专利名称：一种高纯度光甘草定的分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及一种从豆科植物光甘草中分离纯化光甘草定的方法，属于植物中单体 活性成分的分离纯化技术领域。
背景技术：
甘草属光果甘草(洋甘草)Glycyrrhiza glabra L.主产于我国东北，华北、西北 各省区，生于河岸阶地，沟边、田边、路旁，欧洲、地中海区域、哈萨克斯坦、乌兹别克斯坦、土 库曼斯坦、吉尔吉斯斯坦、塔吉克斯坦、俄罗斯西伯利亚地区以及蒙古亦产。光甘草中的黄 酮类化合物除了有明显的抗溃疡、抗菌消炎、降血脂外，还有明显的清除自由基和抗氧化作 用，其中 光甘草定(Glabridin)是光果甘草中的主要黄酮类成分之一，其分子式为C2tlH2tlO4, 分子量为324. 3704，结构式如式I所示。光甘草定既能抑制酪氨酸酶的活性，又能抑制多 巴色素互变酶和DHICA氧化酶的活性，在细胞色素P450/NADPH氧化系统中显示出很强的抗 自由基氧化作用，能明显抑制体内新陈代谢过程中所产生的自由基、以免受对氧化敏感的 生物大分子(低密度脂蛋白LDL，DNA)和细胞壁等被自由基氧化损伤，从而可以防治与自 由基氧化有关的某些病理变化，如动脉粥样硬化、细胞衰老等。故光甘草定被认为是一种快 速、高效、安全、绿色的天然美白化妆品添加剂，目前已在化妆品美白领域得到广泛应用。然 而，由于光甘草定在光果甘草中的含量约为0. 1 0. 3%，因此得到高纯度的光甘草定单体 的工艺流程复杂，成本昂贵。目前，国内外多采取反复硅胶柱层析等传统方法分离纯化光 甘草定单体，产品质量和数量都难以满足市场需求，且试剂消耗大，产品收率低。中国专利 200410079233. 1公开了一种光甘草产品的生产方法，该方法用有机溶剂提取光甘草粗品后 上硅胶柱，用氯仿、丙酮梯度洗脱，收集目标溶液减压浓缩，真空干燥后得光甘草定含量为 40%的黄棕色粉末。该方法使用了有毒的有机溶剂，操作繁复，所得产品纯度较低。中国专 利200510023860. 8公开了一种高纯度光甘草定的生产方法，该方法将光甘草提取液超滤 后再进一步用高分子树脂吸附、淋洗液淋洗及重结晶精制，可获得纯度90%以上的光甘草 定，但产品的纯度难以进一步提高，且该方法使用了超滤技术和高分子树脂分离方法，操作 繁复、成本较高且产品收率低。随着科技的进步，近年来国际市场对该类产品的质量要求有 所提高，对光甘草定单体成分的含量也有所要求，因而需要提供一种成本低廉、产品纯度高 的光甘草定分离纯化方法。<formula>formula see original document page 4</formula>(J式 I
发明内容
本发明的目的在于提供一种高纯度光甘草定单体的分离纯化方法，此方法不但可 实现光甘草定单体的高效分离，而且工艺稳定，成本低廉，可大量制备得到纯度大于98 %的 单体。本发明所采用的技术方案如下—种高纯度光甘草定的分离纯化方法，包括以下步骤(1)、有效部位的提取取光甘草药材，用体积百分比浓度为20% 95%的乙醇提 取3次，提取温度为30°C 60°C，提取时间分别为3、2、Ih，合并提取液，在40°C 50 V的温 度下减压浓缩，得提取物浸膏；以防光甘草定受热分解；(2)、有效部位的富集及除杂提取物浸膏用水悬浮后加入等体积乙酸乙酯、二氯 甲烷或三氯甲烷萃取3次或3次以上，至水相中不能检出光甘草定为止，在40°C 50°C的 