专利名称：：从藏药绵参中提取具有抗氧化活性的化合物及其提取方法
技术领域：
：本发明涉及一种从藏药绵参中提取新化合物的方法，特别涉及一种从藏药绵参中提取具有抗氧化活性的化合物及其提取方法。
背景技术：
：藏医药学是我国藏族人民在长期与自然环境斗争的过程中形成的独特的医疗保健方法，是祖国传统医药学的瑰宝。西藏是一个高寒、缺氧、辐射强、无污染的高原环境，因此藏药具有生长周期长、疗效独特、活性物质累积高等特点。虽然市场上已有藏药保健品，但品种比较单一，且功效因子及其构效量效关系都不明确，这不利于开发第三代保健品和走向国际市场，因此，深入研究藏医藏药在保健品方面的应用，确定藏药保健品的功效因子及其构效量效关系，是开发第三代藏药保健品和走向国际市场的一个关键。绵参(EriophytonwallichiiBenth.)，藏药名榜参布茹，是唇形科植物，全草或根入药，生于海拔4500-5300km的冰泽乱石堆，碎石带，产于西藏、青海、甘肃南部、四川西部、云南西北部，花盛期采集，去净泥土，晒干。味苦性凉，调气和血、提升中气、滋补、润肺。治气虚体弱、气血亏损、肺脓肿、肺结核、肺热咳嗽、咳血、胸痛。绵参在藏药名著《晶珠本草》中早有记载，目前，只有中科院成都生物所曾经从绵参的月旨溶性部位中分到28-印i-cyaste皿e，Eriophytonoide，Cyaste皿e，ajuforrestinsAandB，20—hydroxyecdysone，polypodinB，ajugalactone，8_0_3cetylharp3gid，即igenin，-sitosteroldaucosterol，MidN_[2_hydroxy_(nori3decanoyl-tricosanoyl)]-4-hydroxytr雄-8-sphingenine等化合物，而对其月旨溶性部位禾口水溶性部位的系统研究还没有报道，同时，对其活性物质基础的研究国内外也没有报道。因此，为了深入研究绵参的化学成分及其药理活性，明确其功效因子及其构效量效关系，为开发绵参系列保健品提供理论依据，利用现代分离分析技术和药理实验技术对绵参的生物活性成分进行了研究。即提供一种从藏药绵参中提取具有抗氧化活性的化合物及其提取方法，即成为该领域技术人员急待着手解决的问题之一。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种从藏药绵参中提取具有抗氧化活性的化合物及其提取方法。为实现上述目的本发明所采用的技术方案是一种从藏药绵参中提取具有抗氧化活性的化合物，其特征在于所获得的具有抗氧化活性的化合物化学结构式为3该化合物为无色粉末，由ESI-MSm/z:487[M+Na]+，509[M+HC00—]—，可知其分子量为464，结合^-NMR(C5DsN)和13C_NMR(C5D5N)数据，确定其分子式为C21H360u，不饱和度为4;力-NMR谱S5.48(1H，d，J=8.0Hz)和13C_NMR谱S99.7是糖的端基质子和端基碳的特征信号，表明有一个P-葡萄糖基；分析其苷元部分的碳谱数据，发现其苷元与jioglutinE的苷元骨架相似，是环戊烷型环烯醚萜，HMBC谱相关信号SH5.61/Se68.4、SH4.16/Sc95.7禾PSH3.79/Sc95.7显示C_3上为_OCH2CH2CH2CH3，而C_8上-OH则替换成了_00CCH3，葡萄糖基连在C-l羟基上，该化合物是一个新的环烯醚萜苷，命名为wallchiisideB。—种从藏药绵参中提取具有抗氧化活性的化合物的提取方法，其特征在于实施步骤如下首先，将lOKg干燥的绵参全草，粉碎，以50-95%乙醇室温浸泡提取3次，每次7-10天，将提取液合并减压浓縮，得流浸膏970g，密度1.15g/ml，用水混悬分散后得3L;依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚部位200g、乙酸乙酯部位33g、正丁醇部位255g;然后，将正丁醇部位255g经D-1400型大孔吸附树脂柱，径高比l:5，以水-乙醇系统洗脱分为4个部分10%，30%，60%，90%;30X洗脱部分，74g，经MCI-GELCHP20P大孔树脂柱层析，径高比1:8，以10-60%甲醇_水洗脱，按10%递增分为Al-A6共6个部分；A4再经反相ODS-A柱层析，径高比1:8，按10%递增以10-60X甲醇-水洗脱，各洗脱5个柱体积，分为Bl-B6共6个部分，B5再反复S印hadexLH-20凝胶柱层析，径高比1:30，以50%甲醇洗脱得wallchiisideB10mg。