专利名称：利用碱性蛋白酶酶解牛皮胶原蛋白制备抗冻多肽的制作方法
技术领域：
本发明提供了一种抗冻多肽及其制备方法，更具体地涉及了一种利用碱性蛋白酶 酶解牛皮胶原蛋白制备的抗冻多肽，属于生物技术领域。
背景技术：
食品和医药产品在低温储存和运输过程中由于环境温度的波动变化而反复地遭 受冰晶生长和重结晶的问题越来越受到人们的关注。温度的反复升降使冰晶不断生长、冻 融和重结晶，严重破坏细胞和组织结构而失去产品应有的品质。世界范围内的科学家正面 临严肃的挑战如何控制冰晶生长及重结晶，实现低温冷链上的冰晶生长控制，是制约众多 食品和医药产品品质的关键所在。抗冻蛋白(antifreeze proteins, AFPs)或者称“冰结构蛋白”(ice structuring proteins)，是一类附着在冰晶体(ice crystals)表面而抑制冰晶的生长和重结晶的活性 蛋白质。抗冻蛋白由于其具有控制冰晶生长、减少细胞损伤及保持产品原有组织结构、质 地和品质的特点和突出意义而成为热点研究主题，近年来国内外对抗冻蛋白的研究十分活 跃，《Nature》和《Science》密切跟踪报道抗冻蛋白方面的最新研究进展。目前的研究主 要集中在从极地鱼类、陆地昆虫、植物和细菌等生物体中分离到多种抗冻蛋白，并寻求它们 在食品、医学和其它工业上的应用。伴随着多种抗冻蛋白的发现和研究的深入，其制约生物 体抗冻蛋白的研究和应用的二大关键问题也日益凸现1.天然分离纯化所得到的数量微 少，非常有限的数量限制了它在食品和医学上的大规律应用前景；2.当科学家致力于转 基因技术以扩大生物体来源的抗冻蛋白产量时，转基因抗冻蛋白在食品应用中的安全性顾 虑又成为广大消费者、欧盟组织和国际FDA组织所共同担忧的焦点问题。同样的研究还表明，抗冻蛋白的抗冻活性片断只存在于局部的特异多肽链结构域 (domain)而并不是整体蛋白质在起作用，即使是纯化了的抗冻蛋白，抗冻活性往往不高，仍 然需要探究其活性域domain来进一步提高抗冻效率。所以，如何获得食品源的结构紧凑 的高活性抗冻多肽，就成为抗冻蛋白迫切的研究方向。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种抗冻多肽及其制备方法，使抗冻活性得以 高效地实现。本发明的一种抗冻多肽，氨基酸序列为Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Pro-Gly-Glu-Arg-Gly-Ser-Pro-Gly-Ala-Gln-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Arg。所述抗冻多Jj太的分子量为 2107 Da。本发明的一种抗冻多肽的制备方法，以牛皮胶原蛋白为原料，采用碱性蛋白酶对 其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到抗冻多肽；所述酶解条件为酶解PH为PH7-10、温度 30-55°C、酶解时间为20 - 60分钟、酶-底物配比为1:15 — 1 :20 (w/w);所述酶为碱性蛋 白酶。优选的酶解条件为酶解PH为9.0、温度45°C、酶解时间为30分钟、酶-底物配比为 1:15 (w/w)。所述分离纯化的手段包括S印hadex G-50分子筛、S^harose SP C-25离子
3交换色谱和RP-HPLC反相高效液相色谱。所述分离纯化的具体步骤为酶解产物首先利用S印hadex G_50凝胶色谱进行分 离，洗脱液为去离子水，流速为2mL/min，洗脱峰在225nm下进行测量；收集具有最佳抗冻活 性的峰，再用Sulfopropyl-S印adex C-25阳离子交换色谱进行分离，洗脱液为NaCl浓度梯 度为0-0. 5M的0. 01mol/L pH7. 0的磷酸缓冲液，流速为0. 5mL/min ；收集具有最佳抗冻活 性的峰，利用RP-HPLC反相高效液相色谱再进行进一步的分离，反相HPLC的分离条件是用 10-90%乙腈溶液作为洗脱液，流速为lmL/min，得到高纯度的特异性抗冻多肽；所述高纯 度的特异性抗冻多肽的分子量为2107 Da0为了实现上述方案，本发明采取的具体步骤如下 (1) 明胶酶解条件的优化
