Cd86拮抗物多靶点结合蛋白的制作方法

专利名称：Cd86拮抗物多靶点结合蛋白的制作方法
技术领域：
本发明总体涉及多特异性结合分子及其治疗应用领域，更具体而言，涉及由CD86 拮抗物结合域和对异源靶点如IL-10激动剂、HLA-G激动剂、HGF激动剂、IL-35激动剂、PD-I 激动剂、BTLA激动剂、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或CD40拮抗物具有特异性的另一个结合域组成的融合蛋白，及其组合物和治疗应用。相关领域描述人免疫系统通常保护身体免受外来物质和病原体的损害。免疫系统保护身体的一种方式是通过产生称为T淋巴细胞或T细胞的特化细胞。T细胞和抗原呈递细胞(APC)之间的细胞间相互作用产生T细胞共刺激信号，从而引起T细胞对抗原产生应答。完整的T 细胞激活需要T细胞受体(TCR)与抗原呈递细胞上存在的抗原-MHC复合物结合以及T细胞表面上的受体CD^与抗原呈递细胞特别是树突细胞上存在的CD86和/或CD80配体结
口 O⑶80 (也称为B7-1)最初描述为人B细胞相关激活抗原，随后发现其为相关T细胞分子CD^和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA4)的受体。在后来的研究中，鉴定出称为⑶86(也称为B7-0或B7-2)的CTLA4的另一个反受体。⑶86在其胞外区域与⑶80 具有约25%的序列相同性。尽管通常认为CD80和CD86在其启动和保持CD4(+)T细胞增殖的能力方面具有功能等效性(Vasilevko等(2002)DNA Cell Biol. 21 :137-49)，阻断这两种分子该活性的可溶性CTLA4 Ig融合蛋白的临床数据已显示出临床益处(Genovese等 (2005)NEJM 353 :114-1123)，一些证据表明对⑶86的特异性抑制作用可能有益。例如， ⑶86或⑶80的介入对B细胞具有不同作用。具体而言，⑶80已显示提供正常B细胞和B 细胞淋巴瘤的增殖和IgG分泌的负信号，而⑶86则增强B细胞的活性(Suvas等Q002) J. Biol. Chem. 277 :7766-7775)。还有一些证据表明，CD80介入T细胞有免疫抑制作用(Lang等(2002) J. Immunol. 168 :3786-3792 ；Taylor 等 O004)J. Immunol. 172 :34-39 ；Paust 等 (2004) PNAS 101 10398-10403)，且其可通过PD-Ll (CD274)信号传导介导对活化的APC或 T 细胞的进一步免疫抑制作用(Butte 等(2007) Immunity 27 :111-122 ；Keir (2008)Ann. Rev. Immunol. 26 :677-704)。因此，缺乏⑶80抑制作用下的⑶86抑制作用可在自身免疫和炎性疾病以及B细胞淋巴瘤的治疗中具有益处。CTLA4是免疫球蛋白超家族的1型跨膜糖蛋白，其主要表达于活化T细胞中，也有一些表达发现于⑶4+⑶25+调节T细胞(Treg)亚群中。⑶86和⑶80被认为是CTLA4仅有的内源配体。已显示CTLA4与⑶86和⑶80结合的亲和力和亲合力高于⑶观(Linsley等 (1991) J.Exp· Med. 174 :561-69 ;Linsley 等(1994) Immunity 1 :793-801)，并作为 T 细胞激活的负调节物发挥关键作用。具体而言，CTLA4与CD80/CD86的结合引起T细胞应答的下调以及T细胞稳态和外周耐受性的保持。认为这种情况是由CD^依赖性共刺激的拮抗作用和通过CTLA4胞质尾区的定向负信号传导造成的。CTLA4结构和功能的综述参见Teft等 (2006)Annu. Rev. Immunol. 24 :65-97。如上所述，有效免疫应答同时需要TCR的介入以及⑶观与⑶80和/或⑶86的结合。缺乏⑶观结合下的TCR结合导致T细胞发生凋亡或变为无反应性。此外，已显示⑶观信号传导增加T细胞细胞因子的产生。具体而言，已显示CD^刺激作用使活化T细胞中的 IL-2、TNFa、淋巴毒素、IFN γ和GM-CSF的产量增加5_50倍。此外，已显示即使在免疫抑制环孢菌素的存在下，CD^也会诱导淋巴因子和/或细胞因子基因表达(Thompson等(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :1333-1337)。还已显示 CD28 通过诱导上调抗凋亡 BCL-XL 促进 T 细胞存活(Alegre 等 Q001) Nature Rev. Immunol. 1 :220-228)。通过将CTLA4的可变样胞外结构域与免疫球蛋白恒定结构域融合提供CTLA4_Ig 融合蛋白来构建CTLA4的可溶性形式。已显示可溶性CTLA-4-Ig通过与⑶86和⑶80 二者结合防止CM8依赖性共刺激，并显示其抑制T细胞共刺激，对人具有有益的免疫抑制作用(Bruce 和 Boyce (2007) Ann. Pharmacother. 41 1153-1162)。目前采用 CTLA4_Ig 融合蛋白阿巴西普(abatac印t)在抗TNF α治疗应答不足的情况下治疗类风湿性关节炎。然而， 并非所有患者对CTLA4-Ig均有应答，持续应答需要频繁的给药，可能部分因为阻断CM8与 CD86/CD80的相互作用是Treg的弱诱导物，不足以在疾病环境中阻断活化效应T细胞应答。附图简要说明

图1显示各种蛋白质与⑶80的结合，所述蛋白质包括阿巴西普、CTLA4-Ig(N2) (SEQ ID NO 11)和包含与ILlO融合的CTLA4胞外域的多特异性交叉受体(xc印tor)融合蛋白(SEQ ID NO 9)。图2显示CTLA4-Ig(N2) (SEQ ID NO :11)和包含与ILlO融合的CTLA4胞外域的多特异性交叉受体融合蛋白(SEQ ID NO 9)可与可溶性ILlORa(SlLlORa)结合。图3和4显示包含与ILlO融合的CTLA4胞外域的多特异性交叉受体融合蛋白(SEQ ID NO 9)可诱导PBMC中的STAT3磷酸化。图5显示包含来自3D1和人源化FUNl单克隆抗体的抗⑶86结合域的交叉受体与 WIL2-S细胞上的CD86结合。图6显示包含⑶86结合域和ILlO的交叉受体可同时结合细胞表面⑶86和 sIL 服a。
图7显示各种不同形式的人源化抗⑶86FUN1SMIP均可结合⑶86。图8显示具有将ILlO与交叉受体羧基末端(B^)连接的各种接头的CTLA4: ILlO 交叉受体分子可结合 ILlORl-Ig0 Δ -SEQ ID NO :9 ; -SEQ ID NO 171 ；· -SEQ ID NO 302 ;▲ -SEQ ID NO :173。图9显示具有将ILlO与交叉受体羧基末端(BD2)连接的各种较短接头的 CTLA4: ILlO 交叉受体分子可结合 IL10R1-Ig。Δ -SEQ ID NO :171 ; -SEQ ID NO :175; -SEQ ID NO 177 ；▲ -SEQ ID NO :179。 图10显示若干交叉受体蛋白结合⑶80。图11显示若干交叉受体蛋白结合⑶86。图12显示若干交叉受体蛋白结合sILlORa。图13显示若干交叉受体蛋白可同时结合⑶80和sILlORa。图14显示若干交叉受体蛋白与小鼠⑶80具有交叉反应性。图15显示若干交叉受体蛋白与小鼠⑶86具有交叉反应性。图16和图17显示若干交叉受体蛋白在MLR试验中阻断人T细胞应答。图18-图20显示若干交叉受体蛋白在MLR试验中阻断小鼠T细胞应答。图21和22显示包含变体ILlO (含187突变的ILlO或单IL10)或变体CTLA4的若干交叉受体蛋白在MLR试验中阻断人T细胞应答。图23显示包含变体ILlO (含187突变的ILlO或单IL10)的若干交叉受体蛋白在 MC/9细胞增殖试验中的免疫刺激性小于小鼠IL10。图M显示包含变体ILlO (含187突变的ILlO或单IL10)的若干交叉受体蛋白在 MC/9细胞增殖试验中的免疫刺激性小于人ILlO。发明详述本发明使得靶向抗原呈递细胞(APC)能够改变活性。例如，T细胞活性可通过提供包含优先结合CD86的第一结合域和第二结合域(异源结合域)的多特异性交叉受体融合蛋白来调节。在某些实施方式中，多特异性交叉受体融合蛋白包含第一和第二结合域、第一和第二接头以及间插结构域，其中间插结构域的一端通过接头与作为CD86结合域的第一结合域融合，另一端通过接头与作为IL-10激动剂、HLA-G激动剂、HGF激动剂、IL-35激动剂、PD-I激动剂、BTLA激动剂、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或⑶40拮抗物的第二结合域融合。在某些实施方式中，所述⑶86结合域是CTLA4胞外域、⑶观胞外域或具有⑶86特异性的免疫球蛋白可变区结合域(如scFv)(例如来自单克隆抗体3D1或FUN1)。在一些实施方式中，采用小于完整胞外域的部分。例如，可采用CTLA4域内与⑶86结合并防止⑶86 与CD^结合的结构域。在其它实施方式中，所述ILlO激动剂是ILlO或其功能区。在其它实施方式中，所述HLA-G激动剂是HLA-G5、HLA-G1、HLA-G突变蛋白或其功能区；HLA-G5、 HLA-Gl或HLA-G突变蛋白的胞外域；或具有ILT2、ILT4或KIR2DL4特异性的免疫球蛋白可变区结合域(如scFv)。在其它实施方式中，所述异源结合域是HGF激动剂，如HGF或其亚结构域。在另一个实施方式中，所述异源结合域是IL35激动剂，如具有IL35R、IL35或其功能区特异性的免疫球蛋自可变区结合域(如scFv)。在其它实施方式中，所述LIGHT拮抗物是具有LIGHT、HVEM胞外域或其功能区特异性的免疫球蛋白可变区结合域(如scFv)。在其它实施方式中，所述PD-I激动剂是具有PD-1、PD-1配体(例如，PD-Ll或PD-L2)或其功能区特异性的免疫球蛋白可变区结合域(如scFv)。在其它实施方式中，所述BTLA激动剂是具有BTLA、HVEM胞外域或其功能区特异性的免疫球蛋白可变区结合域(如scFv)。在某些实施方式中，所述GITRL拮抗物是具有GITRL、GITR胞外域、可溶性GITR或其功能区特异性的免疫球蛋白样可变区结合域(如scFv)。在某些实施方式中，CD40拮抗物是具有CD40 特异性的免疫球蛋白样可变区结合域(如scFv)。这样的多特异性融合蛋白在本文称为交叉受体OCceptor)分子，其示例性结构包括 N-BD-ID-ED-C、N-ED-ID-BD-C、N-BD1-ID-BD2-C 和 N-ED-ID-ED-C，其中 N-和-C 分别指氨基和羧基末端；BD是免疫球蛋白样或免疫球蛋白可变区结合域；ID是间插结构域；ED是细胞外或胞外域，如受体配体结合域、配体、C型凝集素结构域、导向蛋白或导向蛋白样结构域或类似结构。在一些构建体中，ID可包含置于第一和第二结合域之间的免疫球蛋白恒定区或亚区。在其它构建体中，BD和ED各自通过相同或不同的接头(例如包含1-50个氨基酸的接头)，如免疫球蛋白绞链区(由例如上部区域和核心区域构成)或其功能性变体，或凝集素域间区或其功能性变体，或分化簇(CD)分子柄区域(stalk region)或其功能性变体与ID连接。在更详细地阐述本发明之前，提供本文所用某些术语的定义可能有助于理解本发明。其它定义在本说明书全文中列出。在本说明书中，任何浓度范围、百分数范围、比例范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数值，适当时也包括其分数值(如整数的十分之一和百分之一)，除非另有说明。另外，本文所述的有关任何物理特征，如聚合物亚基、大小或厚度的任何数值范围应理解为包括所述范围内的任何整数，除非另有说明。本文所用的“约”或“主要由…组成” 指所述范围、数值或结构的士20%，除非另有说明。应理解，本文所用术语“一个”和“一种” 指“一个或多个”所列举的组分。替代物的使用(例如“或”)应理解为所述替代物中的一个、两个或其任何组合。本文所用术语“包括”和“包含”可作为同义词使用。此外，应理解本申请公开衍生自本文所述结构和取代基的各种组合的单个化合物或化合物组就好像各化合物或化合物组单独列出那样相同的程度。因此，特定结构或特定取代基的选择属于本发明范围内。本发明所述的“结合域”或“结合区”可以是例如，具有特异性识别和结合生物分子 (如CD86)或一个以上相同或不同分子的复合物或装配体或聚集体(不论它是稳定的或是瞬时的，例如CD86/CD^复合物)的能力的任何蛋白质、多肽、寡肽或肽。这类生物分子包括蛋白质、多肽、寡肽、肽、氨基酸或其衍生物；脂质、脂肪酸或其衍生物；碳水化合物、糖类或其衍生物；核苷酸、核苷、肽核酸、核酸分子或其衍生物；糖蛋白、糖肽、糖脂、脂蛋白、蛋白脂类或其衍生物；生物样品中可能存在的其它生物分子；或者它们的任何组合。结合区包括生物分子或其它感兴趣靶点的任何天然产生、合成、半合成或重组产生的结合伙伴。已知鉴定特异性结合特定靶点的本发明的结合域的各种试验，包括FACS、Western印迹、ELISA 或Biacore分析。如果本发明的结合域和其融合蛋白结合靶分子的亲和力或Ka(即特定结合相互作用的平衡结合常数，单位是1/M)例如大于或等于约IO5M-1UO6M-1UO7M-1UO8M-1UO9M-^ IOiqM-1UO11M-1UO12M-1或IO13M-1,则它们能够以所需程度结合，包括“特异性或选择性结合”靶点，而不显著结合测试样品中的其它组分。“高亲和力”结合域指&为至少κΛτ1、至少 10 -1、至少IO9M-1、至少IOkT1、至少ΙΟ、—1、至少IO12M-1A至少IO13M"1或更大的结合域。或者，亲合力可定义为特定结合相互作用的平衡解离常数(Kd)，单位是M (例如10_5Μ-10_13Μ)。 本发明所述结合域多肽和融合蛋白的亲和力可采用常规技术很容易地测定(参见例如， Scatchard 等(1949)Ann. N. Y. Acad. Sci. 51 :660 ；和美国专利号 5，283，173,5, 468，614 或等效物)。可如本文所述或通过本领域已知的各种方法产生本发明的结合域(参见例如，美国专利6，四1，161,6, 291, 158)。来源包括来自各种物种，包括人、驼科动物(来自骆驼、 单峰路马它或美洲马它；Hamers-Casterman 等(1993) Nature，363 :446 和 Nguyen 等(1998) J. Mol. Biol.