本发明的有益效果是从藏药绵参中提取分离到一个新的环烯醚萜类化合物，提取分离过程简便，经过试验证明该化合物具有清除自由基的能力，为开发具有抗氧化作用的药物提供了先导化合物。图1是本发明wallchiisideB提取分离流程图。具体实施例方式以下附图及较佳实施例，对依据本发明提供的具体实施方式及特征详述如下本发明所获得的具有抗氧化活性的化合物化学结构式为该化合物为无色粉末，由ESI-MSm/z:487[M+Na]+，509[M+HC00—]—，可知其分子量为464，结合^-NMR(C5DsN)和13C_NMR(C5D5N)数据，确定其分子式为C21H360u，不饱和度为4;力-NMR谱S5.48(1H，d，J=8.0Hz)和13C_NMR谱S99.7是糖的端基质子和端基碳的特征信号，表明有一个P-葡萄糖基；分析其苷元部分的碳谱数据，发现其苷元与jioglutinE的苷元骨架相似，是环戊烷型环烯醚萜，HMBC谱相关信号SH5.61/Se68.4、SH4.16/Sc95.7禾PSH3.79/Sc95.7显示C_3上为_OCH2CH2CH2CH3，而C_8上-OH则替换成了_00CCH3，葡萄糖基连在C-l羟基上，该化合物是一个新的环烯醚萜苷，命名为wallchiisideB。如图1所示，一种从藏药绵参中提取具有抗氧化活性的化合物的提取方法，实施步骤如下首先，将lOKg干燥的绵参全草，粉碎，以50-95%乙醇室温浸泡提取3次，每次7-10天，将提取液合并减压浓縮，得流浸膏970g，密度1.15g/ml，用水混悬分散后得3L;依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚部位200g、乙酸乙酯部位33g、正丁醇部位255g;然后，将正丁醇部位255g经D-1400型大孔吸附树脂柱，径高比l:5，以水-乙醇系统洗脱分为4个部分10%，30%，60%，90%;30X洗脱部分，74g，经MCI-GELCHP20P大孔树脂柱层析，径高比1:8，以10-60%甲醇_水洗脱，按10%递增分为Al-A6共6个部分；A4再经反相ODS-A柱层析，径高比1:8，按10%递增以10-60X甲醇-水洗脱，各洗脱5个柱体积，分为Bl-B6共6个部分，B5再反复S印hadexLH-20凝胶柱层析，径高比1:30，以50%甲醇洗脱得wallchiisideB10mg。通过DPPH法测定wallchiisideB具有较强的抗氧化活性。表lwallchiisideB在C5D5N中的核磁共振数据5<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>采用仪器与材料质谱MAT_95型质谱仪，Kratos1H型质谱仪；核磁共振谱BruckAM-400核磁共振仪；反相硅胶0DS-A(120nm，S-50um)，YMCCO.，LTD.，JapanSephadexLH-20:GEHealthcareBio-ScoencesAB，Uppsala,Sweden;大孔吸附树脂D-1400，扬州制药厂;MCI-GELCHP20P(75-150Pm)，MitsubishiChemicalCorporation,Tokyo,Japan5比旋光度Perkin-Elmer241MCpolarimeter或Perkin-Elmer341polarimeter;红外光谱McoletMagna750FTIR型红外分光光度计；TLC薄层板HSGF254，可采用烟台化工研究院；显色剂10%硫酸香兰素乙醇溶液；植物材料绵参(EriophytonwallichiiBenth.)全草采自西藏自治区;DPPH:sigma公司。wallchiisideB抗氧化活性的试验方法以水为溶剂，准确的将wallchiisideB和标准品配成以下浓度10、20、40、80、160、320mg/L。称取20mg的DPK1用无水乙醇溶解定容于250mL容量瓶中，则DPKl的浓度为2X10—4mol/L。测定方法向九十六孔板中加入150uL的样品溶液和150yL的DPPH溶液，摇匀，于室温中放置30min后，在517nm(最大吸收波长处)测定其吸光度。