本技术所采用的酶和牛皮胶原蛋白购自Sigma生物试剂公司(中国·上海)。采用单因素实验，分别对三个酶解因素进行考察，分别为酶解温度(37°C，45°C和 50°C)、酶解时间(10，20，30，40和60分钟)以及酶-底物配比(1 100，1 50，1 20，1 15和 1:10 w/w)0称取1.65克牛皮胶原蛋白溶解于6ml Mili-Q水中，然后用2mol/L NaOH将其 PH调节至9.0。先将该溶液水浴加热到需要温度，接着再按不同的酶-底物配比加入相应 量的酶，按照预定的反应时间开始反应。接着再在沸水浴中灭酶10分钟，冷却后再IOOOrpm 离心10分钟。上清液收集后，分别对其抗冻活性进行测定，以确定最佳酶解条件。得到具有 最大抗冻活性的酶解液的酶解条件是酶解PH为pH7-10、温度30-55°C、酶解时间为20 — 60分钟、酶-底物配比为1:15 — 1 :20 (w/w)0(2) 酶解酶解产物的分离、纯化
先在最佳酶解条件下进行酶解，得到的酶解产物先经过S印hadex G-50凝胶色谱(长 100cm,直径2. 6cm)进行分离，洗脱液为去离子水，流速为2mL/min，洗脱峰在225nm下进 行测量。收集具有最佳抗冻活性的峰，再用Sulfopropyl-S印adex C-25阳离子交换色谱 (长55cm，直径2. 0cm)进行分离，洗脱液为NaCl浓度梯度为0-0. 5M的0. 01mol/L pH7. 0 的磷酸缓冲液，流速为0. 5mL/min。收集具有最佳抗冻活性的峰，利用RP-HPLC反相高效液 相色谱再进行进一步的分离，反相HPLC的分离条件是用10-90%乙腈溶液作为洗脱液，流 速为lmL/min，得到高纯度的特异性抗冻多肽。利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (MALDI-T0F)测定该纯化的特异性抗冻多肽的分子量为2107 Da0(3) 抗冻活性的测试
利用冰淇淋基体(Ice Cream Base Mix)为抗冻多肽研究载体。取5uL的冰淇淋，利用 cold-heat-stage系统，使其以40°C /min的速度快速降温至_40°C，在该温度下保持5min 并拍照。然后以1°C /min的速度再升温至_14°C，并且接着以每3min —次的频率在_14°C 和_12°C之间往复循环7次，以模拟冰淇淋在两个月储藏运输过程中的温度的变化，并拍照 以观察冰晶变化。(4) 抗冻多肽分子量的测定
利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-T0F)测定特异性抗冻多肽的分子量。(5)氨基酸序列测定
利用蛋白质测序仪(Applied Biosystems Model 476A, Perkin Elmer Co. ΜΑ,U.S.A)测定特异性抗冻多肽的氨基酸全序列。本发明透过目前生物体纯化抗冻蛋白研究的数量局限性和转基因抗冻蛋白的食 用安全性顾虑，立足于抗冻蛋白的抗冻活性片断只存在于特异的肽链结构域(domain)而不 是整体蛋白质在起作用的理论基础，以来自于牛皮的胶原蛋白为出发点，着眼于通过碱性 蛋白酶的切割条件控制，切割为具有特定的肽链长度和结构域组成的活性多肽，而使抗冻 活性得以高效地实现。本发明突破了国内外现存的抗冻蛋白(多肽)的研究思路和方法，克服从天然生物 体中纯化抗冻蛋白数量的局限性以及国际FDA组织对转基因抗冻蛋白在食品应用中的安 全性顾虑，获得基于食品源的高效抗冻多肽，为开发基于食品源的抗冻多肽以及探索其在 食品、医学上的广泛应用奠定理论基础。
图1为胶原蛋白酶解物S印hadex G-50洗脱图2为S印hadex G-50洗脱峰三个部分对冰淇淋中冰晶生长及其冰晶抑制效果图； 图 3 为 Fraction2 的 Sulfopropyl-S印adex C-25 洗脱图4为添加1% (w/w) SPUSP2洗脱峰对冰淇淋中冰晶生长及抑制冰晶生长的效果图； 图5为纯化的抗冻多肽MALDI-T0F图6为纯化的特异性抗冻多肽对冰淇淋中冰晶生长及抑制冰晶生长的效果；其中，A、B 分别表示空白冰淇淋、添加0. 5% (w/w)特异性抗冻多肽样品的冰晶生长情况图。