温度下浓缩回收乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷至干，得光甘草定粗品；光甘草定粗品用水分散后过聚酰胺柱层析或大孔树脂DlOl柱层析分离除杂，得 光甘草定样品光甘草定粗品分散液吸附后聚酰胺柱后依次用水、20%甲醇、50%甲醇、 95%甲醇洗脱，分别收集洗脱液，HPLC检测，80%甲醇洗脱液中包含产品，收集80%甲醇洗 脱液，浓缩至干；光甘草定粗品分散液吸附于大孔树脂DlOl柱后依次用水、10%乙醇、30% 乙醇、50%乙醇洗脱，分别收集洗脱液，HPLC检测，50%乙醇洗脱液中包含产品，收集50% 乙醇洗脱液，浓缩至干；(3)、光甘草定单体的高效液相色谱分离将步骤⑵所得光甘草定产品用 80% -95%甲醇溶解，利用制备型高效液相色谱柱，对光甘草定甲醇溶液进行高效分离，以 乙腈水溶液或甲醇水溶液作为流动相，流速100 300mL/min，HPLC在线检测，针对性收集 光甘草定单体的制备溶液，收集产品纯度98%以上的段落，于40°C 50°C温度下减压回收 浓缩至干，得淡黄粉末状的光甘草定单体；(4)、制备所得单体溶液的处理及产品干燥将步骤(3)所得光甘草定单体干品分 别用20倍量(g/mL)正己烷、石油醚或甲苯在50°C下溶解为饱和溶液，4°C冰箱静置析晶，收 集晶体干燥至恒重，得结晶纯度98. 5%以上的光甘草定单体。由于高效液相色谱对样品溶液的纯度、色泽等要求均较高，通过提取等简单处理 得到的提取液不能直接作为样品溶液进入高效液相色谱系统，否则既可能达不到良好的分 离效果，还可能对高效液相色谱系统的色谱柱等配件产生难以逆转的影响，缩短其使用周期；而色谱柱等液相色谱的相关配件成本通常较高，其使用周期的缩短显然将造成最终产 品的生产成本大大提高；因而，对进入高效液相色谱的样品溶液要求较高，其前处理过程非
常重要。本发明方法提取有效部位后用乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷对提取物进行萃取，得到的光甘草定粗品用水分散后过聚酰胺柱层析或大孔树脂DlOl柱层析分离，经过上 述步骤的组合，富集有效部位并除去提取物中的大量杂质，获得可以进入制备型高效液相 色谱系统的样品溶液，不至对高效液相色谱系统造成很大的影响，尽量延长其使用周期，节 约生产成本。在高效液相色谱分离过程中，色谱条件的选择非常重要，它对样品溶液中各物质 的出峰顺序、峰形、分离效果等起着决定性的作用；色谱条件主要包括色谱柱(包括填料、 柱长及直径等)、流动相(包括组成及流速等)、柱温、检测波长、检测器等，各色谱条件的选 择及其组合至关重要。本发明人通过大量的试验研究及对比分析，确定了如上所述的各色谱条件，使样 品溶液中各物质的出峰时间、峰形、分离效果等最佳化，有利于光甘草定单体得到充分有效 的分离。制备所得单体再经重结晶处理后可获得纯度为98. 5%以上的光甘草定单体。与现有技术相比，本发明的有益效果1、采用制备型高效液相色谱柱对光甘草定单体进行分离，HPLC检测器在线检测， 针对性收集光甘草定单体，目标明确，避免了常规柱分离的盲目性和先分离后检测造成的 资源浪费。2、过程直观，目标性强，对产品的质量易于控制，产品纯度均在98%以上。3、本发明整体工艺高效，环保，收率高，产量大，重现性好，容易收集产品，适合工 业化生产。
图1为光果甘草20%乙醇提取液的HPLC图谱，图中保留时间为17. ISmin处即为
