专利名称：一种胸腺肽的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种胸腺肽的制备方法，属生物药品制备技术领域。
背景技术：
胸腺肽是胸腺组织分泌的具有生理活性的一组多肽，具有调节和增强人体细 胞免疫功能的作用。胸腺肽是采用生物化学的方法从动物胸腺组织中提取。公开号为 CN1721440A的中国专利公开了一种制备胸腺肽的方法，其步骤为(1)将新鲜的胸腺组织 在20°C 23°C下用高速剪切机破碎得到勻浆液；(2)用稀盐酸调节pH值在4. 5 4. 8之 间；(3)将勻浆液在20°C 23°C条件下放置3 4小时；(4)在60°C 65°C水浴中加热 30min,自然冷却至室温；(5)过滤；(6)滤液用截留分子量为10000的中空纤维柱纯化、除 菌得到胸腺肽产品。上述制备方法在高速勻浆时未加入缓冲液来抑制蛋白酶的活性，而蛋白酶会分解 或破坏胸腺肽，进而降低胸腺肽的得率和活性；另外勻浆温度为20°C 23°C，也不易保持 胸腺肽的活性。
发明内容
为了克服上述工艺的不足之处，本发明目的在于提供一种制备胸腺肽的方法。为了实现本发明目的，本发明的技术方案在于提供一种制备胸腺肽的方法，步骤 如下
1)取新鲜的胸腺，用PH3 3.5的缓冲液洗涤干净；
2)加入pH3.5 4.0缓冲液，在8°C 10°C的条件下，用高速勻质机勻浆，得到勻浆液;
3)将上述勻浆液先放置在0°C 4°C条件下，然后再放置到-18°C -25°C条件下；
4)将冻结后勻浆液在70 80°C的水浴锅中加热10 15min；
5)迅速将上述勻浆液放在低温条件下至完全冻结，然后取出置室温中融化，反复冻
融；
6)将上述反复冻融后的勻浆液，离心，取上清液，用稀盐酸调节pH值4.5 5，再次离 心，取上清，调节PH值至中性；
7)将上述中性上清液先经纸浆板过滤，得到的滤液用截留分子量100000的中空纤维 超滤柱超滤，得到的滤液再用截留分子量10 000超滤膜超滤，得到的滤液最后经过滤菌膜 过滤；
8)取除菌后的滤液测蛋白含量，冻干，得到胸腺肽成品。步骤3)中在0°C 4°C下放置时间为36h 48h，在_18°C _25°C下放置时间为 36h 48h。步骤5)中所述的低温为-15°C -20°C。步骤6)中所述的离心温度均为4°C。步骤7)中所述的滤菌膜的孔径为0. 22 μ m。
本发明的有益效果1)采用pH3 3. 5的缓冲液进行洗涤，有效地抑制了酶的活性。2)勻浆液在0°C 4°C条件下放置36h 48h后，然后在_18°C _25°C条件下放 置36h-48h，以防止胸腺肽突然进入低温而导致胸腺肽的活性下降。3)采用低温勻浆和低温离心，一方面有利于抑制酶的活性，另一方面保持胸腺肽 的活性。4)采用低pH值进行勻浆，有利于胸腺细胞的完全破碎。5)用盐酸将勻浆液的PH值调至为4. 5 5，可使杂蛋白沉淀，抑制酶对胸腺肽的 破坏，提高胸腺肽的活性。6)采用超滤膜能进一步的除去杂质和细菌，产品的合格率提高，胸腺肽的含量得 到提高。
具体实施例方式取Ikg新鲜的小牛胸腺，去除脂肪及结缔组织，用pH3 3. 5的缓冲液洗涤干净， 加入1000 mL的pH3. 5 4的缓冲液，在8°C 10°C下，用勻浆机以10000 rpm/min速度勻 浆10 min，直到变成乳白色液体；得到的勻浆液先在0°C 4°C条件下放置36h 48h，然后 在-18°C _25°C条件下放置36h 48h，将冻结的勻浆液放入70 80°C水浴锅中，恒温加 热10 min 15min ；迅速取出勻浆液放在_15°C _20°C条件下至完全冻结，然后取出放室 温融化，反复冻融3次；在4°C条件下，7000rpm/min离心20 min,取上清液，用稀盐酸调pH 值至4. 5 5，再次在4°C条件下，7000rpm/min离心20 min，取上清液，用4 mol/ L NaOH 调节PH值至中性；取中性上清液经纸浆板过滤，滤液用截留分子量100 000的中空纤维超 滤柱超滤，得到的滤液再经过截留分子量10 000超滤膜超滤，得到的滤液经过孔径为0. 22 μ m滤菌膜过滤，取除菌后的滤液测蛋白含量，冻干，得到胸腺肽成品。测定胸腺肽含量为 16. 21mg/ml，胸腺肽α 1含量为3. 2%。体外玫瑰花结实验，样品稀释到0. 002mg/ml，活性增 加 37. 5%ο
权利要求
一种胸腺肽的制备方法，其特征在于所述的制备方法包括以下步骤1)取新鲜的胸腺，用pH3～3.5的缓冲液洗涤干净；2)加入pH3.5～4.0缓冲液，在8℃～10℃的条件下，用匀质机匀浆,得到匀浆液；3)将上述匀浆液先放置在0℃～4℃条件下，然后再放置到 18℃～ 25℃条件下；4)将冻结后匀浆液在70～80℃的水浴锅中加热10 min～15min； 5)迅速将上述匀浆液放在低温条件下至完全冻结，然后取出置室温中融化，反复冻融； 6)将上述反复冻融后的匀浆液，离心，取上清液，用稀盐酸调节pH值4.5～5，再次离心，取上清，调节pH值至中性；7)将上述中性上清液先经纸浆板过滤，得到的滤液用截留分子量100 000的中空纤维超滤柱超滤，得到的滤液再经过截留分子量10 000 超滤膜超滤，得到的滤液最后经过滤菌膜过滤；8)取除菌后的滤液测蛋白含量，冻干，得到胸腺肽成品。
2.根据权利要求1所述的胸腺肽的制备方法，其特征在于步骤3)中在0°C 4°C下 放置时间为36h 48h，在-18°C _25°C下放置时间为36h 48h。
3.根据权利要求1所述的胸腺肽的制备方法，其特征在于步骤5)中所述的低温 为-15°C -20°C。
4.根据权利要求1所述的胸腺肽的制备方法，其特征在于步骤6)中所述的离心温度 均为4°C。
5.根据权利要求1所述的胸腺肽的制备方法，其特征在于步骤7)中所述的滤菌膜的 孔径为0. 22 μ m。
全文摘要
本发明涉及一种胸腺肽的制备方法，其制备步骤为用pH3.5-4.0的缓冲液将胸腺洗涤干净，再加入pH3.5～4.0的缓冲液低温匀浆，制成胸腺匀浆液；得到的匀浆液经过热变性离心去除杂蛋白，然后用盐酸调节上清液pH值至4.5-5，再次离心，调节上清液pH值至中性；得到的中性上清液经过不同的滤膜过滤，除去杂质和细菌，冻干，得到胸腺肽成品。本发明具有可提高胸腺肽的活性及得率，降低生产成本的优点。
文档编号C07K1/34GK101921331SQ20101025543
公开日2010年12月22日 申请日期2010年8月17日 优先权日2010年8月17日
发明者吴红云, 霍军峰, 韩改会 申请人:郑州后羿制药有限公司