具体实施例方式本发明的抗冻多肽的氨基酸序列为Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Pro-Gly-Glu-Arg-Gly -Ser-Pro-Gly-Ala-Gln-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Argο制备方法如下
以牛皮胶原蛋白为原料，使用碱性蛋白酶对其进行酶解，并按照国际抗冻蛋白活性检 测的标准，建立抗冻活性检测系统，优化其酶解条件，得到具有最大抗冻活性的酶解液的酶 解条件是酶解PH为9. O、温度是45 °C、酶解时间为30分钟、酶-底物配比为1 15 ；在最 佳酶解条件下进行酶解，得到的酶解产物先经过S印hadex G-50凝胶色谱(长100cm，直径 2. 6cm)进行分离，洗脱液为去离子水，流速为2mL/min，洗脱峰在225nm下进行测量。收集 具有最佳抗冻活性的峰，再用Sulfopropyl-S印adex C-25阳离子交换色谱(长55cm，直径 2. Ocm)进行分离，洗脱液为NaCl浓度梯度为0-0. 5M的0. Olmol/L pH7. O的磷酸缓冲液，流 速为0. 5mL/min。收集具有最佳抗冻活性的峰，利用RP-HPLC反相高效液相色谱再进行进一 步的分离，反相HPLC的分离条件是用10-90%乙腈溶液作为洗脱液，流速为lmL/min，得到 高纯度的特异性抗冻多肽。利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-T0F)测定该 纯化的特异性抗冻多肽的分子量。冷冻干燥得到本发明的抗冻多肽，进行分子量测定表明，用碱性蛋白酶酶解得到 的特异性抗冻多肽的分子量为2107 Da0本发明采用的仪器、检测手段如下
本发明的制备抗冻多肽的抗冻活性检测系统，采用结合冷热循环(cold — heat -
5stage)系统，多倍显微镜和自动照相系统，组构抗冻活性的抑制冰晶生长检测系统平台。以 液氮维持操作过程的低温环境。模拟产品在低温储存过程中的温度波动。通过系统程序设 置，设置样品的温度波动变化并连续反复7 25个循环，连接多倍显微镜和实时照相记录 系统，记录样品在冷一热反复循环过程中的实时冰晶生长情况。应用S印hadex G-50分子筛、Sepharose SP C-25离子交换色谱、RP-HPLC反相高 效液相色谱、透析等多种分离纯化手段，实现最显著活性的特异抗冻多肽的高效分离纯化。利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-T0F)测定特异性抗冻多肽的分子量。利用蛋白质测序仪(Applied Biosystems Model 476A, Perkin Elmer Co. ΜΑ, U. S. Α)测定特异性抗冻多肽的氨基酸全序列。为了进一步了解本发明内容、特点及功效，兹例举以下实施例 实施例1
称取1.65克牛皮胶原蛋白溶解于6ml Mili-Q水中，然后用2mol/L NaOH将其pH调节 至9. O。先将该溶液水浴加热到45°C，接着再按照酶-底物配比为1 15的比例加入相应量 的酶，酶解时间为30分钟。接着在沸水浴中灭酶10分钟，冷却后再HOOOrpm离心10分钟， 收集上清液备用。将上清液用S印hadex G-50凝胶色谱(长100cm，直径2. 6cm)进行分离，洗脱 液为去离子水，流速为2mL/min，洗脱峰在225nm下进行测量，见图1。收集各峰并测定抗冻 活性(如图2所示)。从图1可以看出，Fraction具有最好的抗冻活性，统计学分析表明， 冰晶平均直径为5. 02um,明显小于Fractionl (17. 96um)和Fraction3 (8. 39um),具有显 著性差异(P <0.05)。分离出来Fraction2再进行下一步的分离，用Sulfopropyl-S印adex C-25阳离子 交换色谱(长55cm，直径2. Ocm)进行分离，洗脱液为NaCl浓度梯度为0-0. 5M的0. Olmol/ L PH7.0的磷酸缓冲液，流速为0.5mL/min，见图3。收集各峰并测定抗冻活性(如图4所 示)。很明显，SP2的冰晶直径明显小于SP1，统计学分析表明，其冰晶大小分别为3. 35um和 9. 16um，具有显著性差异(P < 0.05)。对分离出来SP2部分的样品利用RP-HPLC反相高效液相色谱再进行进一步的分 离，得到高纯度的特异性抗冻多肽。