专利名称：一种人凝血因子Ⅷ的制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种人凝血因子VDI的制备工艺，属于生物制药领域。
背景技术：
在血友病中，80%的病人患有血友病A，该类病人主要缺少正常人所拥有的人凝血 因子通，因此，人凝血因子VDI是治疗血友病的救命药。为了避免潜在的血液来源的病毒传 染，出于安全考虑，目前我国尚无对血液制品进口解禁的打算，我国市场上除了 SFDA审批 的德国拜耳公司的重组人凝血因子通，中国市场完全为国内企业生产，均为从血液中提取。 现有的凝血因子生产过程中均要求两步病毒灭活，而安全性及产品的治疗有效性(产品比 活性)最为关键。面对目前国内人凝血因子VDI的短缺，在现阶段研发生产安全性高、产品比 活性好的人凝血因子VDI有着积极的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种人凝血因子VDI的制备工艺。本发明的目的是这样实现的其制备工艺如下 制备工艺如下
(1)取符合药典要求的血浆冷沉淀室温融解l-2h，处理成1.8-2. 2cm的方块；
(2)冷沉淀溶解加入冷沉淀4.5-6倍重量份的含有6IU/ml肝素钠的注射用水溶解； 调节pH至6. 9-7. 1，同时搅拌12-18min ；
(3)铝胶吸附加入冷沉淀重量12%的含量为3%的铝胶；调节pH6.8-7. 2，搅拌 8-12min ；在离心温度18_22°C，转速14000rmp/min的状况下，离心12_18min ；去沉淀，取上 清液，再根据每毫升上清液的体积加入肝素钠2IU的方法加入肝素钠；
(4)酸沉淀调节pH6. 25-6. 45 ；降温至 10_13°C，转速 14000rmp/min，离心 12_18min， 去沉淀，取上清液；
(5)S/D灭活加入11%S/D溶液，至终溶液含S/D浓度为1%，终溶液含土温-80为1.0%， 含磷酸三丁酯0. 3% ；搅拌均勻后升温至22°C _26°C，连续搅拌5. 5-6. 5h ；
(6)过滤;
(7)DEAE s印HaroseFF层析柱平衡用平衡液平衡层析柱至出液pH值为6. 8-7. 2，平 衡液流速1.2 — 1.5L/分钟；
(8)层析平衡液流速0.8—1. OL/分钟； 洗涤洗涤液流速0. 8—1. OL/分钟； 洗脱洗脱液流速0. 5-0. 61/分钟；
(9)DEAE s印HaroseFF层析柱再生用1. 2mol/L NaCl再生层析柱，再生流速0. 5— 0. 6L/分钟；
DEAE sepHaroseFF层析柱处理0. 5mol/LNaOH洗涤层析柱，洗涤流速0. 5—0. 6L/分
钟；
4DEAE s印HaroseFF层析柱保存0. 2 mo 1/LNaOH洗涤层析柱并保存，洗涤流速0. 8— 1. OL/分钟；
(10)用透析液超滤，配液用十万分子量膜的超滤器超滤得收集液，预浓缩至收集液 的一半，将制品浓缩转移到配制罐内搅拌均勻，配液；
(11)分装；
(12)冻干；
①制品常温进柜；
②隔板10分钟从常温降至0°C，保持30分钟；
③隔板30分钟从0°C降到_40°C，在_40°C保持1.5小时；
④开真空泵到真空达到0.3mbar稳定；
⑤1小时隔板升温到_33°C，保持1小时；
⑥5小时隔板升温到0°C，保持30小时；
⑦2小时隔板升温到10°C，保持6小时；
⑧2小时隔板升温到35°C，保持6小时；
⑨1小时使真空到0.05mbar，保持1小时；
(13)干热病毒灭活
99. 5 士 0. 5 °C水浴干热灭活30分钟； 其中