光甘草定。图2为光果甘草60%乙醇提取液的HPLC图谱，图中保留时间为17.78min处即为
光甘草定。图3为光果甘草95%乙醇提取液的HPLC图谱，图中保留时间为17. 7min处即为光
甘草定。图4为光果甘草乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷萃取液的HPLC图谱，图中保留时间 为17. 5min处即为光甘草定。图5为光果甘草聚酰胺20% 50%甲醇洗脱液HPLC图谱，图中保留时间为17min 处即为光甘草定。图6为光果甘草聚酰胺80%甲醇洗脱液HPLC图谱，图中第二个峰即为光甘草定。图7为光果甘草大孔树脂10% 30%乙醇洗脱液HPLC图谱，图中保留时间为 15. 24min处即为光甘草定。图8为光果甘草大孔树脂50%乙醇洗脱液HPLC图谱，图中保留时间为15. 59min 处即为光甘草定。图9为光果甘草制备分离后HPLC图谱，图中保留时间为18. 9min处即为光甘草定。 图10为光果甘草产品HPLC图谱。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明的光甘草定单体的分离纯化方法作进一步说明。本 发明所列举的实施例中所涉及的原料药材购自哈萨克斯坦，用20% 90%的乙醇作为提 取溶剂，采用超声提取15 45min 进行含量测定，光果甘草中光甘草定的含量为0. 2%。实施例1本实施例的光甘草定单体的分离纯化方法，按如下工艺步骤进行(1)、有效部位的提取取光果甘草药材10KG，加入80L体积百分比浓度为20%的 乙醇溶液，于60°C下加热提取三次，提取时间分别为3、2、让，合并提取液，在401 501 的温度下减压浓缩，回收乙醇至干，得提取物流浸膏3L，HPLC检测(流动相乙睛-水 (50 50)波长292nm流速lml/min C18(250X4. 6mm)进样量10ul)该提取物中含有 光甘草定(见图1)。(2)、有效部位的富集及除杂将提取物浸膏用3倍质量的自来水悬浮后加入等体 积乙酸乙酯萃取3次，以HPLC检测产品已被大量萃取出来(见图4)，水相中不能检出光甘 草定为止，除去极性杂质，在40°C 50°C的温度下浓缩回收乙酸乙酯至干，得光甘草定粗 品 95g ；将95g光甘草定粗品分散于IOOOmL自来水中制备成光甘草定样品，用2% NaOH溶 液活化40cm的聚酰胺(120目)层析柱，用水更替洗至流出液pH值中性后上样，待光甘草 定样品吸附于聚酰胺柱后，依次用水、20% (ν/ν)甲醇、50% (ν/ν)甲醇、80% (ν/ν)甲醇、 95% (ν/ν)甲醇洗脱产品，分别收集洗脱液，HPLC定性定量检测，产品主要集中在80%甲醇 洗脱液中(见图5-图6)，将80%甲醇洗脱液浓缩至干回收光甘草定产品38g，采用归一法 经 HPLC 检测(流动相乙睛-水(50 50)，波长:292nm，流速:lml/min，C18 (250 X 4. 6mm) 进样量10 μ L)，产品纯度为44. 5%。(3)、光甘草定单体的高效液相色谱分离将步骤(2)所得光甘草定产品用90%甲 醇溶解，利用制备型高效液相色谱柱，对光甘草定甲醇溶液进行高效分离，分离柱直径5cm， C18填料，以乙腈水溶液(乙腈水=80 20)作为流动相，流速300mL/min，进样量IOOmL, HPLC在线检测，收集产品纯度98%以上的段落，于40°C温度下减压回收乙腈至干，得光甘 草定单体，高效液相色谱图见图9 ；(4)、制备所得单体溶液的处理及产品干燥将步骤(3)所得光甘草定单体用正己 烷在50°C下溶解为饱和溶液，4°C冰箱静置析晶，晶体于50°C下与五氧化二磷共存真空干 燥至恒重，收集产品，得结晶纯度98%以上的光甘草定单体12g，产品得率为60%，HPLC图 谱见图10。