，275 :413)、鲨鱼(Roux 等(1998) Proc. Nat' 1. Acad. Sci. (USA) 95 :11804)、 鱼(Nguyen等Q002) Immunogenetics，54 :39)、啮齿动物、禽类、绵羊的抗体基因序列(形式可以是sFv、scFv或Fab，如噬菌体文库中的情况)，编码随机肽文库的序列或编码其它替代性非抗体支架的环区域中工程改造的多种氨基酸的序列，如血纤蛋白原结构域(参见例如，Weisel等(1985) Science 230 :1388)、库尼茨(Kunitz)结构域(参见例如，美国专利6，423，498)、脂质运载蛋白结构域(参见例如，WO 2006/095164)、V样结构域(参见例如，美国专利申请公开号2007/006M31)、C-型凝集素结构域Qelensky和GreadH2005) FEBS J. 272 :6179)、mAb2 或 Fcab (参见例如 PCT 专利申请公开号 WO 2007/098934、WO 2006/072620)或类似序列。此外，也可采用例如将合成的单链⑶86作为方便系统(例如， 小鼠、HuMAb小鼠 、TC小鼠 、KM-小鼠 、美洲驼、鸡、大鼠、仓鼠、家兔等)中的免疫原的杂交瘤开发传统策略来开发本发明的结合域。除非另有说明，抗体技术领域技术人员理解的术语各自具有所述领域获得的含义。例如，术语和“VH”分别指衍生自抗体轻链和重链的可变结合区。可变结合区由离散的良好限定的亚区域构成，这些区域称为“互补决定区”(CDR)和“框架区”(FR)。术语 “CJ和“C/指“免疫球蛋白恒定区”，即分别指衍生自抗体轻链或重链的恒定区，后者还理解为根据衍生该区域的抗体的同种型(IgA、IgD、IgE、IgG、IgM)进一步分为CH1、CH2、CH3和 CH4恒定区结构域。恒定区结构域的一部分构成Fc区(“可结晶片段”区)，其包含负责免疫球蛋白效应物功能如ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)、CDC(补体依赖性细胞毒性)和补体结合、与Fc受体结合、相对于缺乏Fc区的多肽体内半衰期延长、蛋白A结合、可能甚至是胎盘转移的结构域(参见Capon等(1989) Nature，337 :525)。此外，含有Fc区的多肽能够发生多肽的二聚化或多聚化。“绞链区”在本文也称为“接头”，它是插于抗体单链的可变结合区和恒定区之间并连接二者的氨基酸序列，本领域已知它以绞链形式为抗体或抗体样分子提供柔性。免疫球蛋白的结构域结构适合工程改造，可在免疫球蛋白分子不同类和亚类之间交换抗原结合域和产生效应物功能的结构域。有关免疫球蛋白结构和功能的综述参见例如 Harlow等编，《抗体实验室手册(Antibodies =A Laboratory Manual)》，第14章(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，1988)。 有关重组抗体技术的各方面的大量介绍和详细信息可参见教科书《重组抗体》(约翰韦利森出版社(John Wiley & Sons)，纽约，1999)。有关抗体工程的详细实验方案的全面集合可参见 R. Kontermann 和 S. Dubel 编，《抗体工程实验室手册(The Antibody Engineering LabManual)》(施普林格出版社(Springer Verlag)，海德堡/纽约，2000)。其它相关方案还可参见马萨诸塞州波士顿的约翰韦利森出版社出版的《当代免疫学方案(Current Protocols in Immunology)》(2009 年 8 月)。本文所用的“衍生物”指化学或生物学改性形式的化合物，其结构类似于母体化合物且(实际或理论上)可从该母体化合物获得。通常，“衍生物”不同于“类似物”，母体化合物可以是产生“衍生物”的原料，但母体化合物不一定用作产生“类似物”的原料。类似物可具有与母体化合物不同的化学或物理性质。例如，与母体化合物相比，衍生物可能亲水性更高或反应性改变(例如具有改变其靶点亲和力的氨基酸改变的CDR)。术语“生物学样品”包括来自对象或生物来源的血样、活检样品、组织外植体、器官培养物、生物流体(例如，血清、尿液、CSF)或任何其它组织或细胞或其它制备物。对象或生物来源可以是例如，人或非人动物、原代细胞培养物或适合培养的细胞系，包括可含有染色体整合的或附加体形式的重组核酸序列的遗传工程改造细胞系、体细胞杂交细胞系、永生化或可永生化细胞系、分化或可分化细胞系、转化的细胞系或类似细胞系。在本发明的其它实施方式中，对象或生物来源可疑似患有疾病、失调或病症，或处于患上疾病、失调或病症的风险中，所述疾病、失调或病症包括恶性疾病、失调或病症或B细胞疾病。在某些实施方式中，对象或生物来源可疑似患有过度增殖、炎症或自身免疫疾病或者处于发生这些疾病的风险中，在本发明某些其它实施方式中，对象或生物来源可以是已知不具患这样的疾病、 失调或病症的风险，或不存在这样的疾病、失调或病症。CD86 结合域如本文所述，⑶86包含作为免疫球蛋白超家族成员的I型膜蛋白。⑶86由抗原呈递细胞表达，其为两种T细胞蛋白⑶观和CTLA4的配体。⑶观与⑶观的结合是T细胞激活作用的共刺激信号，而CM8与CTLA4的结合则下调T细胞激活作用并降低免疫应答。可变剪接产生编码不同同种型的两种转录物变体(Genbank登录号NP_787058. 3和 NP_008820. 2)。本发明的⑶86结合域可阻断⑶86结合⑶观，由此下调T细胞激活作用。所考虑的⑶86结合域包括CTLA4胞外结构域或其亚结构域、⑶观胞外结构域或其亚结构域、⑶86 特异性抗体衍生结构域(如衍生自FUNl单克隆抗体(参见例如，J Pathol. 1993年3月； 169(3) =309-15)；或衍生自3D1抗CD86单克隆抗体)。在一些实施方式中，⑶86结合域是人CTLA4 (Genebank登录号NP_0052(^)的胞外结构域(“胞外域”)，如SEQ ID NO :1的成熟多肽序列(信号肽氨基酸1-37)。不含信号肽的CTLA4胞外域的氨基酸序列见SEQ ID NO :410所提供。申请人注意到某些研究显示CTLA4 胞外域的成熟多肽从SEQ ID NO :1第38位的甲硫氨酸开始，其它研究显示所述成熟多肽从第37位的丙氨酸开始。在其它实施方式中，CD86结合域是经突变以使对CD86的亲和力高于野生型或非突变型CTLA4的CTLA4胞外域，如例如美国专利申请公开号US 2003/0035816 所公开的。在某些实施方式中，突变CTLA4胞外域在SEQ ID NO :410的第四位氨基酸包含丙氨酸或酪氨酸，和/或在第104位包含谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸、亮氨酸或苏氨酸。h2m L104E CTLA 4胞外域变体的氨基酸序列见SEQ ID NO :411所提供。在某些实施方式中，⑶86结合域是CTLA-4可变样结构域，如SEQ ID NO :3提供的序列；或 CTLA-4 可变样结构域的 CDR，如 SEQ ID NO :4 (CDRl)、SEQ ID N0:5(CDR2)或 SEQ IDN0:6(⑶R3)。这样的⑶R见例如美国专利7，405，288描述。在替代性实施方式中，CD86结合域是CD28胞外结构域(“胞外域”)(Genbank登录号ΝΡ_006130· 1)，如SEQ ID NO 2提供的序列。SEQ ID NO :2的氨基酸1-18是信号肽。不含信号肽的CD^胞外域的氨基酸序列见SEQ ID NO 412所提供。在其它实施方式中，CD86结合域包含具有CD86特异性的单链免疫球蛋白样结构域，如scFv。在某些实施方式中，所述CD86结合域包含来自单克隆抗体FUNl或3D1的轻链和重链可变结合域。来自FUNl和3D1抗⑶86单克隆抗体的重链、轻链、scFv接头和⑶R 的序列分别见SEQ NO =305-313和318-3 所示，可用于本发明的交叉受体分子。在一方面，本发明的CD86结合域或其融合蛋白具有CD86特异性，其亲和力的离解常数(Kd)为约IO3M到小于约10_8M。在某些优选实施方式中，所述CD86结合域或其融合蛋白与⑶86结合的亲和力为约0. 3 μ M。在一个示例性实施例中，可利用Fab片段噬菌体文库(参见例如，Hoet等Q005) Nature Biotechnol. 23 344)，通过筛选与合成或重组的CD86 (使用GenBank登录号 NP_787058. 3或NP_008820. 2所示的氨基酸序列或其片段)的结合，鉴定本发明的⑶86结合域。在某些实施方式中，用于产生⑶86结合域的⑶86分子还可包含本文所述的间插结构域或二聚化结构域，如免疫球蛋白Fc结构域或其片段。在一些实施方式中，本发明的⑶86结合域包含本文所述的V1^nt结构域(例如，FUNU3D 1或其人源化衍生物)。其它示例性Vh和Vl结构域包括美国专利6，827，934 所述的结构域。在某些实施方式中，所述％和\结构域是人的结构域。在其它实施方式中，提供的本发明CD86结合域具有与SEQ NO :305和306、SEQ NO :318和319或美国专利 6，827，934(通过引用纳入本文)公开序列的一种或多种轻链可变区或一种或多种重链可变区(Vh)或二者的氨基酸序列至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、 至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99. 5%或至少100%相同的序列，其中各CDR可具有0、1、2或3个氨基酸改变(即多数改变位于框架区中)。在两种或多种多肽或核酸分子序列中，术语“相同，，或“相同性百分数”指在比较窗口或指定区域上，采用本领域已知方法如序列比较算法，通过手工比对或目测检查来比较和比对最大对应性时，两个或多个序列或子序列在指定区域相同或其中有一定百分数的氨基酸残基或核苷酸相同(例如，60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%相同)。例如，适合测定序列相同性百分数和序列相似性百分数的优选算法是BLAST和BLAST 2. 0算法，分别见Altschul等(1977) Nucleic Acids Res. 25 :3389 和 Altschul 等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403 所述。在本文所述的可能需要\和Vh结构域的任何这些或其它实施方式中，\和Vh结构域可以任何取向排列，可由本文所述的最多约30个氨基酸的接头或能够提供与两个亚结合域相互作用相容的间隔物功能的任何氨基酸序列分隔开。在某些实施方式中，连接Vh 和 Vl 结构域的接头包含 SEQ ID NO :43-166、244、307、320、355-379 和 383-398 中一个或多个所示的氨基酸序列，如接头46 (SEQ ID NO :88)、接头130 (SEQ ID NO 163)、接头131 (SEQ ID NO :164)、接头115 (SEQ ID NO :148)或SEQ ID NO :244中提供的接头。多特异性结合域将具有至少两个特异性亚结合域，其类似于驼类抗体组成；或具有至少四个特异性亚结合域，其类似于成对Vh和\链的更常规的哺乳动物抗体组成。
本领域以多种方式定义了 CDR，包括Kabat、Chothia、AbM和接触定义。Kabat定义基于序列可变性，是预测CDR区的最常用定义(Johnson等(2000) Nucleic Acids Res. 28 214)。Chothia 定义基于结构环区域的位置(Chothia 等(1986) J. Mol. Biol. 196 901 ； Chothia等(1989)Nature 342 :877)。AbM定义在Kabat和Chothia定义之间作出妥协，它是牛津分子集团Oxford Molecular Group)开发的用于抗体结构建模的完整程序包(Martin 等(1989) Proc. Nat' 1. Acad. Sci. (USA) 86 :9268 ；Rees 等，ABMTM，“用于抗体可变区建模的 i十算机禾呈序(a computer program for modeling variable regions of antibodies) ”， Oxford, UK ；牛津分子公司(Oxford Molecular, Ltd.))。近来引入了称为接触定义的另外一种定义(参见MacCallum等(1996) J. Mol. Biol. 5 :732)，该定义基于对可用复合物晶体结构的分析。按照惯例，重链中的⑶R结构域称为HI、H2和H3，它们是从氨基末端向羧基末端顺序编号的。⑶R-Hl长度约为10-12个残基，根据Chothia和AbM定义从Cys之后4个残基处开始，或根据Kabat定义从其后5个残基处开始。Hl后可接Trp、Trp-Val、Trp-Ile 或Trp-Ala。根据AbM定义，Hl的长度约为10-12个残基，而Chothia定义则排除了最后四个残基。根据Kabat和AbM定义，⑶R-H2从Hl末端后15个残基处开始，通常其前接序列Leu-Glu-Trp-Ile-Gly (但已知多个变异)且通常后接序列Lys/Arg-Leu/Ile/Val/Phe/ Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala。根据Kabat定义，H2的长度为约16-19个残基，而AbM定义预测所述长度为9-12个残基。CDR-H3通常从H2末端后33个残基处开始，通常前接氨基酸序列Cys-Ala-Arg且后接氨基酸Gly，其长度范围是3到约25个残基。按照惯例，轻链中的CDR区称为Ll、L2和L3，它们是从氨基末端向羧基末端顺序编号的。⑶R-Ll (长度约为10-17个残基)通常从约残基M处开始，并通常前接Cys。⑶R-Ll之后的残基总是 ^Ρ，以其开始以下序列中的一种Trp-Tyr-Gln、Trp-Leu-Gln, Trp-Phe-Gln 或Trp-Tyr-Leu。⑶R_L2 (长度约为7个残基)从Ll末端后约16个残基处开始，通常前接残基Ile-Tyr、Val-Tyr, Ile-Lys或Ile-Phe。CDR-L3通常从L2末端后33个残基处开始， 通常前接Cys，且通常后接序列Phe-Gly-XXX-Gly，其长度约为7_11个残基。因此，本发明的结合域可包含来自抗⑶86抗体的可变区的单个⑶R，或其可包含多个相同或不同的CDR。在某些实施方式中，本发明的结合域包含具有CD86特异性的Vh* Vl结构域，其包含框架区以及CDR1、CDR2和CDR3区，其中(a)所述Vh结构域包含重链CDR3 的氨基酸序列；或(b)所述\结构域包含轻链CDR3的氨基酸序列；或(c)所述结合域包含(a) 氨基酸序列和(b)的\氨基酸序列；或所述结合域包含(a) 氨基酸序列和(b)的八氨基酸序列，且其中Vdn八发现于同一参比序列中。在其它实施方式中，本发明的结合域包含具有⑶86特异性的V1^P \结构域，其包含框架区以及⑶R1、⑶R2和⑶R3 区，其中(a)所述Vh结构域包含重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列；或(b)所述\结构域包含轻链⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列；或(c)所述结合域包含(a)的Vh氨基酸序列和(b)的\氨基酸序列；或所述结合域包含(a) 氨基酸序列和(b)的\氨基酸序列，其中所述Vh和\氨基酸序列来自同一参比序列。