专利名称：α-糖基神经酰胺新异构体分子结构及其制备方法
α-糖基神经酰胺新异构体分子结构及其制备方法技术领域
本发明是一种α -糖基神经酰胺新异构体的制备方法和发明系列α -糖基神经酰 胺新分子结构，可应用于抗肿瘤免疫治疗，感染性疾病如乙肝、疟疾和几种自身免疫疾 病如糖尿病的生物治疗及保湿保健方面的应用等，涉及碳链构建新方法和提供新有机分 子的领域。
技术背景
未来的肿瘤治疗趋势可以肯定将不是更强烈的化放疗，而是高特异性、低毒性 且更为精确聪明的方法，免疫生物治疗无疑将为肿瘤患者带来更多的福音。21世纪肿 瘤免疫学面临着诸多新的挑战，如果将其与整个免疫学、生物医学的发展和其他科学技 术的进步结合起来分析，确实同时孕育着新的难以限定的机遇。在20世纪的90年代 Kirin Breweries等发现Agelas mauritianus海绵的提取物含活性分子为a_半乳糖神经酰胺1 (a-galactosylceramide, a-GalCer，KRN7000,见图1 ；后发现化合物2)具有免疫生物治 疗癌症活性；随着对肿瘤免疫认识的提高和T细胞识别机制的突破性进展，神经鞘糖脂 重要的生物活性及其对人类重大疾病治疗的潜在重大性引发全世界许多研究组致力于其 新异构体合成。本发明瞄准国际分子免疫学和分子生物学技术发展前沿，针对我国重大 疾病的创新潜在药物研发的需求，合成新的a_糖基神经酰胺类系列物。
a-GalCer的抗肿瘤免疫生物治疗机理为活化NKT细胞NKT (natural killer T cell) 细胞为固有免疫细胞，可通过其TCR识别结合树突状细胞表面CDld提呈的a_半乳糖神 经酰胺及其类似物的糖脂类抗原而被相互作用而被激活。活化NKT细胞具有细胞毒作 用，可通过分泌表达穿孔素、颗粒酶和FasL等细胞毒性介质，使肿瘤和病毒感染的靶细 胞溶解破坏或发生凋亡；也可通过分泌白介素-4 (IL-4)和干扰素-Y (IFN-Y)等 细胞因子，发挥免疫调节作用。因此NKT细胞作为一种新型免疫调节细胞可参与自身免 疫疾病的发病和防治、病原微生物的防御、肿瘤免疫监视和移植耐受等免疫应答。故此 在治疗原发性肿瘤及其转移，感染性疾病如乙肝、疟疾及几种自身免疫疾病如糖尿病等 都有巨大的应用潜力。国外已开始利用a-GalCer激活的NKT细胞进行临床研究。随着 分子免疫学和分子生物学技术的不断进展，NKT细胞疗法将不断完善并应用于临床，为 肿瘤及肿瘤转移的诊治和预防开辟又一条新的有效途径。
目前在a-半乳糖神经酰胺结构优化及构效关系对促进生物活性影响的研究很活 跃。CD1，是细胞表面系列的糖蛋白，Wilson等揭示了 CDld的原始结构，显示了其整 体皱折与MHC-I类蛋白质相似，a链分为al，a2,和a3三大区域，并与β 2m密切关 联。广泛的氢键网络紧紧地将糖的前端锁住定位，这对糖脂进行了定位和稳定，以便提 交给有关的TCR。在其过程TCR/ α -GalCer/CDld在界面形成三元复合物，TCR的α 链的高度保守，对α-GalCer所展现出来的高特异性，表现在对神经酰胺2、3、4位特定 结构和长链酸的亲脂要求和对a_半乳糖基上2’羟基和a-糖苷键的特定要求。
当今人类合成α-半乳糖神经鞘胺同系物的目的主要有如下四点(1)由于 天然糖活性物稀少提纯困难，而通过合成的糖活性物纯度和产量能满足未来生物治疗需 求；(2)通过合成糖系列物筛选出比天然活性物活性高的糖脂抗原；( 有目的改变分 子不同结构单元，以助研究NKT细胞激活反应的机理及其与分泌细胞因子的构效和量效 关系的规律；(4)对a_半乳糖神经酰胺及其类同物的合成研究可以简化合成策略。如 在合成关键分子神经酰胺受体时选用不同单糖如D-木糖或D-阿拉伯糖等；在立体控制 a_糖苷键的研究有关糖基上保护基和神经酰胺上不同保护基对两种α-异构体和β-异 构体影响研究，为克服KRN7000的低溶解度问题，有人在长链脂肪酸的8，9位增加顺式 双键，此分子对鼠和人的NKT细胞都有在低浓度下促细胞因子产生的效应。