专利名称：军曹鱼免疫球蛋白μ链的基因序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种蛋白编码序列，尤其是涉及一种军曹鱼免疫球蛋白μ链的 基因序列。
背景技术：
免疫球蛋白属体内的多功能免疫球蛋白，也是再次免疫应答的主要抗体，主要以 分泌形式存在于血液和其它体液中介导体液免疫。Ig单体包括两条相同的分子量较大的 重链和两条相同的分子量较小的轻链，重链(heavy chain, H链)和轻链(light chain, L 链)是由不同染色体上的多基因座编码。其生物学活性是特异性结合抗原或通过重链C区 介导一系列生物学效应，包括中和毒素作用、亲和细胞而导致吞噬调理作用、胞外杀伤及免 疫炎症、介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)激活补体途径等。随着海水养殖业的发展，病害问题日趋严重，虽然利用一些药物取得了一定的防 治效果，但是长期的施药不仅会导致水体的污染，也会造成诸多耐药性病原体的产生，为进 一步的防治工作变得更为复杂。因此从鱼体自身入手，提高鱼体免疫力是病害防治的趋势。 特异性防御机制在水生动物防止感染中扮演重要角色，鱼类免疫系统尤其是体液免疫系统 承担着相当部分的工作，受到国内外学者的广泛关注。其中免疫球蛋白，又是鱼类特异性体 液免疫应答中最主要的介质。因此，对鱼类免疫球蛋白的研究理所当然地成为鱼类免疫学 研究的重点和热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种军曹鱼免疫球蛋白μ链的基因序列。本发明通过以近源物种免疫球蛋白μ链基因的CDS序列的保守区设计的兼并引 物，并用PCR法扩增，结合RACE技术克隆到军曹鱼免疫球蛋白μ链基因的全表达序列；通 过对免疫球蛋白(IgM)基因设计有效地鉴定引物，从而可以通过荧光定量来分析该基因的 表达水平和组织分布情况。军曹鱼免疫球蛋白μ链基因具有DNA核苷酸及相应的氨基酸 序列为AGCTCATCAGTTTGACCATAAACC S TTTTCTGTAGCTCTGCTGCTGCTGTTGGCAGCT 62MFSVALLLLLAAGGATCCTGTGTGAAGTGTCAACAGTTGACACAGCCAGCCTCTGTGACTGTGCAGCCAGGT 122GSCVKCQQLTQPASVTVQPGCAACGTCTGACCATCACCTGTCAGGTCTTTTATTCTGTTAGCAGCTACGCAACAGCTTGG 182QRLTlTCQVFYSVSSYATAffATCAGACAGCCTGCAGGGAAAAGACTGGAGTGGATTGGAATTGCACGTGTTGGATACACC 242IRQPAGKRLEffIGIARVGYTTCATACTACAAAGATTCACTGAAGCACAAGTTCAGTATCGACTTAGACTCTTCCAACAAC 302SYYKDSLKHKFSIDLDSSNN
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图1是不同的时间点免疫球蛋白μ基因在心脏中的表达；图2是不同的时间点免疫球蛋白μ基因在肝脏中的表达；图3是不同的时间点免疫球蛋白μ基因在脾脏中的表达；图4是不同的时间点免疫球蛋白μ基因在鳃中的表达图5是不同的时间点免疫球蛋白μ基因在胃中的表达；图6是不同的时间点免疫球蛋白μ基因在肾脏中的表达；图7是不同的时间点免疫球蛋白μ基因在头肾中的表达；图8是不同的时间点免疫球蛋白μ基因在肠中的表达；图9是不同的时间点免疫球蛋白μ基因在脑中的表达。
具体实施例方式1.总RNA的提取取健康的军曹鱼(体重约IOOOg)在养殖桶中养殖3日后，腹腔注射Iml的鲨鱼弧 菌(JT2)。刺激192h后，解剖鱼体取出头肾约250mg，放入-80°C冰箱备用。取备用组织约 IOOmg用剪刀剪碎加入Iml的Trizol (美国invitrogen公司)进行勻浆，按照试剂盒说明 提取总RNA。2. cDNA第一链的合成取军曹鱼总RNA5yg与反转录引物(oligodT接头引物)1 μ 1 (lOpmol/L)混合， 65°C加热5min后，立即放置冰上静置2min，然后加入5Xbuffer，IOmmol/LdNTP混合液， Ribonuclease Inhibitor，M-MLV 反转录酶，反应体系为 20 μ 1。反应程序为 37°C、60min，最后放入-80°C保存备用。oligodT 接头引物5，-GGCCACGCGACTAGTAC (T) 16_3，。3.引物设计依据，引物合成的方法使用构建的Smart cDNA文库扩增cDAN片断，用设计的中间片断引物UF和UR进行PCR扩增，扩增片段大小约为602bp。引物设计后提交上海英骏生物技术有限公司进行 DNA合成。