在本文所述的包含特异性CDR的任何实施方式中，结合域可包含(i) Vh结构域，其具有与Vh结构域的氨基酸序列至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%或99%相同的氨基酸序列；或(ii)八结构域，其具有与八结构域的氨基酸序列至少 80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99%相同的氨基酸序列；或(iii)同时包含⑴的Vh结构域和(ii)的八结构域；或同时包含⑴结构域和(ii)的\结构域，其中V1^Pt来自同一参比序列，且各CDR具有最多3个氨基酸改变(即多个改变位于框架区中)。本发明交叉受体融合蛋白中的CD86结合域可以是免疫球蛋白样结构域，如免疫球蛋白支架。本发明考虑的免疫球蛋白支架包括scFv、结构域抗体或仅含重链的抗体。在 scFv中，本发明考虑到重链和轻链可变区由本文所述或本领域已知的任何接头肽连接，以与结合分子中连接的结构域或区域相容。示范性接头是基于GlyJer接头基序的接头，例如 (GlyJer)n，其中η = 1-5。如果本发明融合蛋白的结合域基于非人免疫球蛋白或包含非人 CDR,则所述结合域可根据本领域已知方法“人源化”。或者，本发明融合蛋白的CD86结合域可以是除免疫球蛋白支架以外的支架。本发明考虑的其它支架能以功能性构象呈递CD86特异性CDR。所考虑的其它支架包括但不限于Α结构域分子、纤连蛋白III结构域、抗脂质运载蛋白(anticalin)，锚蛋白重复工程改造的结合分子、腺连蛋白(adnectin)，库尼茨(Kimitz)结构域或蛋白AZ结构域亲和体 (affibody)。ILlO如上所述，在某些实施方式中，本发明提供含有作为ILlO激动剂(即可提高ILlO 信号传导)的结合区或结合域的多肽。在一些实施方式中，ILlO激动剂结合域是ILlO或 ILlOFc，或其功能性亚结构域。在其它实施方式中，所述ILlO激动剂结合域是特异性结合 ILlORl或IL10R2的单链结合蛋白，如scFv。在一些实施方式中，所述ILlO激动剂结合域是包含SEQ ID NO 7第87位点突变，如从“ I ”变为“A”或“S” (本文分别称为I87A或I87S) 的ILlO0已知187变体ILlO分子与野生型ILlO相比免疫刺激性较小(Ding等，J. Exp. Med. 191 :213，2000)。此外，ILlO通常形成同型二聚体，其中某一单体分子的氨基末端结构域结合于另一个单体羧基末端结构域。在一个实施方式中，所述ILlO激动剂结合域是具有较短接头(gggsgg SEQ ID NO 379)的ILlO分子，所述接头将所述分子的两个亚结构域 (氨基和羧基末端结构域)分隔开，以使这些亚结构域可形成分子内二聚体，也对其进行检测。这些在本文称为单ILlO分子。ILlO (Genbank 登录号 ΝΡ_000563· 1 ；SEQ ID NO 7)是共享 α -螺旋结构的细胞因子超家族的成员。SEQ ID NO :7的氨基酸1-18是前体ILlO蛋白的信号肽。成熟IL 10 蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO :418所提供。虽然不存在经验证据，但据提示所有家族成员均具有 6 个 α -螺旋(Fickenscher, H.等，(2002) Trends Immunol. 23 :89)。ILlO 含有 4个半胱氨酸，其中只有一个在家族成员中具有保守性。由于ILlO显示了有助于二聚化的 V-形折叠，因此看来二硫键对该结构并不重要。家族成员与ILlO的氨基酸相同性在20% (IL-19)到沘％ (IL-20)之间变化(Dumouter 等，Q002)Eur. Cytokine Netw. 13 :5)。ILlO最初被描述为小鼠中抑制Thl细胞生产IFN-α和GM-CSF细胞因子的Th2 细胞因子(Moore 等，2001，Annu. Rev. Immunol. 19 :683 ；Fiorentino 等(1989) J.Exp· Med. 170 :2081)。人ILlO的长度为178个氨基酸，含有18个氨基酸的信号序列和160个氨基酸的成熟区段。其分子量为约ISkDa(单体)。人ILlO不含潜在的N连接糖基化位点， 且不发生糖基化(Dumouter 等，Q002)Eur. Cytokine Netw. 13 :5 ；Vieira 等(1991)Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88:117幻。其含有4个半胱氨酸残基，形成两个链内二硫键。一个单体的螺旋A- > D与第二单体的螺旋E和F发生非共价相互作用，形成非共价的V形同型二聚体。已对ILlO分子上的功能性区域作图。在N末端，前螺旋A残基#1-9参与肥大细胞增殖，而在C-末端，螺旋F残基#152-160介导白细胞分泌和趋化性。已知表达ILlO的细胞包括⑶8+T细胞、小胶质细胞、⑶14+ (但非⑶16+)单核细胞、Th2⑶4+细胞(小鼠)、角质形成细胞、肝星状细胞、Thl和Th2⑶4+T细胞(人)、黑色素瘤细胞、活化的巨噬细胞、NK细胞、树突细胞、B细胞(CD5+和CD19+)和嗜酸性粒细胞。现在认为，最初观察到ILlO对T细胞IFN-γ产生的抑制作用是辅助细胞介导的间接作用。然而，对T细胞的其它作用包括IL10诱导的CD8+T细胞趋化性、CD4+T细胞向IL-8的趋化性的抑制作用、激活后的IL-2产生的抑制作用、通过Bcl-2上调对T细胞凋亡的抑制作用和伴随⑶观共刺激的低抗原暴露后的T细胞增殖的中断作用(Akdis等，Q001) Immunology 103 131)。ILlO对B细胞具有多个相关但独特的功能。ILlO能与TNF-β和⑶40L—起诱导幼稚(IgD+)B细胞产生IgA。据信，TGF-β/⑶40L促进类型转换，而ILlO启动分化和生长。不存在TGF- β时，ILlO与⑶40L协作诱导IgGl和IgG3 (人)，因此可能是IgG亚型的直接转换因子。有趣的是，ILlO对IL-4诱导的IgE分泌具有分歧作用。如果ILlO在IL-4 诱导类型转换时存在，则其能逆转所述作用；如果其在IgE定型后存在，其会增加IgE的分泌。最后，ILlO存在下的⑶27/⑶70相互作用会促进由记忆B细胞形成浆细胞(Agematsu 等(1998)Blood 91 :173)。肥大细胞和NK细胞也受ILlO的影响。ILlO能诱导肥大细胞释放组胺，同时阻断其释放GM-CSF和TNF-α。该作用可以是自分泌，因为已知大鼠的肥大细胞能释放IL10。 作为其多效性的证据，ILlO对NK细胞具有相反的作用。ILlO实际上能促进NK细胞产生 TNF- α和GM-CSF，而非阻断该功能。此外，它能增强IL-2诱导的NK细胞增殖并促进IL-18 致敏的NK细胞分泌IFN- γ。与IL-12和/或IL-18 —致，ILlO能增强NK细胞的细胞毒性 (Cai 等，1999，Eur. J. Immunol. 29 :2658)。ILlO对嗜中性粒细胞有显著的抗炎作用。它能抑制趋化因子MIP-I α ,MIP-I β和 IL-8的分泌，并阻断促炎介导物IL-I β和TNF-α的产生。此外，它能降低嗜中性粒细胞产生超氧化物的能力，因而会干扰PMN介导的抗体依赖性细胞毒性。它也阻断IL-8和fMLP诱导的趋化性，可能通过CXCRl发挥该作用(Vicioso等，(1998) Eur. Cytokine Netw. 9 247)。ILlO通常对树突细胞(DC)具有免疫抑制作用。它显示以DC为代价促进⑶14+巨噬细胞分化。ILlO似乎能降低DC刺激T细胞，特别是Thl型细胞的能力。相对于MHC-II 表达，它可能被下调、不变或上调(Sharma等，(1999) J. Immunol. 163 :5020)。至于CD80和 ⑶86，ILlO能上调或下调其表达。B7-2/⑶86在T细胞激活中起到关键作用。就该分子而言，ILlO同时参与其上调和下调作用。然而，最显著的调节作用也许出现在⑶40上(IL10 显示降低其表达)。在区域水平，ILlO可通过响应于促炎细胞因子抑制朗格汉斯细胞迁移而阻断免疫刺激。或者，ILlO阻断炎症诱导的DC成熟步骤，所述步骤通常包括CCR1、CCR2 和CCR5下调以及CCR7上调。该阻断作用连同CCR1、CCR2和CCR5的保持导致DC无法迁移到区域性淋巴结。结果是产生不会刺激T细胞但会结合(和清除)促炎趋化因子而不对其产生应答的不移动的 DC(D-Amico 等，Q000)Nat. Immunol. 1 :387)。
已报道ILlO对单核细胞具有多种作用。例如，ILlO显示能明显降低细胞表面 MHC-II的表达。其还在刺激后抑制IL-12的产生。虽然它能与M-CSF联合促进单核细胞向巨噬细胞转变，但巨噬细胞的表型不明显(即CD16+/细胞毒性相对CD16-)。ILlO也能降低单核细胞的GM-CSF分泌量和IL-8产量，同时促进IL-Ira的释放(Gesser等，(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA94 :14620)。透明质粘连蛋白是结缔组织的组分，已知它由单核细胞响应于ILlO而分泌。这可能对细胞迁移，特别是肿瘤细胞转移具有重要影响，已知透明质粘连蛋白能破坏细胞通过胞外空间的迁移((Cesser等，(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 :14620)。已显示ILlO与鼠或猕猴Fc区的融合蛋白(称为ILlOFc)能抑制巨噬细胞功能并延长胰岛异源移植体的存活(Feng 等(1999)Transplantation68 :1775 ；Asiedu 等(2007) Cytokine 40 183)，并减轻鼠模型中的败血性休克(Zheng等(1995) J. Immunol. 154 5590)。人ILlORl是90_110kDa的、I型单次跨膜糖蛋白，其表达于有限数量的细胞类型 (Liu等，1994，J. Immunol. 152 :1821)。在胰、骨骼肌、脑、心和肾中观察到弱表达。胎盘、肺和肝显示中等水平。单核细胞、B细胞、大粒淋巴细胞和T细胞高水平表达(Liu等，1994， J. Immunol. 152 :1821)。表达的蛋白是578个氨基酸的蛋白，其包含21个氨基酸的信号肽、 215个氨基酸的胞外区、25个氨基酸的跨膜区和317个氨基酸的胞质结构域。胞外区内存在两个FNIII基序，胞质域内存在STAT3停靠位点和JAKl结合区(Kotenko等，20000ncogene 19 2557 ；Kotenko 等，1997，EMBO J. 16 :5894)。ILlORl 结合人 ILlO 的 Kd 为 200pM。在一些实施方式中，本发明的结合域包含如本文所述具有ILlORl或IL10R2特异性的\和Vh结构域。在某些实施方式中，所述\和Vh结构域是人的结构域。结构域可以任何取向排列，并可由本文所述的至多约30个氨基酸的接头或能够提供与两个亚结合域相互作用相容的间隔物功能的任何其它氨基酸序列分隔开。在某些实施方式中，连接 Vl 和 Vh 结构域的接头包含 SEQ ID NO :43-166、244、307、320、355_379 和 383-398 中所示的氨基酸序列，如SEQ ID NO 244中提供的接头、接头46 (SEQ ID NO 88)、接头130 (SEQ ID NO 163)或接头131 (SEQ ID NO :164)。多特异性结合域可具有至少2个特异性亚结合域，其类似于驼类抗体组成；或具有至少4个特异性亚结合域，其类似于成对\和Vh链的更常规哺乳动物抗体组成。在其它实施方式中，本发明具有ILlORl或IL10R2特异性的结合域可包含一个或多个互补决定区(“OTR")，或多个拷贝的一种或多种这类⑶R，这类⑶R 由抗-ILlORl或抗IL10R2的scFv或Fab片段可变区或其重链或轻链可变区获得、衍生或设计出。因此，本发明的结合域可包含来自抗-ILlORl或抗-IL10R2的可变区的单个⑶R， 或可包含多个相同或不同的CDR。在某些实施方式中，本发明的结合域包含具有ILlORl或 IL10R2特异性的\和Vh结构域，其包含框架区和CDR1、CDR2和CDR3区。HLA-G如上所述，在某些实施方式中，本发明提供含有作为HLA-G激动剂(即可提高ILlO 信号传导)的结合区或结合域的多肽。在一些实施方式中，所述HLA-G激动剂结合域是 HLA-Gl (SEQ ID NO 14)、HLA_G5 (SEQ ID NO :15)或HLA-G突变蛋白，其中成熟蛋白第 147位的半胱氨酸突变为替代氨基酸例如丝氨酸。HLA-Gl和HLA-G5的氨基酸1- 和1_23分别表示信号肽。在其它实施方式中，所述HLA-G激动剂结构域是HLA-Gl或HLA-G5的胞外域，含或不含通过柔性接头与N末端连接的β-2微球蛋白。这样接头的例子包括SEQ ID NO 43-166、244、307、320、355-379和383-398提供并在以下描述的接头。可溶性HLA-Gl的制备见美国专利申请公开号US2004/0044182所述。在其它实施方式中，所述HLA-G激动剂结合域是与ILT2、ILT4或KIR2DL4特异性结合的免疫球蛋白可变结合域或其衍生物(例如，抗体、Fab、scFv或类似衍生物)。具有 ILT2、ILT4或IQR2DL4特异性的抗体包括例如，美国专利申请公开号US 2003/0232051中描述的抗体。人白细胞抗原G(HLA-G)是非经典主要组织相容性复合体(MHC) I型分子，其为由重链和轻链(β_2微球蛋白)组成的异型二聚体，其中重链锚着在膜上。HLA-G作为保护胎儿组织免受母体免疫系统攻击的免疫调节分子发挥作用。尽管HLA-G组成性表达仅限于胎儿组织、成人胸腺髓质、角膜、胰岛、红细胞和内皮细胞前体，但可在癌症、移植、多发性硬化、炎性疾病和病毒感染中诱导其表达。HLA-G初级转录物产生编码膜结合蛋白同种型 HLA-G 1、-G2、-G3和-G4以及可溶性蛋白质同种型HLA-G5、HLA_G6和HLA-G7的7种选择性 mRNA，其中HLA-G5是细胞表面结合HLA-Gl蛋白的可溶性形式。尽管HLA-G似乎不具有显著的免疫刺激功能，但已显示其结合抑制性受体，即 ILT2、ILT4、KIR2DL4和⑶8，并由此与B细胞、T细胞、NK细胞和抗原呈递细胞发生相互作用。HLA-G的二聚体形式对ILT2的亲和力比对ILT4、IQR2DL4或⑶8的亲和力高出若干数量级。已显示HLA-Gl抑制子宫和外周血NK细胞的溶细胞功能、细胞毒性T淋巴细胞的抗原特异性溶细胞功能、CD4+T细胞的同增殖(alloproliferative)应答、T细胞和外周血NK细胞的增殖、树突细胞的成熟和功能(参见例如，Wiendl等(2003)Blood, 126 :176-185)。已表明HLA-G可用于降低CNS中与多发性硬化相关的炎症应答(Wiendl等Q005) Blood，128 2689-2704)，并作为促进移植中移植物耐受性的治疗剂(Carosella^ (2008)Blood 111 4862-4870)。在一些实施方式中，本发明的结合域包含如本文所述具有ILT2、ILT4或KIR2DL4 特异性的&和Vh结构域。在某些实施方式中，所述\和Vh结构域是人的结构域。
