专利名称：从家蝇幼虫中诱导并提取金属硫蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及一种物质提取方法，尤其是从家蝇幼虫中诱导并提取金属硫蛋白的方法。
背景技术：
金属硫蛋白是一种分子量约为6000-8000Da的金属结合蛋白，富含半胱氨酸。金 属硫蛋白广布于原核与真核的生物体内，具有参与稀有元素转运、贮存与代谢，以及重金属 解毒和清除自由基等作用。该蛋白已被人们用于改善消化道微环境、治疗胃溃疡和配制化 妆品等方面。金属硫蛋白的提取以及纯化方法很多，包括层析法、高效液相色谱法、毛细管 电泳法等，但是多数只能用于实验室研究，不适于在工业生产中采用。并且目前金属硫蛋白 的提取多数是从酵母菌、蜗牛及兔肝内提取硫蛋白，由于供体有限且成本高，不利于长期经 济的发展，且现有提取方法的提取量较小、纯度较低。
发明内容
针对现有金属硫蛋白提取方法提取纯度低、提取量小等不足，本发明提供一种诱
导并提取金属硫蛋白的方法，从家蝇幼虫中提取，降低了成本。在原有粗品的生产工艺基础
上采用进一步离子交换层析和脱盐，研究了精品的生产工艺，同时对诱导次数以及采用生
理盐水作为诱导剂进行了研究，提高金属硫蛋白的提取量及提取纯度。
本发明的从家蝇幼虫中诱导并提取金属硫蛋白的方法，其操作步骤如下 a、以麦麸、水、10XEM复合菌群和含有锌、铜、铬复合离子诱导剂为原料，常温发
酵10 50小时制成培养基； b、取家蝇的卵植入a步骤制得的培养基内，温度控制在30 35摄氏度，二十四小 时后在培养基表面均匀喷洒5%浓度的相当于培养基总量10%的Cd2+、 Zn2+、 Cu2+金属离子 诱导剂，培养4 6天，即制得家蝇幼虫蛋白原料； c、取经b步骤培养的幼虫在4 20摄氏度纯净水中漂洗2次，再放入20 50摄 氏度、10%过氧化氢溶液浸泡10 120分钟； d、将经c步骤处理的幼虫在无菌水中漂洗30分钟，置于离心干燥机中干燥3 20 分钟，取出置于-30 -70摄氏度下冷冻保存； e、取经d步骤处理的家蝇幼虫蛋白原料投入到高速均浆机中，按照投入原料的 1 : 1添加常温甘氨酸缓冲液制成均浆液，甘氨酸缓冲液的ra值7 9 ;浓度0. 1 2mo1/ L ; f 、再将e步骤得到的混合液进行0. 1 0. 45能滤膜过滤，滤液浓度为1 10g/ mL，膜过滤蛋白分子量12000 15000Da溶液； g、将经f步骤制得的溶液进行模拟移动床色谱分离，洗脱泵流量0 1000mL/min， 压力0 10Mpa ;进样泵流量0 30mL/min，压力0 8Mpa ;萃取泵流量0 100mL/min，压 力0 10MPa ;工作温度20 25摄氏度；模拟移动床色谱参数解吸段4根柱、精制段4根柱、吸附段4根柱，进样流速Uf = 8 12mL/min，洗脱泵流速Ud = 340 380mL/min，萃取 液流速Ue = 230 250mL/min，残余液流速Ur = 118 142mL/min，切换时间ts = 14 18min j h、将经g步骤处理的残余液蛋白分子量5500 6500Da，注入真空浓縮罐内，经减
压浓縮含水1 50%后，再进行真空冻干机冻干20小时，即制成金属硫蛋白产品。 作为本发明的进一步改进，上述色谱柱填料及流动相选择填料为反相硅胶ODS，填
料粒度30 40um，洗脱流动相为乙醇与水的混合物，乙醇和水的体积比为5 : 5。 本发明从家蝇幼虫中诱导提取金属硫蛋白的方法，简单易行，成本低、提取纯度
高、提取量大。
具体实施例方式本发明从家蝇幼虫中诱导并提取金属硫蛋白的方法，其操作步骤如下 a、以麦麸、水、10XEM复合菌群和含有锌、铜、铬复合离子诱导剂为原料，常温发