引物 UF 5，-GGAAAGGAACAATGGTTACAG-3，引物 UR 5，-ATCACCGTTGCTCGTTTT-3，4.对军曹鱼免疫球蛋白μ链基因cDNA全序列的克隆使用构建的Smart cDNA文库扩增cDAN片断，用设计的中间片断引物UF和UR进 行PCR扩增，扩增片段大小约为602bp。以上述合成的第一链cDNA作为模板，用设计的中间片断引物进行PCR扩增，反应 体系为IOx Buffer2. 5μ L, 10mmol/L dNTP 0· 5 μ L，10nmol/L 引物 UF 和 UR各 0· 5 μ L，Taq 酶0. 25 μ L，用PCR水将反应体系补充至25 μ L。反应条件为1个循环，94°C变性3min ；35 个循环94°C变性35s，55°C退火45s，72°C延伸Imin ； 1个循环，72°C延伸IOmin ；4°C保温。 所扩增的PCR产物用1 %的琼脂糖凝胶电泳进行检测，拿未纯化的PCR液由上海英骏生物技 术有限公司进行双向测序。 根据已得到的cDNA片段序列设计特异性引物R5UF。利用cDNA末端快速扩增技术 (Rapid Amplification of cDNA ends, RACE)对目的基因的 3'和 5'末端进行 PCR 扩增。在3，RACE中，利用降落PCR(touchdown PCR)方法，用接头引物oligodT和R3Uf 进行PCR扩增。接头引物oligodT :5，-GGCCACGCGACTAGTAC(T) 16-3，引物 R3Uf 5，-CACTTGACATCACATATGACG-3，在5' RACE中，利用末端转移酶和dCTP在cDNA末端加上poly (C)尾后，以加尾后 的cDNA作为模板，利用特异性引物R5UF和OligodG进行PCR扩增。特异性引物R5UF :5，-GGTGGCAAGACAGCCGAG-3，OligodG :5，-GGGGGGGGGGGGGGG-3，所得到的PCR产物在1 %的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化 后，克隆到PMD-18T载体中，转化大肠杆菌(Escherichia coli)5H α感受态细胞，挑取阳 性克隆，用Μ13引物对质粒DNA进行测序，测序所得序列再与中间片段引物UF和UR扩增所 得的序列利用DNAStar软件进行拼接。5.对军曹鱼μ链基因的测定所得到的PCR产物在1 %的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化 后，克隆到PMD-18T载体中，转化大肠杆菌(Escherichia coli)5Ha感受态细胞，挑取阳性 克隆，用3730测序仪对质粒DNA进行测序。测序结果用BLAST软件进行同源性测定，来确 定为军曹鱼μ链基因的同源序列。6、免疫后免疫球蛋白μ链的分布和表达为检测μ链基因在鱼体内的表达情况，腹腔注射0.1ml活的JT2浓度为IO7个/ ml军曹鱼10条，另取3条健康的军曹鱼作为对照。取0h，48h，96h和192h四个时间点的头肾、脾脏、肝脏，肠，脑和胃等器官各约lOOmg，按照试剂盒说明提取总RNA，并合成cDNA第一 链，作为荧光定量PCR检测的模板。根据已克隆到的军曹鱼μ链基因的表达序列设计一对 特异性引物DUF和DUR，对目的基因的cDNA进行扩增，β -actin基因作为内参，扩增片段大 小约为 140bp。反应参数为:95°C,2min ；95°C，15s ；55°C，15s ；72°C, 30s ；共 40 个循环，溶 解曲线 95°C, 15s ；60°C -95°C，20min ；95°C，15s。引物 DUF 5，-CAGGAGACAGGACTGGGACG-3，引物 DUR 5，-TTTAGCAAAGCAGGAGAAGGTA-3，结果显示，免疫球蛋白μ基因在心脏(图1)鳃(图4)胃(图5)头肾(图7)肠 (图8)的表达从0h-96h是增加的，但是在192h时却有所减少；肾脏(图6)中从0h_48h 未检测到荧光信号，而在96h-192h时表达量大幅度增加；脾脏(图3)中IgM基因表达在 0h-96h小时检测到是减少的，192h时又有所增加；脑(图9)中μ基因的表达从0h-48h是 增加的，96h时又增加，但是在192h时检测到荧光信号再次减弱；在未受刺激的健康鱼中， μ链基因在脾脏中的表达量较高，而在头肾，肾，心脏，胃，肠和脑组织中表达量较少或者几 乎没有表达。经JT2刺激后，μ链基因在心脏，鳃，胃，头肾，肠中的表达从0h-96h是增加 的，在192h时检测到减少；虽然在肝脏(图2)中的表达量很少但是从0h-192h，表达量一 直是增加的。由此结果可以推测，在未受刺激的健康鱼中，脾脏是产生天然抗体的主要场， 而经JT2刺激192h后，脾脏中天然抗体的产生反而受到了抑制。总之免疫球蛋白在抵御外 来病原生物的侵害时，免疫球蛋白不同组分间共同协作，强化功能，应答多种变化，抵御外 源病原微生物的侵袭，而对机体无任何副作用。