结构域可以任何取向排列，并可由本文所述的至多约30个氨基酸的接头或能够提供与两个亚结合域相互作用相容的间隔物功能的任何其它氨基酸序列分隔开。在某些实施方式中，连接 Vl 和 Vh 结构域的接头包含 SEQ ID NO :43-166、244、307、320、355_379 和 383-398 中一个或多个所示的氨基酸序列，如接头115 (SEQ ID NO 148), SEQ ID NO :244中提供的接头、接头 46 (SEQ ID NO :88)、接头 130 (SEQ ID NO :163)或接头 131 (SEQ ID NO :164)。多特异性结合域可具有至少2个特异性亚结合域，其类似于驼类抗体组成；或具有至少4个特异性亚结合域，其类似于成对\和Vh链的更常规哺乳动物抗体组成。在其它实施方式中，本发明的ILT2、ILT4或KIR2DL4特异性结合域可包含一个或多个互补决定区(“OTR")，或多个拷贝的一种或多种这类⑶R，这类⑶R是抗ILT2、抗 ILT4或抗KIR2DL4的scFv或Fab片段可变区或其重链或轻链可变区获得、衍生或设计出。 因此，本发明的结合域可包含来自抗ILT2、抗ILT4或抗KIR2DL4的可变区的单个⑶R，或可包含多个相同或不同的CDR。HGF如上所述，在某些实施方式中，本发明提供含有作为HGF激动剂(即可提高HGF信号传导)的结合区或结合域的多肽。在一些实施方式中，所述HGF激动剂结合域是HGF或其功能性亚结构域。肝细胞生长因子(HGF)通过在结合原癌基因c-Met受体后激活酪氨酸激酶信号级联放大来调节细胞生长、细胞运动性和形态发生。HGF影响多种细胞类型并调节各种生物活性，包括细胞因子的产生、细胞迁移、增殖和存活。HGF以单个无活性多肽的形式分泌， 被丝氨酸蛋白酶切割为69kDa的α链和34kDa的β链。α和β链之间的二硫键结合产生活性异型二聚体分子。HGF基因的可变剪接产生5种不同的同种型(同种型1-5 ；分别为 Genebank 登录号 ΝΡ_000592. 3、ΝΡ_001010931. 1、ΝΡ_001010932. 1、ΝΡ_001010933. 1 和 ΝΡ_001010934. 1 ； SEQ ID NO :18-22 ；这些序列中各自的氨基酸1-31是信号肽)。HGF被认为是预防和弱化疾病发展的关键因子(Ito等Q008) Int. Arch. Allergy Immunol. 146 Suppl 1:82-87)。例如，已显示HGF在小鼠中有效抑制胶原诱导的关节炎 (Okunishi等Q007)Jnl. Immunol. 179 :5504-5513)，在变应性气道炎症的小鼠模型中发挥保护作用(Okunishi 等 Q005)Jnl. Immunol. 175 :4745-4753 ；Ito 等 Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. (2005)32 :268-280) 在一些实施方式中，本发明的结合域包含如本文所述具有HGF特异性的\和Vh结构域。在某些实施方式中，所述\和Vh结构域是人的结构域。\和Vh结构域可以任何取向排列，并可由本文所述的至多约30个氨基酸的接头或能够提供与两个亚结合域相互作用相容的间隔物功能的任何其它氨基酸序列分隔开。在某些实施方式中，连接\和Vh结构域的接头包含SEQ ID NO :43-166、244、307、320、355-379和383-398中一个或多个所示的氨基酸序列，如SEQ ID NO :244中提供的接头、接头46 (SEQ ID NO :88)、接头130 (SEQ ID NO 163)或接头131 (SEQ ID NO :164)。多特异性结合域可具有至少2个特异性亚结合域， 其类似于驼类抗体组成；或具有至少4个特异性亚结合域，其类似于成对\和Vh链的更常规哺乳动物抗体组成。在其它实施方式中，本发明的HGF特异性结合域可包含一个或多个互补决定区(“OTR")，或者多个拷贝的一种或多种这类⑶R，这类⑶R由抗HGF的scFv 或Fab片段可变区或其重链或轻链可变区获得、衍生或设计出。因此，本发明的结合域可包含来自抗HGF可变区的单个CDR，或其可包含多个相同或不同的CDR。在某些实施方式中， 本发明的结合域包含具有HGF特异性的\和Vh结构域，其包含框架区以及⑶R1、⑶R2和 CDR3 区。IL35如上所述，在某些实施方式中，本发明提供含有作为IL35激动剂(即可提高IL35 信号传导)的结合区或结合域的多肽。在某些实施方式中，所述IL35激动剂结合域是 IL35(例如，SEQ ID NO 25禾口 26)或其功能性亚结构域。在某些实施方式中，所述IL35激动剂结合域是包含SEQ ID NO :25和沈序列的单链多肽或其亚结构域。这样的单链多肽可包含一个或多个接头，包括本文所述的接头。在其它实施方式中，所述IL35激动剂结合域是具有IL35激动剂活性的IL35R特异性的单链免疫球蛋白可变结构域，如scFv。IL-35是IL-12细胞因子亚家族的新近描述的细胞因子。异型二聚体分子由 IL-12p35和IL-27Ebi3亚基组成。近期已显示其在关节炎小鼠模型中为Treg功能的强效诱导物，且能够改变 TH17 应答(Niedbala 等 Q007)Eur. J. Immunol. 37 :3021 ；Collison 等 (2007)Nature 450 :566)。因此，预测IL-35激动作用和CD86抑制作用的结合可增加单独的⑶观抑制作用的治疗益处。调节T细胞(TREGQ是CD4+T细胞的关键亚群，其对保持自身耐受和预防自身免疫、限制慢性炎性疾病如哮喘和炎性肠病、调节稳态淋巴细胞扩增具有重要作用。IL35是抗炎细胞因子，已显示其通过刺激调节T细胞扩增和抑制Thl7细胞发育来抑制免疫应答 (Collison 等(2007)Nature450 :566-9)。IL35 是由 EB 病毒诱导基因 3(EBI3 ；SEQ ID NO 25 ；信号肽氨基酸1-20)和IL12的p35亚基(SEQ ID NO 26 ；信号肽氨基酸1_56)形成的异型二聚体(Devergne 等(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 :12041-12046 ；美国专利 5，830，451 ；美国专利申请公开号US 2007/0299026) 0已显示其在鼠胶原诱导关节炎模型中具有与 Enbre 1 等效的治疗作用(Niedbala 等(2007)Eur. J. Immunol. 37 :3021-3029)， 因此已提出将其作为对临床类风湿性关节炎的治疗剂。在一些实施方式中，本发明的结合域包含如本文所述具有IL35R特异性的\和Vh 结构域。在某些实施方式中，所述\和￥11结构域是人的结构域。\和￥11结构域可以任何取向排列，并可由本文所述的至多约30个氨基酸的接头或能够提供与两个亚结合域相互作用相容的间隔物功能的任何其它氨基酸序列分隔开。在某些实施方式中，连接\和Vh结构域的接头包含SEQ ID NO :43-166、244、307、320、355-379和383-398中一个或多个所示的氨基酸序列，如SEQ ID NO :244中提供的接头、接头46 (SEQ ID NO 88)、接头130 (SEQ ID NO 163)或接头131 (SEQ ID NO :164)。多特异性结合域可具有至少2个特异性亚结合域， 其类似于驼类抗体组成；或具有至少4个特异性亚结合域，其类似于成对\和Vh链的更常规哺乳动物抗体组成。在其它实施方式中，本发明的IL35R特异性结合域可包含一个或多个互补决定区(“OTR")，或者多个拷贝的一种或多种这类⑶R，这类⑶R由抗IL35R的 scFv或Fab片段可变区或其重链或轻链可变区获得、衍生或设计出。因此，本发明的结合域可包含来自抗IL35R可变区的单个CDR，或其可包含多个相同或不同的CDR。在某些实施方式中，本发明的结合域包含具有IL-35R特异性的\和乂11结构域，其包含框架区以及⑶R1、 CDR2 和 CDR3 区。LIGHT如上所述，在某些实施方式中，本发明提供含有作为LIGHT拮抗物(即可抑制 LIGHT信号传导)的结合区或结合域的多肽。在一些实施方式中，所述LIGHT拮抗物结合域是HVEM胞外域(也称为sHVEM ；SEQ ID NO 29 ；信号肽氨基酸1-38)或其功能性亚结构域。在其它实施方式中，所述LIGHT拮抗物结合域是LIGHT特异性单链免疫球蛋白样可变结构域，如scFv。在某些实施方式中，所述LIGHT拮抗物结构域是包含PCT专利申请公开号 WO 08/027338所述Vh和\结构域的单链免疫球蛋白样可变结构域。LIGHT是表达于活化T淋巴细胞、单核细胞、粒细胞和未成熟树突细胞的TNF 超家族成员。已报道了 LIGHT的两种不同的同种型(Genekmk登录号NP_003798. 2和 NP_742011. 1)。已显示LIGHT通过疱疹病毒进入介导物(HVEM)和淋巴毒素β受体(LT β R) 信号传导调节T细胞免疫应答。HVEM和LT β R均与LIGHT发生高亲和力结合，其中在T细胞、B细胞、天然杀伤细胞和内皮细胞检测到HVEM表达，LT β R在单核细胞和基质细胞但非T 细胞和B细胞中表达。已显示LIGHT是⑶观依赖性T细胞激活作用的共刺激分子，其优先诱导IFN-γ和GM-CSF的产生。在鼠模型中通过体内给予LT β R-Ig融合蛋白或抗LIGHT抗体阻断LIGHT导致T细胞介导的免疫应答降低，改善移植物抗宿主疾病(Tamada等Q000)Nat. Med. 6 :283-9)。LIGHT的组成性表达导致组织破坏和自身免疫样疾病综合征(Granger 禾口 Rickert(2003)Cytokine Growth Factor Rev. 14:289—96)。在一些实施方式中，本发明的结合域包含如本文所述具有LIGHT特异性的\和Vh 结构域。在某些实施方式中，所述\和￥11结构域是人的结构域。\和￥11结构域可以任何取向排列，并可由本文所述的至多约30个氨基酸的接头或能够提供与两个亚结合域相互作用相容的间隔物功能的任何其它氨基酸序列分隔开。在某些实施方式中，连接\和Vh结构域的接头包含SEQ ID NO :43-166、244、307、320、355-379和383-398中一个或多个所示的氨基酸序列，如SEQ ID NO :244中提供的接头、接头46 (SEQ ID NO 88)、接头130 (SEQ ID NO 163)或接头131 (SEQ ID NO :164)。多特异性结合域可具有至少2个特异性亚结合域， 其类似于驼类抗体组成；或具有至少4个特异性亚结合域，其类似于成对\和Vh链的更常规哺乳动物抗体组成。在其它实施方式中，本发明的LIGHT特异性结合域可包含一个或多个互补决定区 (“CDR")，或者多个拷贝的一种或多种这类⑶R，这类⑶R由抗LIGHT的scFv或Fab片段可变区或其重链或轻链可变区获得、衍生或设计出。因此，本发明的结合域可包含来自抗 LIGHT可变区的单个CDR，或其可包含多个相同或不同的CDR。在某些实施方式中，本发明的结合域包含LIGHT特异性\和Vh结构域，其包含框架区以及⑶R1、⑶R2和⑶R3区。PD-I如上所述，在某些实施方式中，本发明提供含有作为PD-I激动剂(即可提高PD-I 信号转导)的结合区或结合域的多肽。在一些实施方式中，所述PD-I激动剂结合域是 PDl-Ll (例如，SEQ ID NO 32 ；信号肽氨基酸 1-18)、PD1_L2 (例如，SEQ ID NO 33 ；信号肽: 氨基酸1-19)或其功能性亚结构域。在其它实施方式中，所述PD-I激动剂结合域是PD-I 特异性单链免疫球蛋白样可变结构域，如scFv。PD-I特异性抗体包括例如，美国专利申请公开号US 2006/0210567所述的抗体。PD-I (Genebank登录号NP_005009. 1)是表达于活化T细胞、B细胞和髓样细胞的⑶^/CTLA4家族成员。PD-I包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序。PD-I通过与程序性死亡1配体KPDl-Ll ；也称为⑶274)和程序性死亡1配体2(PD1_L2)结合发挥作用。 人的PD-Ll和PD-L2同时表达于未成熟和成熟的树突细胞、IFN-Y处理的单核细胞和滤泡性树突细胞上。PD-I缺陷小鼠显示各种自身免疫病理学，表明PD-I是免疫应答的负调节物(Nishimura 禾口 Honjo (2001) Trends Immunol. 2 :265 ；Nishimura 等(1999) Immunity 11 141)。已显示PD-I与PDl-Ll和PD1-L2的结合引起T细胞激活作用下调(Freeman等 (2000) J. Exp. Med. 192 :1027 ；Latchman 等(2001) Nat. Immunol. 2 :261 ；Carter 等(2002) Eur. J. Immunol. 32 :634)。在一些实施方式中，本发明的结合域包含如本文所述具有PD-I特异性的八和Vh 结构域。在某些实施方式中，所述\和￥11结构域是人的结构域。\和￥11结构域可以任何取向排列，并可由本文所述的至多约30个氨基酸的接头或能够提供与两个亚结合域相互作用相容的间隔物功能的任何其它氨基酸序列分隔开。在某些实施方式中，连接\和Vh结构域的接头包含SEQ ID NO :43-166、244、307、320、355-379和383-398中所示的氨基酸序列，如 SEQ ID NO :244 中提供的接头、接头 46 (SEQ ID NO :88)、接头 130 (SEQ ID NO :163) 或接头131 (SEQ ID NO :164)。多特异性结合域可具有至少2个特异性亚结合域，其类似于驼类抗体组成；或具有至少4个特异性亚结合域，其类似于成对\和Vh链的更常规哺乳动物抗体组成。在其它实施方式中，本发明的PD-I特异性结合域可包含一个或多个互补决定区 (“CDR")，或者多个拷贝的一种或多种这类⑶R，这类⑶R由抗PD-I的scFv或Fab片段可变区或其重链或轻链可变区获得、衍生或设计出。因此，本发明的结合域可包含来自抗 PD-I可变区的单个⑶R，或其可包含多个相同或不同的⑶R。BTLA如上所述，在某些实施方式中，本发明提供含有作为BTLA激动剂(即可提高BTLA 信号传导)的结合区或结合域的多肽。在一些实施方式中，所述BTLA激动剂结合域是HVEM 胞外域(也称为sHVEM ；SEQ ID NO 29 ；信号肽氨基酸1-38)或其功能性亚结构域(例如 SEQ ID而四的氨基酸讨-78)。