实施例2本实施例的光甘草定单体的分离纯化方法，按如下工艺步骤进行(1)、有效部位的提取取光果甘草药材20KG，加入160L体积百分比浓度为60% 的乙醇溶液，于50°C下加热提取三次，提取时间分别为3、2、lh，合并提取液，在40°C 50°C的温度下减压浓缩，回收乙醇至干，得提取物流浸膏6L，HPLC检测(流动相乙睛-水(50 50)，波长292nm，流速lml/min C18 (250 X 4. 6mm)，进样量IOul)该提取物中含有 光甘草定(见图2)。(2)、有效部位的富集及除杂将提取物浸膏用3倍量自来水悬浮后加入等体积二氯甲烷反复萃取，以HPLC检测产品已被大量萃取出来(见图4)，水相中不能检出光甘草 定为止，除去极性杂质，在40°C 50°C的温度下浓缩回收二氯甲烷至干，得光甘草定粗品 190g ；将190g光甘草定粗品分散于2000mL纯化水中制备成光甘草定样品，用2% NaOH 溶液活化80cm的DlOl打孔吸附层析柱，用水洗至流出液pH值为中性后上样，待光甘草定 样品吸附于聚酰胺柱后，依次用水、10% (ν/ν)乙醇、30%乙醇(ν/ν)、50%乙醇(ν/ν)洗 脱产品，分别收集洗脱液，HPLC定性定量检测，产品主要集中在50%乙醇洗脱液中(见图 7-图8)，将50%乙醇洗脱液浓缩至干，回收光甘草定产品73g，采用归一法经HPLC检测，产 品纯度为50%。(3)、光甘草定单体的高效液相色谱分离将步骤(2)所得光甘草定产品用95% 甲醇溶解，利用制备型高效液相色谱柱，对光甘草定甲醇溶液进行高效分离，分离柱直径 15cm, C18填料，以甲醇水溶液(甲醇水=80 20)作为流动相，流速300mL/min，进样量 300mL, HPLC在线检测，针对性收集光甘草定单体的制备溶液，收集产品纯度98%以上的段 落，于40°C温度下减压回收甲醇至干，得淡黄粉末状的光甘草定单体，高效液相色谱图见图 9 ；(4)、制备所得单体溶液的处理及产品干燥将步骤(3)所得光甘草定单体用石油 醚在50°C下溶解为饱和溶液，4°C冰箱静置析晶，晶体于50°C下与五氧化二磷共存真空干 燥至恒重，收集产品，得结晶纯度98%以上的光甘草定单体25g，产品得率为62.5%，HPLC 图谱见图10。实施例3本实施例的光甘草定单体的分离纯化方法，按如下工艺步骤进行(1)、有效部位的提取取光果甘草药材30KG，加入340L体积百分比浓度为95%的 乙醇溶液，于40°C下加热提取三次，提取时间分别为3、2、Ih，合并提取液，在40°C 50°C的 温度下减压浓缩，回收乙醇至干，得提取物流浸膏10L，HPLC检测该提取物中含有光甘草定 (见图3)。(2)、有效部位的富集及除杂将提取物浸膏用3倍量自来水悬浮后加入等体积三 氯甲烷反复萃取，以HPLC检测产品已被大量萃取出来(见图4)，水相中不能检出光甘草 定为止，除去极性杂质，在40°C 50°C的温度下浓缩回收三氯甲烷至干，得光甘草定粗品 320g ；将320g光甘草定粗品分散于SOOOmL纯化水中制备成光甘草定样品，用2% NaOH 溶液活化80cm的DlOl打孔吸附层析柱，用水更替洗至流出液PH值为中性后后上样，待光 甘草定样品吸附于聚酰胺柱后，依次用水、10% (ν/ν)乙醇、30%乙醇(ν/ν)、50%乙醇(ν/ ν)洗脱产品，分别收集洗脱液，HPLC定性定量检测，产品主要集中在50%乙醇洗脱液中(见 图7-图8)，将50%乙醇洗脱液浓缩至干回收光甘草定产品116g，经归一法检测，产品纯度 为 50%。