酵10 50小时制成培养基； b、取家蝇的卵植入a步骤制得的培养基内，温度控制在30 35摄氏度，二十四小 时后在培养基表面均匀喷洒5%浓度的相当于培养基总量10%的Cd2+、 Zn2+、 Cu2+金属离子 诱导剂，培养4 6天，即制得家蝇幼虫蛋白原料； c、取经b步骤培养的幼虫在4 20摄氏度纯净水中漂洗2次，再放入20 50摄 氏度、10%过氧化氢溶液浸泡10 120分钟； d、将经c步骤处理的幼虫在无菌水中漂洗30分钟，置于离心干燥机中干燥3 20 分钟，取出置于-30 -70摄氏度下冷冻保存； e、取经d步骤处理的家蝇幼虫蛋白原料投入到高速均浆机中，按照投入原料的 1 : 1添加常温甘氨酸缓冲液制成均浆液，甘氨酸缓冲液的ra值7 9 ;浓度0. 1 2mo1/ L ; f 、再将e步骤得到的混合液进行0. 1 0. 45能滤膜过滤，滤液浓度为1 10g/ mL，膜过滤蛋白分子量12000 15000Da溶液； g、将经f步骤制得的溶液进行模拟移动床色谱分离，洗脱泵流量0 1000mL/min， 压力0 10Mpa ;进样泵流量0 30mL/min，压力0 8Mpa ;萃取泵流量0 100mL/min，压 力0 lOMPa ;工作温度20 25摄氏度；色谱柱填料及流动相选择填料为反相硅胶ODS，填 料粒度30 40um，洗脱流动相为乙醇与水的混合物，乙醇和水的体积比为5 : 5 ;模拟移动 床色谱参数解吸段4根柱、精制段4根柱、吸附段4根柱，进样流速Uf = 8 12mL/min， 洗脱泵流速Ud = 340 380mL/min，萃取液流速Ue = 230 250mL/min，残余液流速Ur = 118 142mL/min，切换时间ts = 14 18min ; h、将经g步骤处理的残余液蛋白分子量5500 6500Da，注入真空浓縮罐内，经压 浓縮含水1 50%后，再进行真空冻干机冻干20小时，即制成金属硫蛋白产品。
权利要求
从家蝇幼虫中诱导并提取金属硫蛋白的方法，其操作步骤如下a、以麦麸、水、10％EM复合菌群和含有锌、铜、铬复合离子诱导剂为原料，常温发酵10～50小时制成培养基；b、取家蝇的卵植入a步骤制得的培养基内，温度控制在30～35摄氏度，二十四小时后在培养基表面均匀喷洒5％浓度的相当于培养基总量10％的Cd2+、Zn2+、Cu2+金属离子诱导剂，培养4～6天，即制得家蝇幼虫蛋白原料；c、取经b步骤培养的幼虫在4～20摄氏度纯净水中漂洗2次，再放入20～50摄氏度、10％过氧化氢溶液浸泡10～120分钟；d、将经c步骤处理的幼虫在无菌水中漂洗30分钟，置于离心干燥机中干燥3～20分钟，取出置于-30～-70摄氏度下冷冻保存；e、取经d步骤处理的家蝇幼虫蛋白原料投入到高速均浆机中，按照投入原料的1∶1添加常温甘氨酸缓冲液制成均浆液，甘氨酸缓冲液的PH值7～9；浓度0.1～2mol/L；f、再将e步骤得到的混合液进行0.1～0.45靘滤膜过滤，滤液浓度为1～10g/mL，膜过滤蛋白分子量12000～15000Da溶液；g、将经f步骤制得的溶液进行模拟移动床色谱分离，洗脱泵流量0～1000mL/min，压力0～10Mpa；进样泵流量0～30mL/min，压力0～8Mpa；萃取泵流量0～100mL/min，压力0～10MPa；工作温度20～25摄氏度；模拟移动床色谱参数解吸段4根柱、精制段4根柱、吸附段4根柱，进样流速Uf＝8～12mL/min，洗脱泵流速Ud＝340～380mL/min，萃取液流速Ue＝230～250mL/min，残余液流速Ur＝118～142mL/min，切换时间ts＝14～18min；h、将经g步骤处理的残余液蛋白分子量5500～6500Da，注入真空浓缩罐内，经减压浓缩含水1～50％后，再进行真空冻干机冻干20小时，即制成金属硫蛋白产品。
2. 如权利要求1所述的从家蝇幼虫中诱导并提取金属硫蛋白的方法，其特征在于色谱柱填料及流动相选择填料为反相硅胶ODS，填料粒度30 40um，洗脱流动相为乙醇与水的混合物，乙醇和水的体积比为5 : 5。
全文摘要
本发明的从家蝇幼虫中诱导并提取金属硫蛋白的方法，利用Cd2+，Zn2+，Cu2+的金属离子生物诱导剂的培养基，在非金属培养器皿中培养3-5日龄家蝇幼虫，将家蝇幼虫漂洗、灭菌、低温高速均浆，膜过滤、色谱分离、洗脱浓缩，真空冷冻干燥，能够获得分子量5300-6500dDa含有20-27％半胱氨酸的Zn\Cu金属硫蛋白及其亚型，分子结构中带有少量芳香族氨基酸。经过生物诱导后的幼虫蛋白中金属硫蛋白得率能到达1mg/g，本发明的生产方法成本低、纯度高、产量高。
文档编号C07K1/16GK101696241SQ200910308720
公开日2010年4月21日 申请日期2009年10月24日 优先权日2009年10月24日
发明者孟庆煜 申请人:孟庆煜;