样品对DPm的清除率K可用下式计算k=[l-(A「Aj)/Ac]X100%式中Ai=150iiLDPPH溶液+150iiL样品溶液的吸光度值；Aj=150iiL样品溶液+150iiL水的吸光度值；Ac=150iiLDPPH溶液+150iiL水的吸光度值。试验结果表2wallchiisideBDPPH的清除率，％度样品名^\10204080160320ic50wallchiisideB14.1±1.024.4±1.837.1±2.746.3±3.864.2±3.575.8±4.382.4芦丁14.0±1,138.5±1.356.2±3.270.1±4.085.6±4.698.8±5.833.4山奈酚-3-O-芸香苷8.8±0.614.3±1.316.3±1.728.1±1.953,2±3.175.1±3.7144.1从表2可以看出，随着浓度的增加wallchiisideB的自由基清除率也逐渐升高，通过分析ICs。值发现，wallchiisideB的自由基清除能力明显强于山奈酚-3_0_芸香苷，说明其具有显著的抗氧化能力。环烯醚萜苷类化合物的药理活性环烯醚萜类化合物作为众多植物药中的有效成分之一，具有广泛的生物活性，如抗病毒、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、保肝利胆、解痉镇痛、增强免疫、降糖降脂等多种活性，并且对神经系统、心血管系统和消化系统具有有益的作用。有实验表明栀子中京尼平苷、栀子苷能抑制鼠白血病P388细胞的生长，其中苷元的半縮醛结构是抗肿瘤所必需的。而栀子酸(GA)和栀子苷(GP)对大鼠肿瘤模型的抗癌作用是作为对亚致死的X射线辐射作用的防护剂来实现的。同时发现GA比GP具有更高防护活性。抗大鼠四氧嘧啶糖尿病的实验显示，从玄参属植物Scrophulariadeserti中发现的scropoliosideD和8_0_乙酰基哈帕酸有较强活性；C_3肉桂酰基团使环烯醚鹏苷活性增强，而C-8上的乙酰基对抗糖尿病活性是必需的。山茱萸环烯醚萜总苷对由糖尿病血管并发症引起的氧化应激损伤具有保护作用。另有实验表明山茱萸环烯醚萜总苷能使糖尿病大鼠胸主动脉血管内皮细胞损伤得到明显改善，且能抑制糖尿病大鼠肾皮质AGEs的形成，使其受体mRNA表达水平下降，具有减轻糖尿病肾病变的作用。栀子果仁中的京尼平苷具有软化大便的作用，其苷元经药理实验证明具有显著的促进胆汁分泌作用。车前草清湿热、利小便作用的有效成分是环戊烷结构的桃叶珊瑚苷。梓醇是地黄中降血糖作用的有效成分，并有很好的利尿作用和迟发性缓下作用。梓实用于治7疗肾炎浮肿等疾病，其中的梓苷的药理作用和梓醇相似。洋橄榄中的油洋橄榄苦苷和洋橄榄内酯具有降血压的作用。筋骨草苷(Ajugoside)具有抗感染作用，100yM时，可以抑制人血小板中75%的TXB2的释放，IC5。为9.5iimol/L。血栓烷素B2(TXB2)增高见于动脉粥样硬化、心肌梗死、血栓性疾病、糖尿病、高脂血症、恶性肿瘤等。lOOyM时，可以抑制NMPI小鼠腹膜巨噬细胞中42%的前列腺素E2(PGE2)的释放。8-乙酰基哈帕苷(8-0-acetyl-harpagide)的药理活性研究得比较多，主要有抗肿瘤、抗病毒、抗炎等作用。在用二甲基苯并蒽(匿BA)和肿瘤细胞生长促进剂(TPA)有道德大鼠乳头瘤的实验中，以甘草次酸为阳性对照药，大鼠在用匿BA和TPA诱导8周后，荷瘤率为80%，给以8-乙酰基哈帕苷后，在相同的条件下，荷瘤率只有8%。8-乙酰基哈帕苷对由TPA诱导的大鼠皮肤癌比甘草次酸具有更好的治疗效果。该化合物还有一定的抑制肺癌的作用。8-乙酰基哈帕苷的抗肿瘤作用与其较强地抑制爱-巴病毒(EBV)有关。EBV属于疱疹病毒，可以使人及灵长类动物的B淋巴细胞转化成无限生长的癌变细胞，其在口咽部的非淋巴细胞中也能复制，包括唾液腺管及口咽部的其他上皮细胞。8-乙酰基哈帕苷对由TPA诱导的Raji细胞(Barkitt—s淋巴瘤细胞)中EBV的DNA表达具有很强的抑制作用，在20iig/mL是抑制率是100%，在lOiig/mL时抑制率是80%，其抑制效果比阳性对照药甘草次酸、视黄酸都要好。8-乙酰基哈帕苷(8-0-acetyl-harpagide)具有抗感染作用，能强烈抑制人血小板中TXB2的释放，IC5。为19.5iimol/L。藏医药学是我国藏族人民在长期与自然环境斗争的过程中形成的独特的医疗保健方法，是祖国传统医药学的瑰宝。