(3)、光甘草定单体的高效液相色谱分离将步骤(2)所得光甘草定产品用80%甲醇溶解，利用制备型高效液相色谱柱，对光甘草定甲醇溶液进行高效分离，分离柱直径 30cm, C18填料，以甲醇水溶液(甲醇水=80 20)作为流动相，流速300mL/min，进样量 500mL, HPLC在线检测，收集产品纯度98%以上的段落，于50°C温度下减压回收甲醇至干， 得光甘草定单体，高效液相色谱图见图9 ； (4)、制备所得单体溶液的处理及产品干燥将步骤(3)所得光甘草定单体用石油 醚在50°C下溶解为饱和溶液，4°C冰箱静置析晶，晶体于50°C下与五氧化二磷共存真空干 燥至恒重，收集产品，得结晶纯度98%以上的光甘草定单体39g，产品得率为65%，HPLC图 谱见图10。
权利要求
一种高纯度光甘草定的分离纯化方法，包括以下步骤(1)、有效部位的提取取光甘草药材，用体积百分比浓度为20％～95％的乙醇提取3次，提取温度为30℃～60℃，提取时间分别为3、2、1h，合并提取液，在40℃～50℃的温度下减压浓缩，得提取物浸膏；(2)、有效部位的富集及除杂提取物浸膏用水悬浮后加入等体积乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷萃取3次或3次以上，在40℃～50℃的温度下浓缩回收乙酸乙酯、二氯甲烷或三氯甲烷至干，得光甘草定粗品；光甘草定粗品用水分散后过聚酰胺柱层析或大孔树脂D101柱层析分离除杂，得光甘草定样品光甘草定粗品分散液吸附于聚酰胺柱后依次用水、20％甲醇、50％甲醇、95％甲醇洗脱，收集80％甲醇洗脱液，浓缩至干；光甘草定粗品分散液吸附于大孔树脂D101柱后依次用水、10％乙醇、30％乙醇、50％乙醇洗脱，收集50％洗脱液，浓缩至干；(3)、光甘草定单体的高效液相色谱分离将步骤(2)所得光甘草定产品用80％-95％甲醇溶解，利用制备型高效液相色谱柱，对光甘草定甲醇溶液进行高效分离，以乙腈水溶液及甲醇水溶液作为流动相，流速为100～300mL/min，将步骤(2)所得光甘草定样品甲醇水溶液进行高效分离，HPLC在线检测，收集产品纯度98％以上的段落，于40℃～50℃温度下减压回收浓缩至干，得淡黄粉末状的光甘草定单体；(4)、制备所得单体溶液的处理及产品干燥将步骤(3)所得光甘草定单体干品分别用20倍量(g/mL)正己烷、石油醚或甲苯在50℃下溶解为饱和溶液，4℃冰箱静置析晶，得光甘草定单体。
全文摘要
本发明公开了一种光甘草定单体的高效分离纯化方法，它是以豆科植物甘草属光果甘草的干燥根为原料，将原料用有机试剂A进行提取，有机试剂B萃取，再通过聚酰胺柱和大孔吸附树脂柱层析，最后将有效部位溶液用制备型高效液相色谱柱进行分离纯化，HPLC进行在线检测，针对性收集光甘草定单体溶液，可获得纯度大于98％的光甘草定单体。本发明产量大、收率高、产品质量好，适合工业化生产。
文档编号C07D493/04GK101830906SQ20091031130
公开日2010年9月15日 申请日期2009年12月13日 优先权日2009年12月13日
发明者刘丁, 夏柯, 文焕松, 董维珍, 郭建华 申请人:成都普思生物科技有限公司