利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-T0F) 测定该纯化的特异性抗冻多肽的分子量。从图5可以看出，本发明的特异性抗冻多肽的分 子量为2107 Da。纯化的特异性抗冻多肽具有很强的抑制冰晶生长的能力，由图6可以看出，与空 白对照(图6A)相比，添加了 0.5%(w/w)的特异性抗冻多肽，冰晶几乎不生长(图6B)。对纯化的特异性抗冻多肽利用蛋白质测序仪(Applied Biosystems Model 476A, Perkin Elmer Co. ΜΑ, U. S. Α)测定特异性抗冻多肽的氨基酸序列。得到其氨基酸全序列 为:Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Pro-Gly-Glu-Arg-Gly-Ser-Pro-Gly-Ala-Gln-Gly-Leu-Gln-Gl y-Pro-Argo
权利要求
一种抗冻多肽，其特征在于所述多肽的氨基酸序列为Gly Glu Arg Gly Phe Pro Gly Glu Arg Gly Ser Pro Gly Ala Gln Gly Leu Gln Gly Pro Arg。
2.根据权利要求1所述的抗冻多肽1，其特征在于所述抗冻多肽的分子量为2107Da0
3.一种抗冻多肽的制备方法，其特征在于以牛皮胶原蛋白为原料，采用碱性蛋白酶 对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到抗冻多肽；所述酶解条件为酶解PH为pH7-10、温 度30-55°C、酶解时间为20 - 60分钟、酶-底物配比为1:15 — 1 :20 (w/w);所述酶为碱性 蛋白酶。
4.根据权利要求2所述的抗冻多肽的制备方法，其特征在于以牛皮胶原蛋白为原料， 采用碱性蛋白酶对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到抗冻多肽；所述酶解条件为酶解 PH为9.0、温度45°C、酶解时间为30分钟、酶-底物配比为1:15 (w/w)0
5.根据权利要求3所述的抗冻多肽的制备方法，其特征在于所述分离纯化的手段包 括S印hadex G-50分子筛、Sepharose SP C-25离子交换色谱和RP-HPLC反相高效液相色■；並
6.根据权利要求4所述的抗冻多肽的制备方法，其特征在于所述分离纯化的 具体步骤为酶解产物首先利用S印hadex G-50凝胶色谱进行分离，洗脱液为去离子 水，流速为2mL/min，洗脱峰在225nm下进行测量；收集具有最佳抗冻活性的峰，再用 Sulfopropyl-Sepadex C-25阳离子交换色谱进行分离，洗脱液为NaCl浓度梯度为0-0. 5M 的0. Olmol/L pH7. O的磷酸缓冲液，流速为0. 5mL/min ；收集具有最佳抗冻活性的峰，利用 RP-HPLC反相高效液相色谱再进行进一步的分离，反相HPLC的分离条件是用10-90%乙腈 溶液作为洗脱液，流速为lmL/min，得到高纯度的特异性抗冻多肽。
7.根据权利要求6所述的抗冻多肽的制备方法，其特征在于所述高纯度的特异性抗 冻多肽的分子量为2107 Da0
全文摘要
本发明提供了一种抗冻多肽及其制备方法，该方法以牛皮胶原蛋白为原料，通过对碱性蛋白酶的酶解条件筛选与优化，分离纯化，得到特异性抗冻多肽，其分子量为2107Da，其氨基酸全序列为Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Pro-Gly-Glu-Arg-Gly-Ser-Pro-Gly-Ala-Gln-Gly-Leu-Gln-Gly-Pro-Arg。本发明突破了国内外现存的抗冻蛋白的研究思路和方法，克服从天然生物体中纯化抗冻蛋白数量的局限性以及国际FDA组织对转基因抗冻蛋白在食品应用中的安全性顾虑，获得基于食品源的高效抗冻多肽，为开发基于食品源的抗冻多肽以及探索其在食品、医学上的广泛应用奠定理论基础。
文档编号C07K1/16GK101921328SQ201010277569
公开日2010年12月22日 申请日期2010年9月10日 优先权日2010年9月10日
发明者汪少芸, 郑邦晓, 饶平凡 申请人:福州大学