在其它实施方式中，所述BTLA激动剂结合域是BTLA特异性单链免疫球蛋白样可变结构域，如scFv。BTLA特异性激动剂抗体见例如Krieg等Q005) J. Immunol. 175 :6420-6472 所述。BTLA (Genebank 登录号 ΝΡ_001078826. 1 和 NP_861445. 3 ；分别为同种型 2 和 1)是作为免疫球蛋白家族成员的细胞表面蛋白，表达于B细胞、T细胞和抗炎呈递细胞。BTLA的配体是疱疹病毒进入介导物(HVEM)，其为肿瘤坏死因子受体家族的成员并作为LIGHT的配体(Sedy 等(2005) Nat. Immunol. 6 :90-98)。已在 HVEM 的 CRDl 中鉴定出 BTLA 结合位点(SEQ ID NO 29的氨基酸54-78 ；PCT专利申请公开号WO 2006/063067).该位点不同于LIGHT 所用的位点但与HVEM的gD结合位点重叠。尽管HVEM与LIGHT结合诱导强免疫应答，但 HVEM与BTLA结合产生对T细胞应答的负调节作用(Murphy等Q006)Nat. Rev. Immunol. 6 671-681)。已显示BTLA与HVEM结合激活BTLA的酪氨酸磷酸化，由此诱导与蛋白质酪氨酸磷酸酶 SHP-I 和 SHP-2 结合(Gavrieli 等(2003)Biochem. Biophys. Res. Commun. 312 1236)，但一些数据对SHP募集是否负责BTLA的负调节活性存在疑问(Chemnitz等Q006) J.Immunol. 176 :6603-6614)。已显示可溶性HVEM抑制抗⑶3诱导的⑶4+T细胞增殖，该作用被抗BTLA抗体逆转(Gonzalez 等 Q005)Proc. Natl. Acad. ki. USA102 :1116-1121)。类似地，显示激动性抗BTLA单克隆抗体抑制抗⑶3介导的⑶4+T细胞增殖和细胞因子产生(Krieg等Q005) J. Immunol. 175 :6420-6472)。缺乏完整BTLA基因的小鼠显示对实验性自身免疫脑脊髓炎的敏感性升高(Watanabe等O00;3)Nat. Immunol. 4 :670-679)和气道炎症延长(D印pong等 (2006) J. Immunol. 176 :3909-3913)。在一些实施方式中，本发明的结合域包含如本文所述具有BTLA特异性的\和Vh 结构域。在某些实施方式中，所述\和￥11结构域是人的结构域。\和￥11结构域可以任何取向排列，并可由本文所述的至多约30个氨基酸的接头或能够提供与两个亚结合域相互作用相容的间隔物功能的任何其它氨基酸序列分隔开。在某些实施方式中，连接\和Vh结构域的接头包含SEQ ID NO :43-166、244、307、320、355-379和383-398中所示的氨基酸序列，如 SEQ ID NO :244 中提供的接头、接头 46 (SEQ ID NO :88)、接头 130 (SEQ ID NO :163) 或接头131 (SEQ ID NO :164)。多特异性结合域可具有至少2个特异性亚结合域，其类似于驼类抗体组成；或具有至少4个特异性亚结合域，其类似于成对\和Vh链的更常规哺乳动物抗体组成。
在其它实施方式中，本发明的BTLA特异性结合域可包含一个或多个互补决定区 (“CDR")，或者多个拷贝的一种或多种这类⑶R，这类⑶R由抗BTLA的scFv或Fab片段可变区或其重链或轻链可变区获得、衍生或设计出。因此，本发明的结合域可包含来自抗 BTLA可变区的单个⑶R，或其可包含多个相同或不同的⑶R。GITRL如上所述，在某些实施方式中，本发明提供含有作为GITRL拮抗物(即可抑制 GITRL信号传导)的结合区或结合域的多肽。在一些实施方式中，所述GITRL拮抗物结合域是GITR胞外域(也称为sGITR ；SEQ ID NO 39和40 ；这些序列各自的信号肽氨基酸 1-25)或其功能性亚结构域。在其它实施方式中，所述GITRL拮抗物结合域是GITRL特异性单链免疫球蛋白样可变结构域，如scFv。GITRL的拮抗物抗体见例如美国专利申请公开号 2005/0014224 所述。糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体(GITR;也称为AITR)是I型跨膜蛋白和 TNF 受体超家族的成员(Nocentini 等，(2007) Eur. J. Immunol. 37 :1165-69)。GITR 在 T 细胞增殖和TCR介导的凋亡中发挥重要作用。GITR表达在T细胞上上调，高水平的GITR在 CD4+CD25+调节T细胞上组成性表达(Kwon等Q003) Exp. Mol. Med. 35 :8_16)，表达也发生在巨噬细胞、B 细胞和 NK 细胞上(Liu 等(2008) J. Biol. Chem. 283 :8202-8210)。GITR 的关联配体GITRL在抗原呈递细胞如树突细胞和B细胞上组成性表达。已显示GITR与GITRL的结合使⑶4+⑶25_效应物T细胞对⑶4+CD25+调节T细胞的抑制作用具有耐受性。已显示通过GITRL或激动剂抗体激活GITR增加TCR诱导的T细胞增殖和细胞因子产生，并拯救T 细胞免于发生抗 CD3 诱导的凋亡(Nocentini et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA94 6216-6221)。此外，GITR与GITRL结合可抑制T调节细胞和/或使效应物T细胞对T调节细胞介导的抑制作用的耐受性增大(Kanamaru等Q004) J. Immunol. 172 :7306-7314)。研究表明，在实验性自身免疫脑脊髓炎的诱导期给予抗GITR显著增强临床疾病的严重程度并增加CNS炎症和自身反应T细胞应答(Kohm et al. (2004) J. Immunol. 172 4686-4690)。此外，激活GITR信号传导加剧鼠哮喘和胶原诱导的关节炎(Patel等Q005) Eur. J. , Immunol. 35 :3581-90)。在一些实施方式中，本发明的结合域包含如本文所述具有GITRL特异性的\和Vh 结构域。在某些实施方式中，所述\和￥11结构域是人的结构域。\和￥11结构域可以任何取向排列，并可由本文所述的至多约30个氨基酸的接头或能够提供与两个亚结合域相互作用相容的间隔物功能的任何其它氨基酸序列分隔开。在某些实施方式中，连接\和Vh结构域的接头包含SEQ ID NO :43-166、244、307、320、355-379和383-398中所示的氨基酸序列，如 SEQ ID NO :244 中提供的接头、接头 46 (SEQ ID NO :88)、接头 130 (SEQ ID NO :163) 或接头131 (SEQ ID NO :164)。多特异性结合域可具有至少2个特异性亚结合域，其类似于驼类抗体组成；或具有至少4个特异性亚结合域，其类似于成对\和Vh链的更常规哺乳动物抗体组成。在其它实施方式中，本发明的GITRL特异性结合域可包含一个或多个互补决定区 (〃 OTR")，或者多个拷贝的一种或多种这类⑶R，这类⑶R由抗GITRL的scFv或Fab片段可变区或其重链或轻链可变区获得、衍生或设计出。因此，本发明的结合域可包含来自抗 GITRL可变区的单个CDR，或其可包含多个相同或不同的CDR。在某些实施方式中，本发明的结合域包含GITRL特异性\和Vh结构域，其包含框架区以及⑶R1、⑶R2和⑶R3区。CD40 如上所述，在某些实施方式中，本发明提供含有作为CD40拮抗物(即可抑制CD40 信号传导)的结合区或结合域的多肽。在一些实施方式中，所述CD40拮抗物结合域是CD40 特异性单链免疫球蛋白样可变结构域，如scFv。CD40的拮抗物抗体见例如美国专利申请公开号 US 2008/0057070 和美国专利 5，874，082 和 6，838，261 所述。⑶40是发现于正常和肿瘤性B细胞、树突细胞、抗炎呈递细胞、内皮细胞、单核细胞和上皮细胞表面上的55kDa的细胞表面抗原。⑶40在抗原呈递细胞上的表达在辅助性 T细胞和细胞毒性T淋巴细胞的作用中发挥重要的共刺激作用。⑶40配体(⑶40L，也称为 ⑶154)在T细胞上的表达在正常免疫应答过程中上调。表达于T细胞的⑶40L与表达于B 细胞的CD40的结合引起B细胞增殖和分化、抗体产生、同种型转换和B细胞记忆产生。已显示人的抗CD40拮抗性抗体对人慢性淋巴细胞性白血病细胞具有抗白血病活性(Luqman 等(2008) Blood 112:711-720)。在一些实施方式中，本发明的结合域包含如例如美国专利申请公开号US 2008/0057070所述具有CD40特异性的\和Vh结构域。在某些实施方式中，所述\和Vh 结构域是人的结构域。\和Vh结构域可以任何取向排列，并可由本文所述的至多约30个氨基酸的接头或能够提供与两个亚结合域相互作用相容的间隔物功能的任何其它氨基酸序列分隔开。在某些实施方式中，连接八和Vh结构域的接头包含SEQ ID N0:43-166、244、 307,320,355-379和383-398中所示的氨基酸序列，如SEQ ID NO 244中提供的接头、接头 46 (SEQ ID NO :88)、接头 130 (SEQ ID NO 163)或接头 131(SEQ ID N0:164)。多特异性结合域可具有至少2个特异性亚结合域，其类似于驼类抗体组成；或具有至少4个特异性亚结合域，其类似于成对\和Vh链的更常规哺乳动物抗体组成。在其它实施方式中，本发明的CD40特异性结合域可包含一个或多个互补决定区 (〃 OTR")，或者多个拷贝的一种或多种这类⑶R，这类⑶R由抗⑶40的scFv或Fab片段可变区或其重链或轻链可变区获得、衍生或设计出。因此，本发明的结合域可包含来自抗 ⑶40可变区的单个⑶R，或其可包含多个相同或不同的⑶R。在一些实施方式中，本发明的结合域包含如例如美国专利申请公开号US 2008/0057070所述具有CD40特异性的\和Vh 结构域，其包含框架区以及⑶Rl、⑶R2和⑶R3区。多特异性融合蛋白本发明提供包含结合⑶86的结构域(“⑶86结合域”)和结合非⑶86分子的结构域(“异源结合域”)的多特异性融合蛋白。在某些实施方式中，所述异源结合域是IL-10 激动剂、HLA-G激动剂、HGF激动剂、IL-35激动剂、PD-I激动剂、BTLA激动剂、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或⑶40拮抗物。在某些实施方式中，所述异源结合域是IL-10激动剂，如IL10、ILlOFc或与ILlORl 或IL10R2特异性结合的单链结合域。在某些实施方式中，所述异源结合域是HLA-G激动剂， 如HLA-G1、HLA-G5、HLA-G突变蛋白或其功能区(如胞外域)、或与ILT2、ILT4或KIR2DL4 特异性结合的单链结合域。在某些实施方式中，所述异源结合域是HGF激动剂，如HGF或其亚结构域。在某些实施方式中，所述异源结合域是IL-35激动剂，如IL35或其亚结构域、单链IL-35或其亚结构域、或具有IL35R特异性和IL35激动剂活性的单链免疫球蛋白样可变结构域。在某些实施方式中，所述异源结合域是LIGHT拮抗物，如HVEM胞外域或其亚结构域、或具有LIGHT特异性的单链免疫球蛋白样可变结构域。在某些实施方式中，所述异源结合域是PD-I激动剂，如PD1-L1、PD1-L2或其亚结构域、或具有PD-I特异性的单链免疫球蛋白样可变结构域。在某些实施方式中，所述异源结合域是BTLA激动剂，如HVEM胞外域或其亚结构域、或具有BTLA特异性的单链免疫球蛋白样可变结构域。在某些实施方式中，所述异源结合域是GITRL拮抗物，如GITR胞外域或其亚结构域、或具有GITRL特异性的单链免疫球蛋白样可变结构域。在某些实施方式中，所述异源结合域是CD40拮抗物，如具有CD40 特异性的单链免疫球蛋白样可变结构域通常，本发明的融合蛋白利用不含前导肽(信号肽)的成熟蛋白质。因此，尽管本文提供的某些结合域蛋白序列(如本文所述的CTLA4、⑶28、!11^-61、!11^-65和其它)包括前导肽，技术人员很容易理解如何从包含信号肽的序列确定成熟蛋白质序列。在某些实施方式中，包含前导肽可能具有实用性。考虑到CD86结合域可位于融合蛋白的氨基末端，异源结合域可位于羧基末端。 在某些实施方式中，交叉受体分子如SEQ ID NO :9、13、17、24、28、31、35、42、171、173、175、 177、179、181、187、189、191、193、219、221、223、237、262、302、330、336、338、340 或 400 所示。还考虑到异源结合域可位于氨基末端，而CD86结合域可位于羧基末端。在某些实施方式中，交叉受体分子如SEQ ID NO :183、185、199、201、203、205、207、211、213、254、258、266、 276、350、352或354所示。如本文所述，本发明的结合域可与间插结构域(例如免疫球蛋白恒定区或其亚区)的任一端融合。此外，两个或多个结合域可各自通过本文所述接头与间插结构域连接。本文所用的“间插结构域”指一种氨基酸序列，其简单地用作一个或多个结合域的支架以使融合蛋白主要(例如，50%或更多融合蛋白)或基本(例如，90%或更多融合蛋白)以单链多肽形式存在于组合物中。例如，某些间插结构域可具有结构功能(例如间隔、 柔性、刚性)或生物学功能(例如在血浆，如人血中半衰期延长)。可延长本发明融合蛋白的血浆半衰期的示例性间插结构域包括清蛋白、转铁蛋白、结合血清蛋白的支架结构域等， 或其片段。在某些实施方式中，本发明多特异性融合蛋白所含的间插结构域是“二聚化结构域”，其指能够通过非共价或共价相互作用，例如通过形成氢键、静电相互作用、范德华力、 二硫键、疏水相互作用等或其任何组合促进至少两种单链多肽或蛋白质结合的氨基酸序列。示例性二聚化结构域包括免疫球蛋白重链恒定区或亚区。应理解，二聚化结构域可促进二聚体或更高级多聚体复合物(如三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体等) 的形成。本文定义的术语“恒定亚区”指对应于或衍生自来源抗体一个或多个恒定区结构域的部分或全部，但并非所有恒定区结构域的肽、多肽或蛋白质序列。在一个优选实施方式中，所述恒定亚区是IgG CH2CH3，优选IgGlCH2CH3。在一些实施方式中，本发明的融合蛋白恒定区结构域可能没有或具有很少的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、补体激活和补体依赖性细胞毒性(CDC)的效应物功能，同时保持结合一些F。受体(如F。Rn结合)的能力并保持较长的体内半衰期。在某些实施方式中，本发明的结合域与人IgGl恒定区或亚区融合，其中所述IgGl恒定区或亚区中具有一个或多个以下突变氨基酸第234位的亮氨酸(L234)、第235位的亮氨酸(L235)、第237位的甘氨酸(G237)、第318位的谷氨酸(E318)、 第320位的赖氨酸(K230)、第322位的赖氨酸(K322)或其任何组合(根据Kabat编号)。 例如，可将这些氨基酸中的任何一个或多个改变为丙氨酸。在另一个实施方式中，IgGl Fc 结构域中L234、L235、G237、E318、K320和K322 (根据EU编号)各突变为丙氨酸(即分别为 L234A、L235A、G237A、E318A、K320A 和 K322A)，并任选具有 N297A 突变(即基本消除 CH2 结构域的糖基化)。本领域已知在Fc结构域内部或外部进行可改变Fc与Fc受体(⑶16、⑶32、⑶64、 ⑶89、Fc ε Rl、FcRn)或补体组分Clq相互作用的突变的方法(参见例如，美国专利号 5，624，821 ；Presta(2002)Curr. Pharma. Biotechnol. 3 237)。本发明的具体实施方式