因此，免疫球蛋白的变化在一定程度上是机 体抗病潜能的重要标志，在病原微生物的侵袭发挥着重要的防御作用。序列表<110>中国水产科学研究院南海水产研究所<120>军曹鱼免疫球蛋白μ链的基因序列<160>2<210>1<211>1933<212>RNA<213> 军曹鱼(Rachycentron canadum)<220><221>3，UTP<222> (1770)... (1933)<220><221>5，UTP<222>(1). . . (26)<220><221>CDS<222>(27). . . (1769)<220><221>PolyA site
<222>(1899). .. (1933)<400>1AGCTCATCAGTTTGACCATAAACCATGTTTTCTGTAGCTCTGCTGCTGCTGTTGGCAGCT 62MFSVALLLLLAA1612GGATCCTGTGTGAAGTGTCAACAGTTGACACAGCCAGCCTCTGTGACTGTGCAGCCAGGT 122GSCVKCQQLTQPASVTVQPG1319 2532CAACGTCTGACCATCACCTGTCAGGTCTTTTATTCTGTTAGCAGCTACGCAACAGCTTGG 182QRLTlTCQVFYSVSSYATAff3339 4552ATCAGACAGCCTGCAGGGAAAAGACTGGAGTGGATTGGAATTGCACGTGTTGGATACACC 242IRQPAGKRLEffIGIARVGYT5359 6572TCATACTACAAAGATTCACTGAAGCACAAGTTCAGTATCGACTTAGACTCTTCCAACAAC 302SYYKDSLKHKFSIDLDSSNN7379 8592AGAGTAACTCTAAATGGACAGAACATGCAGCCTGAAGACTCTGCTGTGTATTATTGTGCC 362RVTLNGQNMQPEDSAVYYCA9399 105112AGCCGGATGGTAGGGGATGCTTTTGACTACTGGGGGAAAGGAACAATGGTTACAGTTACA 422SRMVGDAFDYffGKGTMVTVT113119 125132TCAGCCACTGCAAAAGGACCAACTCTCTTTCCTCTGATACAATGTGCATCTGGGAGCGCG 482SATAKGPTLFPLIQCASGSA133139 145152AGCGAGGTCACTCTCGGCTGTCTTGCCACCGACTTCACACCCTCCTCACTGACATTCACA 542SEVTLGCLATDFTPSSLTFT153159 165172TGGAAAAAGGACCAAACTGACTTGACGGACTTCATTCAGTACCCTTCAGTACAGAAAGGC 602WKKDQTDLTDFIQYPSVQKG173179 185192GCCATGTACACAGGAGTCAGTCAAATTCGTGTCAGGAGACAGGACTGGGACGCAGGGCAG 662AMYTGVSQIRVRRQDffDAGQ193199 205212AGTTTCCATTGCATTGCAACACATGTTGGAGGAAATGACAACGTTACCATCGCAAAGCCA 722SFHCIATHVGGNDNVTIAKP213219 225232CTGGAATTTGTCCTGTTGCCAACTCTTCGAGCGTTGGTCTCCTCTGATGATGCGAACGAA 782
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481500520540YHESVVNSCNAIIRSIGQR T FESTNLVNLNMNIPETCKAQ541560580
权利要求
一种军曹鱼免疫球蛋白μ链的基因序列，其特征在于，它的DNA核苷酸及相应的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。
全文摘要
本发明公开了一种军曹鱼免疫球蛋白μ链的基因序列，它的DNA核苷酸及相应的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。该基因序列的获得不仅为研究鱼类免疫球蛋白在体液免疫中的作用以及为进一步探讨鱼类免疫球蛋白体液反应的发生机理奠定基础，而且通过基因序列可以获得具有生物活性的纯化蛋白，为研究新型的抗病免疫抗体成为现实。
文档编号C07K16/18GK101812460SQ20091021446
公开日2010年8月25日 申请日期2009年12月31日 优先权日2009年12月31日
发明者侯月娥, 冯娟, 徐力文, 王江勇, 苏友禄, 茅莉娜, 郭志勋 申请人:中国水产科学研究院南海水产研究所