最近硫酸酯 化a_半乳糖神经酰胺(硫苷脂sulfatide)受到了极大的关注，3’-硫酸酯化a-半乳糖神 经酰胺在诱导扩增人的NKT的活性比KRN7000还要高。硫苷脂广泛存在哺乳动物的血 清中，被CDla, CDlb,和CDlc递呈给特定T细胞或能刺激受硫苷脂限制的CDla递呈的 T细胞增生，这些T细胞有别于与a-半乳糖神经酰胺反应的NKT，最近有关于硫苷脂在 自身免疫神经脱髓鞘发病机理中有促T细胞增生作用。有关硫酸酯化a_半乳糖神经酰胺 合成是利用神经酰胺前体3，4位羟基苄基保护；硫酸酯化时糖基使用了烦琐的保护基过 程
发明内容
本发明为改进现有技术的一些不足之处，对现有技术进行了改进，提供了一种 涉及α-糖基神经酰胺新异构体的制备方法和发明系列α-糖基神经酰胺新分子结构，具 体的技术方案如下本发明涉及α-糖基神经酰胺新异构体分子结构，所述的α-糖基神经酰胺新异构体 中神经鞘氨醇的C4-C5位为顺式双键，糖基R5为单糖或多糖，R3为长链脂肪酸残基， 糖基上3’位或3’、6’位羟基被硫酸酯化，R4为烃基，具体结构如下
本发明所述的α-糖基神经酰胺新异构体分子的制备方法，具体制备步骤如 下(1)、神经鞘氨醇中间体顺式异构体的合成 a、1-炔烃、相转移催化剂先与30%-55%浓碱先混合，温度35 45°C，搅拌1 4小时，然后将溶在极性有机溶剂的保护醛慢慢滴加到反应液中，再继续反应2小时，分 离获得炔醇，经过不同的步骤，获得其他基团；1-炔烃与保护醛的摩尔比1:1 2，1-炔 烃与相转移催化剂的摩尔比1:0.1 0.8，浓碱与极性有机溶剂的体积比1:1 2。b、用专 用催化剂把炔醇转化成顺式烯醇，苯甲酰基保护仲醇羟基，水解缩醛，伯醇羟基保护后， 再叠氮化，伯醇羟基去保护，获神经鞘氨醇中间体顺式异构体；(2)、α-神经酰胺顺式异构体糖基化反应糖羟基除异头碳羟基外先用一定保护取代基保护，在1’异头碳加上活化基团，然后 在催化剂和一定优化条件下实现对α-糖苷键立体控制，其中进行长链脂肪酸缩合；去 除糖分子羟基上保护取代基，其过程还包括关键基团的保护和去保护；(3)、α-糖基神经酰胺顺式异构体硫酸酯化采用高区域选择性直接上硫酸基，在选定的溶剂中，催化剂与糖上的3’，4’位上羟基 形成中间体，中间体再与当量硫酸化剂反应，根据调节反应温度和时间高区域选择性在 3’位或3’、6’位加上硫酸基；(4)、利用核磁共振的氢谱、碳谱和质谱进行结构确定。
本发明所述的糖基R5包括核糖、脱氧核糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、氨基葡 萄糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、岩藻糖，乳糖及合成组合的二糖，多糖，还包括在以 上糖的羟基上酰基化、硫酸化、磷酸化，及羟基上连接其他芳香族环、多种氨基酸。
本发明所述的α-糖基神经酰胺新异构体中ζ表示包括氧-糖基化、硫-糖基 化、碳-糖基化、氮-糖基化。
本发明所述的α -糖基神经酰胺新异构体中Z表示包括糖基与顺式神经酰胺之间 通过醚键、酯基、碱基、烃基连接而成。
本发明所述的神经酰胺则由神经鞘氨醇(sphingostee)和长链脂肪酸缩合而成， 长链脂肪酸残基R3包括C1-C27直链烃，在长链上包括不同位置的双键(顺式或反 式)、芳香基、氨基酸残基、环烷烃、环烯烃、杂环。
本发明所述的α-糖基神经酰胺新异构体在合成过程中，采用炔醇碳链构建路 线，1-炔烃包括C10-C18直链烃，其上可有双键或叁键，羟基、烃基，浓碱是指碱金属 或碱土金属的氢氧化物、碱金属或碱土金属的醇盐，保护醛是指(R)-甘油醛缩酮， Garner醛，相转移催化剂指季铵盐，季鳞盐，冠醚，季铵碱，烷基磺酸盐。
本发明制备神经鞘氨醇中间体顺式异构体的优点(1)采用炔醇碳链构建路 线，顺反立体选择性高；(2)反应在温和条件下进行，操作方便；(3)缩短了反应步 骤，催化剂与原料成本低，具有显著的经济性。(4)收率较以往工艺高。