包括含有具有来自人IgG的恒定区或亚区的免疫球蛋白或融合蛋白的组合物，其中与FcRn和蛋白A的结合被保留，且Fc结构域不再与其它Fc受体或Clq发生相互作用或与最大程度减少相互作用。例如，本发明结合域可与人IgGl恒定区或亚区融合，其中第297位的天冬酰胺(根据Kabat编号为Ν297)突变为另一种氨基酸，以减少或消除该位点的糖基化，因此消除了 Fc与Fc γ R和Clq的有效结合。另一个示例性突变是P331S，其消除了 Clq结合但不影响Fc结合。在其它实施方式中，免疫球蛋白Fc区可能相对于免疫球蛋白参比序列具有改变的糖基化模式。例如，可采用各种遗传技术来改变构成糖基化位点的一个或多个特定氨基酸残基(参见 Co 等(1993) Mol. Immunol. 30 1361 Jacquemon 等(2006) J. Thromb. Haemost. 4 1047 ；Schuster 等(2005) Cancer Res. 65 7934 ；Warnock 等(2005) Biotechnol. Bioeng. 92 831)，如CH2结构域的N297 (EU编号)。或者，可工程改造产生本发明融合蛋白的宿主细胞，以产生改变的糖基化模式。例如，本领域已知的一种方法提供改变的糖基化模式，采用平分的非岩藻糖基化变体形式提高ADCC。所述变体由含有寡糖修饰酶的宿主细胞表达产生。或者，考虑用BioWa/Kyowa Hakko的Potelligent技术降低本发明糖基化分子的岩藻糖含量。在一种已知方法中，提供了用于产生重组免疫球蛋白的CHO宿主细胞，其通过产生⑶P-岩藻糖改变免疫球蛋白Fc区的糖基化模式。

或者，采用化学技术改变本发明融合蛋白的糖基化模式。例如，各种糖苷酶和/或甘露糖苷酶抑制剂提供增加ADCC活性、提高Fc受体结合和改变糖基化模式中的一种或多种所需效果。在某些实施方式中，在含有浓度能提高所述宿主细胞产生的免疫糖蛋白分子的ADCC的碳水化合物调节物的培养基中培养表达本发明多特异性融合蛋白(含有与ILlO 激动剂、HLA-G激动剂、HGF激动剂、IL-35激动剂、PD-I激动剂、BTLA激动剂、LIGHT拮抗物、 GITRL拮抗物或CD40拮抗物连接的CD86拮抗物)的细胞，其中所述碳水化合物调节物的浓度小于800 μ M。在一个优选实施方式中，在含有浓度为100-800 μ Μ，如100μΜ、200μΜ、 300 μ Μ、400 μ Μ、500 μ Μ、600 μ Μ、700 μ M或800 μ M的澳粟精胺或几夫碱，更优选澳粟精胺的培养基中培养表达这些多特异性融合蛋白的细胞。美国专利申请公开号2009/0041756 或PCT公开号WO 2008/052030中提供了用碳水化合物调节物如澳粟精胺改变糖基化的方法。在另一个实施方式中，免疫球蛋白Fc区可具有影响与效应物细胞Fc受体结合的氨基酸修饰。可采用本领域已知的任何技术，如Presta等(2001)Biochem. Soc. Trans. 30 487所公开的方法进行这些修饰。在另一种方法中，可使用Xencor XmAb 技术工程改造对应于Fc结构域的恒定亚区，以增强细胞杀伤性效应物功能(参见Lazar等(2006) Proc. Nat' 1. Acad. Sci. (USA) 103 4005)。例如，可使用这种方法产生对FC γ R的特异性和结合改进的恒定亚区，从而增强细胞杀伤性效应物功能。在 其它实施方式中，与缺少这类间插结构域的相应融合蛋白相比，恒定区或亚区可任选地增加血浆半衰期或胎盘转移。在某些实施方式中，本发明融合蛋白在人体内的延长的血浆半衰期是至少2、至少3、至少4、至少5、至少10、至少12、至少18、至少20、至少 24、至少30、至少36、至少40、至少48小时，至少数日，至少一周，至少2周，至少数周，至少一个月，至少两个月，至少数月，或更长时间。恒定亚区可包含任何以下结构域的部分或全部CH2结构域、Ch3结构域(IgA、IgD、 IgG、IgE或IgM)和Ch4结构域(IgE或IgM)。因此，本文定义的恒定亚区可指对应于免疫球蛋白恒定区一部分的多肽。恒定亚区可包括衍生自相同或不同的免疫球蛋白、抗体同种型或等位基因变体的C02结构域和Ch3结构域。在一些实施方式中，Ch3结构域是截短形式，其包含美国专利申请号 12/041，590(PCT/US2007/071052 的 CIP)列出的如 SEQ ID NOS :366_371 所示的的羧基末端序列。在某些实施方式中，本发明多肽的恒定亚区具有Ch2结构域和Ch3 结构域，其可任选具有氨基末端接头、羧基末端接头或在两端均具有接头。“接头”是结合或连接其它肽或多肽的肽，如约2至150个氨基酸的接头。在本发明的融合蛋白中，接头可将间插结构域(例如免疫球蛋白衍生的恒定亚区)与结合域连接， 或接头可连接结合域的两个可变区或从异型二聚体分子形成的单链多肽内的两个区域，如 EBI3(SEQ ID NO 25)和IL12(SEQ ID NO 26)或IL35的p35亚基。例如，接头可以是由抗体绞链区序列获得、产生或设计出的氨基酸序列，将结合域与受体连接的序列，或是将结合域与细胞表面跨膜区或膜锚定物连接的序列。在一些实施方式中，接头可具有至少一个能够在生理条件或其它标准肽条件(例如，肽纯化条件、肽储存条件)下参与至少一个二硫键的半胱氨酸。在某些实施方式中，对应于或类似于免疫球蛋白铰链肽的接头保留了对应于置于朝向该铰链氨基末端的铰链半胱氨酸的半胱氨酸。在其它实施方式中，接头来自IgGl 或IgG2A铰链，并含有对应于铰链半胱氨酸的一个半胱氨酸或两个半胱氨酸。在某些实施方式中，在间插结构域之间形成一个或多个二硫键，作为链间二硫键。在其它实施方式中， 本发明的融合蛋白可具有直接与结合域融合的间插结构域(即不存在接头或铰链)。在一些实施方式中，所述间插结构域是二聚化结构域，如IgGl CH2CH3 Fc部分。本发明多特异性融合蛋白的间插或二聚化结构域可通过肽接头与一个或多个末端结合域连接。除提供间隔功能以外，接头可在融合蛋白内以及融合蛋白和其靶点之间提供适合将融合蛋白的一个或多个结合域适当定向的柔性或刚性。此外，在给予有需要的对象如人后，接头可在体外和体内支持全长融合蛋白的表达和纯化蛋白的稳定性，且接头在这些相同对象中优选无免疫原性或免疫原性较低。在某些实施方式中，本发明多特异性融合蛋白的间插或二聚化结构域的接头可包含人免疫球蛋白铰链的部分或全部。此外，结合域可包含Vh和\结构域，这些可变区结构域可通过接头结合。示例性可变区结合域接头包括属于(GlynSer)家族的接头，如(Gly3Ser)n(Gly4Ser) ” (Gly3Ser)1(Gly4Ser)n, (Gly3Ser)n(Gly4Ser)n 或(Gly4Ser)n，其中 η 是 1-5 的整数(参见例如，分别对应于 SEQ ID NO :64、71、88、131、132、149、163 和 164 的接头 22、29、46、89、90、 116、130和131)。在优选实施方式中，这些基于(Gly4Ser)的接头用于连接可变结构域，不用于将结合域(例如scFv)与间插结构域(例如IgG CH2CH3)连接。可用于将间插结构域(例如，免疫球蛋白衍生的恒定亚区)与结合域连接的示例性接头或可连接结合域的两个可变区的接头见SEQ ID NO :43-166、244、307、320、355-379 和383-398所示。本发明考虑的接头包括例如，衍生自免疫球蛋白超家族成员的任何域间区域(例如抗体绞链区)或II型膜蛋白家族C型凝集素的柄区域的肽。这些接头的长度可以是约2 到约150个氨基酸、约2到约40个氨基酸、或约8到约20个氨基酸，优选约10到约60个氨基酸，更优选约10到约30个氨基酸，最优选约15到约25个氨基酸。例如，接头1的长度为2个氨基酸，接头116的长度为36个氨基酸(接头1-133分别见SEQ ID NO 43-166 所示；其它示例性接头见SEQ ID NO :244、307、320、355-379和383-398所示)。除通常的长度考虑外， 适用于本发明融合蛋白的接头包括选自下组的抗体绞链区=IgG绞链、IgA绞链、IgD绞链、IgE绞链或其变体。在某些实施方式中，接头可以是选自人IgGl、人IgG2、人IgG3、人IgG4、其片段或变体的抗体绞链区(上部和核心区域)。本文所用的作为“免疫球蛋白绞链区”的接头指在CHl羧基端和CH2氨基端(就IgG、IgA和IgD 而言)或CH3氨基端(就IgE和IgM而言)之间发现的氨基酸。本文所用的“野生型免疫球蛋白绞链区”指在抗体重链中发现的置于CHl和CH2区之间并连接这两个区域(就IgG、 IgA和IgD而言)或置于CH2和CH3区之间并连接这两个区域(就IgE和IgM而言)的天然产生的氨基酸序列。在优选实施方式中，野生型免疫球蛋白绞链区序列是人的序列。根据结晶图象研究，可按照功能和结构将IgG绞链结构域再分成以下三个区域 上部绞链区、核心或中部绞链区和下部绞链区(Shin等，(1992) Immunological Reviews 130 87)。示例性上部绞链区包括IgGl中发现的EPKSCDKTHT (SEQ ID NO 383)、IgG2 中发现的 ERKCCVE(SEQ ID NO :384)、IgG3 中发现的 ELKTPLGDTTHT(SEQ ID NO 385)或 EPKSCDTPPP (SEQ ID NO :386)、以及 IgG4 中发现的 ESKYGPP (SEQ ID NO :387)。示例性中部绞链区包括IgGl和IgG2中发现的CPPCP (SEQ ID NO 398)、IgG3中发现的CPRCP (SEQ ID NO 388)和 IgG4 中发现的 CPSCP (SEQ ID NO 389)。尽管 IgGl、IgG2 和 IgG4 抗体各显示具有一个上部和中部铰链，IgG3具有4个串联铰链——1个ELKTPLGDTTHTCPRCP (SEQ ID NO: 390)和 3 个 EPKSCDTPPPCPRCP(SEQ ID NO 391)。IgA和IgD抗体显示缺少IgG-样核心区，IgD显示具有两个串联的上部绞链区(参见SEQ ID NO 392和393)。发现于IgAl和IgA2抗体的示例性野生型上部绞链区分别见 SEQ ID NO 394 和 395 所示。相反，IgE和IgM抗体包含具有铰链样性质的CH2区而非典型的绞链区。IgE和 1#的示例性野生型CH2上部铰链样序列分别见SEQ ID NO 396 (VCSRDFTPPT VKILQSSSDG GGHFPPTIQL LCLVSGYTPG TINITffLEDG QVMDVDLSTA STTQEGELAS TQSELTLSQK HWLSDRTYTC QVTYQGHTFE DSTKKCA)和 SEQ ID NO 397 (VIAELPPKVS VFVPPRDGFF GNPRKSKLIC QATGFSPRQI QVSffLREGKQ VGSGVTTDQV QAEAKESGPT TYKVTSTLTI KESDffLGQSM FTCRVDHRGL TFQQNAS SMC VP)所示。“改变的野生型免疫球蛋白绞链区”或“改变的免疫球蛋白绞链区”指(a)含有最多30 %氨基酸改变(例如，最多25 %、20 %、15 %、10 %或5 %氨基酸取代或缺失)的野生型免疫球蛋白绞链区，(b)长度为至少10个氨基酸(例如，至少12、13、14或15个氨基酸)、含有最多30 %氨基酸改变(例如，最多25 %、20 %、15 %、10 %或5 %氨基酸取代或缺失)的野生型免疫球蛋白绞链区的一部分，或(c)包含核心绞链区的野生型免疫球蛋白绞链区的一部分(该部分长度可以是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸，或至少4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸)。在某些实施方式中，野生型免疫球蛋白绞链区中的一个或多个半胱氨酸残基可被一个或多个其它氨基酸残基(例如，一个或多个丝氨酸残基)所取代。或者或此外，改变的免疫球蛋白绞链区可使野生型免疫球蛋白绞链区的脯氨酸残基被另一个氨基酸残基(例如丝氨酸残基)取代。 可用作连接区的替代性铰链和接头序列可从连接IgV-样或IgC-样结构域的细胞表面受体各部分制备。当细胞表面受体含有多个串联的IgV-样结构域时在IgV-样结构域之间，以及当细胞表面受体含有多个串联的IgC-样区域时在IgC-样结构域之间的区域也可用作连接区或接头肽。在某些实施方式中，铰链和接头序列的长度是5-60个氨基酸， 可能基本呈柔性，但也可能提供更刚性的特征，并可主要含有α-螺旋结构而β-片层结构很少。优选地，序列是在血浆和血清中具有稳定性，并能耐受蛋白水解切割。在一些实施方式中，序列可含有能形成一个或多个二硫键以稳定该分子C末端的天然产生的或添加的基序，如CPPC(SEQ ID N0:422)。在其它实施方式中，序列可含有一个或多个糖基化位点。铰链和接头序列的例子包括 CD2、CD4、CD22、CD33、CD48、CD58、CD66、CD80、CD86、CD96、CD150、 ⑶166和⑶244的IgV样和IgC样结构域之间或IgC样或IgV样结构域之间的结构域间区域。替代性铰链也可从非免疫球蛋白超家族成员的II型受体如⑶69、⑶72和⑶161含二硫键的区域制备。在某些实施方式中，本发明的接头包含蝎接头。蝎接头包括衍生自免疫球蛋白超家族成员结构域间区域的肽，例如，衍生自免疫球蛋白铰链区如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA 和IgE铰链区的铰链样肽。在某些实施方式中，铰链样蝎接头保留至少一个能够在生理条件下形成链间二硫键的半胱氨酸。衍生自IgGl的蝎接头可具有1个半胱氨酸或2个半胱氨酸，并可保留对应于野生型IgGl的N末端铰链半胱氨酸的半胱氨酸。也考虑将非铰链样肽作为蝎接头，条件是这样的肽提供足够的间隔和柔性以提供能够形成两个结合域的单链蛋白质，所述各结合域相对于位置更为接近中心的恒定亚区结构域位置朝向各蛋白质末端 (N和C)。