西藏是一个高寒、缺氧、辐射强、无污染的高原环境，因此藏药具有生长周期长、疗效独特、活性物质累积高等特点。虽然市场上已有大量的藏药保健品，但品种比较单一，且功效因子及其构效量效关系都不明确，这不利于开发第三代保健品和走向国际市场，因此，深入研究藏医藏药在保健品方面的应用，确定藏药保健品的功效因子及其构效量效关系，是开发第三代藏药保健品和走向国际市场的一个关键。特别是本发明首次从藏药绵参中提取分离并鉴定了所述的新化合物，并对其功效成分进行了系统研究，根据现代药理学研究的结果，我们认为绵参具有抗病毒、抗菌消炎、抗肿瘤、抗氧化、保肝利胆、解痉镇痛、增强免疫、降糖、降脂、降压、抗血小板凝集和血栓、清除氧自由基、抗菌消炎等作用，随着研究的进一步深入，相信绵参在保健品应用方面具有广阔的前景。上述参照实施例对该从藏药绵参中提取具有抗氧化活性的化合物及其提取方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的；因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。权利要求一种从藏药绵参中提取具有抗氧化活性的化合物，其特征在于所获得的具有抗氧化活性的化合物化学结构式为该化合物为无色粉末，由ESI-MSm/z487[M+Na]+，509[M+HCOO-]-，可知其分子量为464，结合1H-NMR(C5D5N)和13C-NMR(C5D5N)数据，确定其分子式为C21H36O11，不饱和度为4；1H-NMR谱δ5.48(1H，d，J＝8.0Hz)和13C-NMR谱δ99.7是糖的端基质子和端基碳的特征信号，表明有一个β-葡萄糖基；分析其苷元部分的碳谱数据，发现其苷元与jioglutinE的苷元骨架相似，是环戊烷型环烯醚萜，HMBC谱相关信号δH5.61/δC68.4、δH4.16/δC95.7和δH3.79/δC95.7显示C-3上为-OCH2CH2CH2CH3，而C-8上-OH则替换成了-OOCCH3，葡萄糖基连在C-1羟基上，该化合物是一个新的环烯醚萜苷，命名为wallchiisideB。F2009102284204C0000011.tif2.—种根据权利要求1所述的从藏药绵参中提取具有抗氧化活性的化合物的提取方法，其特征在于实施步骤如下首先，将10Kg干燥的绵参全草，粉碎，以50-95%乙醇室温浸泡提取3次，每次7-10天，将提取液合并减压浓縮，得流浸膏970g，密度1.15g/ml，用水混悬分散后得3L;依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚部位200g、乙酸乙酯部位33g、正丁醇部位255g;然后，将正丁醇部位255g经D-1400型大孔吸附树脂柱，径高比l:5，以水-乙醇系统洗脱分为4个部分10%，30%，60%，90%;30X洗脱部分，74g，经MCI-GELCHP20P大孔树脂柱层析，径高比1:8，以10_60%甲醇-水洗脱，按10X递增分为Al-A6共6个部分；A4再经反相0DS-A柱层析，径高比1:8，按10%递增以10-60%甲醇-水洗脱，各洗脱5个柱体积，分为Bl-B6共6个部分，B5再反复S印hadexLH-20凝胶柱层析，径高比1:30，以50%甲醇洗脱得wallchiisideB10mg。全文摘要本发明涉及一种从藏药绵参中提取具有抗氧化活性的化合物及其提取方法，该化合物经现代光谱分析确定为环烯醚萜类新化合物，分子量为464，分子式为C21H36O11。其提取方法包括绵参全草粉碎，乙醇提取，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，正丁醇部位进行大孔吸附树脂层析，30％洗脱部分依次经MCI-GELCHP20P、ODS-A、SephadexLH-20柱层析，得wallchiisideB。本发明新化合物制备方法简单，成本低廉，活性显著，为开发具有抗氧化作用的药物提供了新的化合物。文档编号C07H17/04GK101704862SQ200910228420公开日2010年5月12日申请日期2009年11月16日优先权日2009年11月16日发明者范秋领,赵明明申请人:天津天狮生物发展有限公司;天津天狮生物工程有限公司;天津天狮生命源有限公司;天津天狮集团有限公司