先制备混合液，混合液按29. 41g柠檬酸三钠、90g甘氨酸和1. Ilg氯化钙混合后加注 射用水至1L，控制pH值6. 8-7. 2的方法制备；
平衡液按IOOml 1. 2mol/L的NaCl和IOOml混合液加注射用水至1L，控制pH值 6. 8-7. 2的方法制备；
洗脱液按208 ml 1. 2mol/L的NaCl和IOOml混合液加注射用水至1L，控制pH值 6. 8-7. 2的方法制备；
洗涤液含0. 14 mol/L NaCl和0. 02mol/L柠檬酸三纳，余量为水，pH在6. 8-7. 2 ； 透析液含200mmol/L NaCl、10mmol/L柠檬酸三钠、120mmol/L甘氨酸和lmmol/L氯化 钙，余量为水，PH在6. 8-7. 2 ；
11%S/D溶液按IlOml吐温-80和33ml磷酸三丁酯加注射用水至lKg，搅拌至清亮的方 法制备；
以上百分比除特别说明，其余均为重量百分比。本发明采用离子交换层析技术，并在生产工艺采用铝胶吸附及酸沉淀去除杂质， 使产品比活性显著提高，制品质量得到明显改善，同时产品得率提高了 30-35%;此外生产 过程中采用S/D法去除脂包膜病毒及99. 5士0. 5°C干热法去除非脂包膜病毒，经过这2次病 毒灭活步骤显著提高了临床用药的安全性。
具体实施例方式实施例
一、基本要求
1、原料血浆的采集和质量应符合血液制品生产用人血浆的规定；2、生产设备管线器具应清洁消毒等。二、主要试剂配制
0.lmol/L醋酸量取6. 6体积的冰醋酸与93. 4体积的水混合；
1.2mol/L氯化钠将70. 2g氯化钠溶于水，定容至IL ；
混合液，混合液按29. 41g柠檬酸三钠、90g甘氨酸和1. Ilg氯化钙混合后加注射用水 至1L，控制pH值6. 8-7. 2的方法制备；
平衡液按IOOml 1. 2mol/L的NaCl和IOOml混合液加注射用水至1L，控制pH值 6. 8-7. 2的方法制备；
洗脱液按208 ml 1. 2mol/L的NaCl和IOOml混合液加注射用水至1L，控制pH值 6. 8-7. 2的方法制备；
洗涤液含0. 14 mol/L NaCl和0. 02mol/L柠檬酸三纳，余量为水，pH在6. 8-7. 2 ； 透析液含200mmol/L NaCl、10mmol/L柠檬酸三钠、120mmol/L甘氨酸和lmmol/L氯化 钙，余量为水，PH在6. 8-7.2 ；
11%S/D溶液按IlOml吐温-80和33ml磷酸三丁酯加注射用水至lKg，搅拌至清亮的方 法制备；
二、工艺工程
本发明具体实施方式
在发明内容中得以体现，发明内容可以直接用于实施例。括制备工艺如发明内容中所述的包括取冷沉淀室温融解l_2h，处理成2cm的方 块；冷沉淀溶解；铝胶吸附；酸沉淀；S/D灭活；过滤；DEAE s印HaroseFF层析柱平衡；DEAE s印HaroseFF层析柱再生、处理和保存；层析；洗涤；洗脱；超滤，配液；分装；冻干；干热灭 活°
权利要求
一种人凝血因子Ⅷ的制备工艺，其特征是制备工艺如下(1)取符合药典要求的血浆冷沉淀室温融解1 2h，处理成1.8 2.2cm的方块；(2)冷沉淀溶解加入冷沉淀4.5 6倍重量份的含有6IU/ml肝素钠的注射用水溶解；调节pH至6.9 7.1，同时搅拌12 18min；(3)铝胶吸附加入冷沉淀重量12%的含量为3%的铝胶；调节pH6.8 7.2，搅拌8 12min；在离心温度18 22℃,转速14000rmp/min的状况下，离心12 18min；去沉淀，取上清液，再根据每毫升上清液的体积加入肝素钠2IU的方法加入肝素钠；(4)酸沉淀调节pH6.25 6.45；降温至10 