示例性非铰链样蝎接头包括来自II型膜蛋白的C型凝集素柄区域的柄区域，如 ⑶69、⑶72、⑶94、NKG2A和NKG2D的柄区域。在一些实施方式中，蝎接头包含选自SEQ ID NO 355-359 和 365 的序列。在一些实施方式中，接头具有一个用于形成链间二硫键的半胱氨酸残基。在其它实施方式中，接头具有两个用于形成链间二硫键的半胱氨酸残基。在其它实施方式中，接头衍生自免疫球蛋白结构域间区域(例如抗体绞链区)或II型C型凝集素柄区域(衍生自II 型膜蛋白；参见例如，PCT申请公开号W02007/146968所示的示例性凝集素柄区序列，如该公开文件的 SEQ ID NO :111、113、115、117、119、121、123、125、127、129、131、133、135、149、 151、153、155、157、159、161、163、165、167、169、231、233、235、237、239、241、243、245、247、 249、251、253、255、257、259、261、263、265、267、269、271、273、275、277、279、281、287、289、 297、305、307、309-311、313-331、346、373-377、380 或 381，这些序列通过引用纳入本文)。在一个方面，包含本文所述⑶86结合域的示例性多特异性融合蛋白还包含至少一个具有非CD86靶点特异性的额外结合区或结合域(“异源结合域”)。例如，本发明的多特异性融合蛋白具有通过间插结构域与作为IL-IO激动剂、HLA-G激动剂、HGF激动剂、IL-35 激动剂、PD-I激动剂、BTLA激动剂、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或⑶40拮抗物的结合域连接的CD86结合域。在某些实施方式中，多特异性融合蛋白包含第一和第二结合域、第一和第二接头以及间插结构域，其中间插结构域的一端通过第一接头与作为CD86结合域(例如，CTLA4胞外域、⑶28胞外域、抗⑶86)的第一结合域融合，另一端通过第二接头与作为 IL-10激动剂、HLA-G激动剂、HGF激动剂、IL-35激动剂、PD-I激动剂、BTLA激动剂、LIGHT 拮抗物、GITRL拮抗物或CD40拮抗物的不同结合域融合在某些实施方式中，本发明多特异性融合蛋白的第一接头和第二接头各自独立地选自例如，如 SEQ ID NO :43-166 所提供的接头 1-133 或 SEQ ID NO :244、307、320、355_379 和383-398所提供的接头。例如，所述第一或第二接头可以是接头47、58、126-131 (分别为 SEQ ID NO :89、100 和 159-164)，或 SEQ ID NO :244 或 355-379 所示接头，或其任何组合。 在其它实施例中，一个接头是接头47 (SEQ ID NO 89)或接头132(SEQ ID N0:165)，另一个接头是SEQ ID NO :355所示接头或接头127 (SEQ ID NO 160)；或一个接头是接头58 (SEQ ID NO 100)或接头 133 (SEQ ID NO 166)，另一个接头是接头 126 (SEQ ID NO 159)；或一个接头是接头58 (SEQ ID NO: 100)或接头133 (SEQ ID NO 166)，另一个接头是接头127 (SEQ ID NO: 160)；或一个接头是接头 58 (SEQ ID NO: 100)或接头 133 (SEQ ID NO: 166)，另一个接头是接头128 (SEQ ID NO: 161)；或一个接头是接头58 (SEQ ID NO 100)或接头133 (SEQ ID NO: 166)，另一个接头是接头129 (SEQ ID NO: 162)。在其它实施例中，包含如CD86特异性的结构域的本发明结合域在V1^nt结构域之间可具有额外(第三)接头，如SEQ ID N0:244、SEQ ID NO :89 所示接头，接头 46 (SEQ ID NO :88)、接头 130 (SEQ ID NO: 163) 或接头131 (SEQ ID NO 164)。在这些实施方式的任何一个中，所述接头可在任一端(例如， 接头130在(G4S)核心序列的氨基端上具有丝氨酸)或两端(例如，接头120在(G4S)核心序列的一端具有2个氨基酸(天冬酰胺-酪氨酸)，在另一端具有3个氨基酸(甘氨酸-天冬酰胺_丝氨酸))内部侧接1-5个额外氨基酸(例如，接头131具有(G4S)核心序列内部的丙氨酸)，这可能完全是形成这样的重组分子的结果(例如，采用特定限制性酶位点以连接核酸分子可导致插入一个到若干个氨基酸)，就本发明的目的而言，其可视作任何特定接头核心序列的一部分。在其它实施方式中，本发明多特异性融合蛋白的间插结构域由免疫球蛋白恒定区或亚区组成，其中所述间插结构域位于CD86结合域和作为IL-10激动剂、HLA-G激动剂、HGF 激动剂、IL-35激动剂、PD-I激动剂、BTLA激动剂、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或⑶40拮抗物的结合域之间。在某些实施方式中，本发明多特异性融合蛋白的间插结构域具有位于氨基末端的CD86结合域和位于羧基末端的作为IL-10激动剂、HLA-G激动剂、HGF激动剂、 IL-35激动剂、PD-I激动剂、BTLA激动剂、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或CD40拮抗物的结合域。在其它实施方式中，本发明多特异性融合蛋白的间插结构域具有位于氨基末端的作为 IL-10激动剂、HLA-G激动剂、HGF激动剂、IL-35激动剂、PD-I激动剂、BTLA激动剂、LIGHT 拮抗物、GITRL拮抗物或CD40拮抗物的结合域和位于羧基末端的CD86结合域。在其它实施方式中，免疫球蛋白恒定区或亚区包含免疫球蛋白Gl (IgGl)的CH2和 CH3结构域。在相关实施方式中，所述IgGl CH2和CH3结构域具有一个或多个以下突变氨基酸(即在该位置具有不同的氨基酸)第234位的亮氨酸(L234)、第235位的亮氨酸(L235)、第237位的甘氨酸(G237)、第318位的谷氨酸(E318)、第320位的赖氨酸(K230)、 第322位的赖氨酸(K322)或其任何组合(根据Kabat编号)。例如，可将这些氨基酸中的任何一个改变为丙氨酸。在其它实施方式中，根据Kabat编号，CH2结构域中的L234、L235 和G237各突变为丙氨酸(即分别为L234A、L235A和G237A)，IgGl CH3结构域中的E318、 K320和K322各突变为丙氨酸(即分别为E318A、K320A和K322A)。在某些实施方式中，本发明的多特异性融合蛋白可包含“小模块式免疫药物” (SMIP )。在该方面，术语SMIP 指相对单克隆和重组抗体具有增强药物性质的高模块化化合物类别。SMIP包含具有靶点特异性结合域的单个多肽链，其基于例如抗体可变结构域，与允许特异性募集所需类别效应物细胞(如巨噬细胞和天然杀伤(NK)细胞)和/或募集补体介导的杀伤作用的可变FC区结合。根据选择的靶点和铰链区，SMIP可通过细胞表面受体进行信号传导或阻断信号传导。本文所用的称为“小模块式免疫药物”或“SMIP 产物”的工程改造融合蛋白见美国专利公开号2003/133939、2003/0118592和2005/0136049， 以及国际专利公开 W002/056910、W02005/037989 和 W02005/017148 所述。 在一些实施方式中，多特异性融合蛋白可包含PIMS分子，如美国专利公开号 2009/0148447和国际专利公开W02009/023386所述分子。在某些实施方式中，可将本发明的多特异性融合蛋白工程改造为具有不同的前端和后端亲和力以靶向特定细胞类型。例如，可采用对CD86的亲和力高于工程改造ILlO激动剂(例如，具有I87A或I87S突变，或为单ILlO结构)对huILlORl亲和力的抗CD86结合域(例如，3D1、FUNl或其人源化变体)，并在本发明的交叉受体分子中组合这样的分子， 以有利于靶向感兴趣的特定细胞类型，如抗原呈递细胞(APC)。在该方面，根据靶向的所需细胞类型，可制备对CD86具有较高或较低亲和力，或对本文所述任何异源靶点蛋白质具有较高或较低亲和力的融合蛋白。在优选实施方式中，CD86拮抗物结合域通过大于异源结合域对其结合伙伴亲和力的CD86亲和力优先将多靶点特异性交叉受体分子靶向APC。在一些实施方式中，本发明的多特异性融合蛋白具有包含CTLA4胞外结构域或亚结构域、CD28胞外结构域或亚结构域、或CD86特异性抗体衍生结合域的CD86结合域。 在某些实施方式中，CD86特异性抗体衍生结合域衍生自FUNl单克隆抗体(参见例如，J Pathol. 1993Mar ； 169 (3) :309_15)，或衍生自3D1抗CD86单克隆抗体。在某些实施方式中， ⑶86结合域是SCTLA4，如SEQ ID NO :1的成熟多肽序列。在某些实施方式中，⑶86结合域是SCTLA4，如SEQ ID NO :1的序列，或CTLA4的可变样结构域，如SEQ ID NO :3，或其亚结构域。在某些实施方式中，⑶86结合域是s⑶28，如SEQ ID NO :2的成熟多肽序列(信号肽氨基酸1-18)。在其它实施方式中，⑶86结合域包含来自FUNl (例如，SEQ ID NO 305 和306)或3D1 (例如，SEQ ID NO 318和319)的轻链和重链可变结构域，优选scFv形式。在其它实施方式中，本发明的多特异性融合蛋白具有CD86结合域和作为IL-10激动剂、HLA-G激动剂、HGF激动剂、IL-35激动剂、PD-I激动剂、BTLA激动剂、LIGHT拮抗物、 GITRL拮抗物或CD40拮抗物的异源结合域(参见例如，SEQ ID NO :7、14、15、18_22、25、26、 29、32、33、36、39和40提供的异源结合域氨基酸序列)。这样的多特异性融合蛋白在本文称为交叉受体分子，其示例性结构包括 N-BD1-ID-BD2-C和N-BD2-ID-BD1-C，其中N和C分别表示氨基末端和羧基末端；BDl是CD86 结合域，如免疫球蛋白样或免疫球蛋白可变区结合域或胞外域；X是间插结构域；BD2是作为IL-IO激动剂、HLA-G激动剂、HGF激动剂、IL-35激动剂、PD-I激动剂、BTLA激动剂、LIGHT 拮抗物、GITRL拮抗物或⑶40拮抗物的结合域。在一些构建体中，X可以包含置于第一和第二结合域之间的免疫球蛋白恒定区或亚区。在一些实施方式中，本发明的多特异性融合蛋白具有的间插结构域⑴从氨基末端到羧基末端包含以下结构-Ll-X-L2-，其中Ll和L2 各自独立地是含有2到约150个氨基酸的接头；X是免疫球蛋白恒定区或亚区。在其它实施方式中，所述多特异性融合蛋白具有的间插结构域是清蛋白、转铁蛋白或其它血清蛋白结合蛋白，其中所述融合蛋白在组合物中主要或充分保持单链多肽的形式。 示例性交叉受体融合蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO :9、13、17、24、28、31、35、38、 42、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、 207、209、211、213、215、217、219、221、223、237、239、252、254、256、258、260、262、266、276、 302、330、334、336、338、340、350、352和354所示；其分别由 SEQ ID NO :8、12、16、23、27、30、 34、37、41、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、 204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、236、238、251、253、255、257、259、261、265、 275、301、329、333、335、337、339、349、351 和 353 所示多核苷酸序列编码。在其它实施方式中，本发明的多特异性融合蛋白具有以下结构 N-BD1-X-L2-BD2-C，其中BDl是CD86结合域，如与CTLA4胞外域至少约90%相同的结合域；-X-是-L1-CH2CH3-，其中Ll是第一 IgGl铰链，任选通过取代第一或第二半胱氨酸突变，且CH2CH3-是 IgGl Fc 结构域的 CH2CH3 区；L2 是选自 SEQ ID NO :43_166、244、307、320、 355-379或383-398的接头；BD2是如本文所述作为IL-10激动剂、HLA-G激动剂、HGF激动齐[J、IL-35激动剂、PD-I激动剂、BTLA激动剂、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或⑶40拮抗物的结合域。在具体实施方式
