月29日
发明者刘先国, 孔天翰, 信文君, 仲维高, 崔跃, 董伟华, 黄绍, 崔超伟, 唐娅 申请人:中山大学