13℃，转速14000rmp/min，离心12 18min，去沉淀，取上清液；(5)S/D灭活加入11%S/D溶液，至终溶液含S/D浓度为1%,终溶液含土温 80为1.0%，含磷酸三丁酯0.3%；搅拌均匀后升温至22℃ 26℃，连续搅拌5.5 6.5h；(6)过滤；(7)DEAE sepHaroseFF层析柱平衡 用平衡液平衡层析柱至出液pH值为6.8 7.2，平衡液流速1.2—1.5L/分钟；(8)层析平衡液流速0.8—1.0L/分钟；洗涤洗涤液流速0.8—1.0L/分钟；洗脱洗脱液流速0.5—0.6L/分钟；(9) DEAE sepHaroseFF层析柱再生用1.2mol/L NaCl再生层析柱，再生流速0.5—0.6L/分钟；DEAE sepHaroseFF层析柱处理0.5mol/LNaOH洗涤层析柱，洗涤流速0.5—0.6L/分钟；DEAE sepHaroseFF层析柱保存0.2 mol/LNaOH洗涤层析柱并保存，洗涤流速0.8—1.0L/分钟；(10) 用透析液超滤，配液用十万分子量膜的超滤器超滤得收集液，预浓缩至收集液的一半，将制品浓缩转移到配制罐内搅拌均匀，配液；(11)分装；(12)冻干；①制品常温进柜；②隔板10分钟从常温降至0℃，保持30分钟；③隔板30分钟从0℃降到 40℃，在 40℃保持1.5小时；④开真空泵到真空达到0.3mbar稳定；⑤1小时隔板升温到 33℃，保持1小时；⑥5小时隔板升温到0℃，保持30小时；⑦2小时隔板升温到10℃，保持6小时；⑧2小时隔板升温到35℃，保持6小时；⑨1小时使真空到0.05mbar，保持1小时；(13)干热病毒灭活 99.5±0.5℃水浴干热灭活30分钟；其中先制备混合液，混合液按29.41g柠檬酸三钠、90g甘氨酸和1.11g 氯化钙混合后加注射用水至1L，控制pH值6.8 7.2的方法制备；平衡液按100ml 1.2mol/L 的NaCl和100ml混合液加注射用水至1L，控制pH值6.8 7.2的方法制备；洗脱液按208 ml 1.2mol/L的 NaCl和100ml混合液加注射用水至1L，控制pH值6.8 7.2的方法制备；洗涤液含0.14 mol/L NaCl和0.02mol/L柠檬酸三纳，余量为水， pH在6.8 7.2；透析液含200mmol/L NaCl、10mmol/L柠檬酸三钠、120mmol/L甘氨酸和1mmol/L 氯化钙，余量为水，pH在6.8 7.2；11%S/D溶液按110ml吐温 80和33ml磷酸三丁酯加注射用水至1Kg，搅拌至清亮的方法制备；以上百分比除特别说明，其余均为重量百分比。
全文摘要
本发明涉及一种人凝血因子Ⅷ的制备工艺，属于生物制药领域。制备工艺包括取冷沉淀室温融解1-2h，处理成1.8-2.2cm的方块；冷沉淀溶解；铝胶吸附；酸沉淀；S/D灭活；过滤；DEAEsepHaroseFF层析柱平衡；DEAEsepHaroseFF层析柱再生、处理和保存；层析；洗涤；洗脱；超滤，配液；分装；冻干；干热灭活。本发明它采用离子交换层析技术，并在生产工艺采用铝胶吸附及酸沉淀去除杂质，使产品比活性显著提高，制品质量得到明显改善，同时产品得率提高了30-35%；此外生产过程中采用S/D法去除脂包膜病毒及99.5±0.5℃干热法去除非脂包膜病毒，经过这2次病毒灭活步骤显著提高了临床用药的安全性。
文档编号C07K14/755GK101967188SQ201010534849
公开日2011年2月9日 申请日期2010年11月8日 优先权日2010年11月8日
发明者何淑琴, 尧振, 廖昕晰, 梁小明, 邓志华 申请人:江西博雅生物制药股份有限公司