中，多特异性交叉受体融合蛋白具有(a)包含与SEQ ID NO 1或 SEQ ID NO :2 成熟多肽序列至少 80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或至少 100%相同的氨基酸序列的⑶86结合域，和(b)作为IL-10激动剂、HLA-G激动剂、HGF激动剂、IL-35 激动剂、PD-I激动剂、BTLA激动剂、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或⑶40拮抗物的结合域， 其包含与SEQ ID NO :7、14、15、18-22、25、26、29、32、33、36、39和40提供的上述异源结合蛋白的相应成熟多肽序列至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或至少100%相同的氨基酸序列，其中从氨基末端到羧基末端，或从羧基末端到氨基末端，(i)(a)的CD86结合域或(b)的结合域与第一接头融合，(ii)第一接头与如SEQ ID NO 409和415-417中任何一个序列所示的免疫球蛋白重链恒定区CH2和CH3融合，(iii)CH2CH3恒定区多肽与第二接头融合，和(iv)第二接头与(a)的CD86结合域或(b)的结合域融合。在某些实施方式中，所述第一接头是接头47 (SEQ ID NO :89)、接头132 (SEQ ID NO 165)或接头133 (SEQ ID NO 166)，所述第二接头是接头126-129 (SEQ ID NO 159-162)中任何一个，CD86结合域Vh 和Vl结构域之间的额外(第三)接头是接头130(SEQ ID NO 163)或接头131(SEQ ID NO 164)。示例性交叉受体融合蛋白的氨基酸序列见SEQ ID NO :9、13、17、24、28、31、35、38、 42、171、173、175、177、179、181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、 207、209、211、213、215、217、219、221、223、237、239、252、254、256、258、260、262、266、276、 302、330、334、336、338、340、350、352和354所示；其分别由 SEQ ID NO :8、12、16、23、27、30、34、37、41、170、172、174、176、178、180、182、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、 204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、236、238、251、253、255、257、259、261、265、 275、301、329、333、335、337、339、349、351 和 353 所示多核苷酸序列编码。制备多特异件融合蛋白 为有效产生本文所述的任何结合域多肽或融合蛋白，采用前导肽促进所表达的多肽和融合蛋白的分泌。预期使用任何常规的前导肽(信号序列)以指导初始表达的多肽或融合蛋白进入分泌通路并引起从成熟多肽或融合蛋白上前导肽和所述多肽或融合蛋白之间的连接点处或其附近切割前导肽。根据本领域已知因素选择特定的前导肽，例如使用易于在前导肽的编码序列起始处或末端插入限制性内切核酸酶切割位点以便于分子工程操作的多核苷酸编码的序列，条件是这类引入序列确定的氨基酸不会不可接受地干扰由初始表达的蛋白质进行前导肽的所需处理；或如果所述前导肽在该多肽或融合蛋白成熟过程中未被切割，则其不会不可接受地干扰多肽或融合蛋白分子的任何所需功能。本发明的示例性前导肽包括天然前导序列(即随天然蛋白质一起表达的序列)或使用异源前导序列，如 h3n-mdfqvqifsfllisasvimsrg(x)n-co2h,其中 χ 是任何氨基酸，η 是 o-3 (seq id no :i67、 419,420 和 421)，或 H3N-MEAPAQLLFLLLLWLPDTTG_C02H(SEQ ID NO 168)。如本文所述，考虑到本文所述的结合域，如胞外域、轻链和重链可变区以及CDR的变体和衍生物。在一个实施例中，提供用一个或多个氨基酸残基补充特定结合剂氨基酸序列的插入变体。插入可位于蛋白质的任一端或两端，或可位于特定结合剂氨基酸序列的内部区域内。本发明的变体产物也包含成熟的特定结合剂产物，即去除前导或信号序列且所得蛋白质具有额外氨基末端残基的特定结合剂产物。所述额外的氨基末端残基可来自另一种蛋白质，或可包含无法鉴定为来自某具体蛋白质的一个或多个残基。考虑到在-ι位上具有额外甲硫氨酸残基的多肽，以及在_2和-1位上具有额外甲硫氨酸和赖氨酸残基的本发明多肽。具有额外的Met、Met-LyS或Lys残基(或总体具有一个或多个碱性残基)的变体可特别用于提高细菌宿主细胞中的重组蛋白产量。本文所用的“氨基酸”指天然(天然产生)的氨基酸、取代的天然氨基酸、非天然氨基酸、取代的非天然氨基酸或其任何组合。天然氨基酸的名称在本文中表示为标准的单字母或三字母代码。天然极性氨基酸包括天冬酰胺(asp或n)和谷氨酰胺(Gln或Q)；以及碱性氨基酸如精氨酸(Arg或R)、赖氨酸(Lys或K)、组氨酸(His或H)及其衍生物；以及酸性氨基酸如天冬氨酸(asp或D)和谷氨酸(Glu或e)及其衍生物。天然疏水性氨基酸包括色氨酸(Trp或W)、苯丙氨酸(Phe或F)、异亮氨酸(lie或I)、亮氨酸(Leu或L)、甲硫氨酸 (Met或M)、缬氨酸(Val或V)及其衍生物；以及其它非极性氨基酸如甘氨酸(GIy或G)、丙氨酸(Ala或A)、脯氨酸(Pro或P)及其衍生物。中等极性的天然氨基酸包括丝氨酸(Ser 或S)、苏氨酸(Thr或T)、酪氨酸(Tyr或Y)、半胱氨酸(Cys或C)及其衍生物。除非另有说明，本文所述的任何氨基酸可以是D-或L-构型。取代变体包括氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基被去除或用替代性残基取代的融合蛋白。在一些实施方式中，取代具有保守性质；然而，本发明也包括非保守取代。可根据物理性质以及在蛋白质二级和三级结构中的贡献对氨基酸进行分类。本领域将保守取代认定为用具有类似性质的另一个氨基酸取代氨基酸。示例性保守取代见以下表1所示 (参见WO 97/09433，第10页，1997年3月13日公开)。
表1保守取代I
权利要求
1.一种多特异性融合蛋白，包含通过间插结构域与异源结合域连接的CD86结合域，其中所述异源结合域是IL-10激动剂、HLA-G激动剂、HGF激动剂、IL-35激动剂、PD-I激动剂、 BTLA激动剂、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或⑶40拮抗物。
2.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述CD86结合域是CTLA4胞外域或CTLA4胞外域的亚结构域。
3.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述CD86结合域是具有CD86 特异性的Fab、scFv、结构域抗体或仅含重链的抗体。
4.如权利要求3所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述CD86结合域包含FUNl抗 CD86抗体或其人源化变体的轻链和重链可变结构域。
5.如权利要求4所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述FUm结合域包含SEQID NO 187或237的氨基酸1-258。
6.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述CD86结合域包含SEQID NO 1-6中任一项所列的氨基酸序列。
7.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述异源结合域包含SEQID NO :7、14、15、18-22、25、26、29、32、33、39 和 40 中任一项所列的氨基酸序列。
8.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述异源结合域包含ILlO激动剂，所述ILlO激动剂包含SEQ ID NO :7或其包含第87位点突变的变体提供的氨基酸序列。
9.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述异源结合域包含HLA-G激动剂，所述HLA-G激动剂包含SEQ ID NO 14或15提供的氨基酸序列。
10.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述异源结合域包含HGF激动剂，所述HGF激动剂包含SEQ ID NO 18-22中任一项提供的氨基酸序列。
11.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述异源结合域包含IL-35 激动剂，所述IL-35激动剂包含SEQ ID NO 25或沈提供的氨基酸序列。
12.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述异源结合域包含PD-I激动剂，所述PD-I激动剂包含SEQ ID NO :32或33提供的氨基酸序列。
13.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述异源结合域包含BTLA激动剂，所述BTLA激动剂包含SEQ ID NO : 提供的氨基酸序列。
14.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述异源结合域包含LIGHT 拮抗物，所述LIGHT拮抗物包含SEQ ID NO : 提供的氨基酸序列。
15.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述异源结合域包含GITRL 拮抗物，所述GITRL拮抗物包含SEQ ID NO 39或40提供的氨基酸序列。
16.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述间插结构域包含置于 CD86结合域和异源结合域之间的免疫球蛋白恒定区或亚区。
17.如权利要求16所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白恒定区或亚区是 IgGl CH2CH3。
18.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述间插结构域包含置于第一和第二接头之间的免疫球蛋白恒定区。
19.如权利要求18所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述第一和第二接头独立地选自 SEQ ID NO :43-166、244、307、320、355-379 和 383-398 提供的接头。
20.如权利要求18所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述间插结构域包含人免疫球蛋白Fc区、清蛋白、转铁蛋白或结合血清蛋白的支架结构域。
21.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述间插结构域从氨基末端到羧基末端包含如下结构-L1-X-L2-其中Ll和L2各自独立为包含2到约150个氨基酸的接头；和X是免疫球蛋白恒定区或亚区、清蛋白、转铁蛋白或另一血清蛋白结合蛋白。
22.如权利要求21所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白恒定区或亚区是 IgGl CH2CH3。
23.如权利要求21所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，Ll是人免疫球蛋白铰链区， 其经任选突变用其它氨基酸取代一个或多个半胱氨酸。
24.如权利要求21或23所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，X是人IgGlFc结构域或它的至少一个CH结构域，其经任选突变以消除Fc YRI-III相互作用并保持Fcfoi相互作用。
25.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述间插结构域是二聚化结构域。
26.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，其具有以下结构N-BD1-X-L2-BD2-C其中BDl是与CTLA4胞外域至少约90%相同的⑶86结合域；-X-是-L1-CH2CH3-，其中Ll是第一 IgGl铰链，其任选通过取代第一半胱氨酸而发生突变，且-CH2CH3-是IgGl Fc结构域的CH2CH3区，其经任选突变以消除Fc γ RI-III相互作用并保持Fcfoi相互作用；L2 是选自 SEQ ID NO :43-166、244、307、320、355_379 和 383-398 的接头；和BD2是异源结合域。
27.如权利要求1所述的多特异性融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含以下任一项提供的氨基酸序列:SEQ ID NO :9、13、17、24、沘、31、35、38、42、171、173、175、177、179、 181、183、185、187、189、191、193、195、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、 219、221、223、237、239、252、254、256、258、260、262、266、276、302、330、334、336、338、340、 350,352 和 354。
28.一种组合物，其包含以上权利要求中任一项所述的一种或多种多特异性融合蛋白， 以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
29.如权利要求观所述的组合物，其特征在于，所述多特异性融合蛋白在所述组合物中以二聚体或多聚体形式存在。
30.一种多核苷酸，其编码如权利要求1-27中任一项所述的多特异性融合蛋白。
31.如权利要求30所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含以下任一项提供的多核苷酸:SEQ ID NO :8、12、16、23、27、30、34、37、41、170、172、174、176、178、180、182、、184、186、188、190、192、194、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、 222、236、238、251、253、255、257、259、261、265、275、301、329、333、335、337、339、349、351和 353。
32.—种表达载体，其包含与表达控制序列操作性连接的如权利要求30或31所述的多核苷酸。
33.一种宿主细胞，其包含权利要求32所述的表达载体。
34.一种治疗患与 CD86、IL-10、HLA-G, HGF、IL-35、PD-I、BTLA、LIGHT、GITRL 或 CD40 相关疾病的对象的方法，包括给予治疗有效量的以上权利要求中任一项所述的多特异性融合蛋白或其组合物。
35.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述疾病是类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮或实体器官移植。
全文摘要
本发明提供一种多特异性融合蛋白，其由CD86拮抗物结合域和作为IL-10激动剂、HLA-G激动剂、HGF激动剂、IL-35激动剂、PD-1激动剂、BTLA激动剂、LIGHT拮抗物、GITRL拮抗物或CD40拮抗物的另一个结合域组成。所述多特异性融合蛋白还可包含分隔其它结构域的间插结构域。本发明还提供编码所述多特异性融合蛋白的多核苷酸、所述融合蛋白的组合物以及使用所述多特异性融合蛋白和组合物的方法。
文档编号C07K16/28GK102227447SQ200980148182
公开日2011年10月26日 申请日期2009年10月2日 优先权日2008年10月2日
发明者J·W·布兰肯什普, P·A·汤普森, P·R·包姆, P·丹, S·K·纳塔拉加 申请人:新兴产品开发西雅图有限公司