图 1 是已有发明分子结构 a-galactosylceramide，a-GalCer，KRN7OOO0
图2是实施例2中产物3’-硫酸酯化的a_半乳糖神经酰胺顺式异构体3和3’， 6’_硫酸酯化的a_半乳糖神经酰胺顺式异构体4结构示意图。
图3是实施例3中产物3’-硫酸酯化的a_半乳糖神经酰胺顺式异构体5和3’， 6’_硫酸酯化的a_半乳糖神经酰胺顺式异构体6结构示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作详细说明。
实施例1神经鞘氨醇中间体顺式异构体的合成1)、1-炔烃、相转移催化剂先与30%-55%浓碱混合，温度35 45°C，搅拌1 4小时，然后溶在极性有机溶剂的保护醛慢慢滴加 到反应液中，再继续反应2小时，分离获得炔醇。1-炔烃与保护醛的摩尔比1:1 2， 1-炔烃与相转移催化剂的摩尔比1:0.1 0.8，浓碱与极性有机溶剂的体积比1:1 2。 2)、用专用催化剂把炔醇转化成顺式烯醇，苯甲酰基保护仲醇羟基，水解缩醛，伯醇羟 基保护后，再叠氮化；伯醇羟基去保护，获神经鞘氨醇中间体顺式异构体。
神经酰胺顺式异构体糖基化反应糖羟基除异头碳羟基外先用一定保护取代基保护，保护基不但起保护作用还激化异 头碳反应性，然后在1’异头碳加上活化基团，在催化剂和一定优化条件下实现对a_糖苷 键立体控制，其中进行长链脂肪酸缩合。然后去除糖分子羟基上保护取代基，其过程还 包括关键基团的保护和去保护。
糖基神经酰胺顺式异构体硫酸酯化采用高区域选择性直接上硫酸基，在选定的溶剂中，催化剂与糖上的3’，4’位上羟基 形成中间体，中间体再与2当量硫酸化剂反应，根据调节反应温度和时间高区域选择性 在3’位或3’、6’位加上硫酸基。
利用核磁共振的氢谱、碳谱和质谱进行结构确定。
实施例2按照实施例1的制备步骤和方法，反应在氮气氛围中进行，1摩尔的1-十五炔、0.5 摩尔的四丁基溴化铵加入到45%氢氧化钾600毫升中，在40°C激烈搅拌2小时，然后把 溶在700毫升CHQ3W 1.3摩尔(R)-甘油醛缩丙酮慢慢滴加入上述液中，再继续反应 2小时，薄层色谱法过程诊断，出现新的产物。分离有机相，利用二氯甲烷对反应化合 物进行萃取水相，有机相经洗涤、干燥后，浓缩，经过硅胶柱色谱分离获得纯化的相应 炔醇0.65摩尔。用专用催化剂把炔醇转化成顺式烯醇，苯甲酰基保护仲醇羟基，水解缩 醛，伯醇羟基保护后，再叠氮化。伯醇羟基去保护，获神经鞘氨醇中间体顺式异构体。 神经酰胺顺式异构体与半乳糖a_糖基化，接上十七酸；a_半乳糖神经酰胺顺式异构体经 硫酸酯化，获产物3’-硫酸酯化的a-半乳糖神经酰胺顺式异构体3和3’，6’-硫酸酯化的 a_半乳糖神经酰胺顺式异构体4，如图2所示，利用核磁共振的氢谱、碳谱和质谱进行结 构确定。
实施例3按照实施例1的制备步骤和方法，反应在氮气氛围中进行，1摩尔的1-十五炔烃、 0.6摩尔的十二烷基磺酸钠加入到35%氢氧化锂600毫升中，在40°C激烈搅拌2.5小时， 然后把溶在600毫升甲苯的1.5摩尔(R) -Garner醛慢慢滴加入上述液中，再继续反应 3小时，薄层色谱法过程诊断，出现新的产物。分离有机相，利用二氯甲烷对反应化合 物进行萃取水相，有机相经洗涤、干燥后，浓缩，经过硅胶柱色谱分离获得纯化的相应 炔醇0.55摩尔。用专用催化剂把炔醇转化成顺式烯醇，苯甲酰基保护仲醇羟基，水解缩 醛，伯醇羟基保护后，再叠氮化。伯醇羟基去保护，获神经鞘氨醇中间体顺式异构体。 神经酰胺顺式异构体与半乳糖a_糖基化，接上8-苯基辛酸；a_半乳糖神经酰胺顺式异构 体经硫酸酯化，获3’-硫酸酯化的a-半乳糖神经酰胺顺式异构体5和3’，6’-硫酸酯化的 a_半乳糖神经酰胺顺式异构体6，如图3所示，利用核磁共振的氢谱、碳谱和质谱进行结 构确定。7
项目资助浙江省重点科技计划2005C22037 ；国家自然科学基金3087055权利要求
1. 一类α-糖基神经酰胺新异构体分子结构，其特征是所述的α-糖基神经酰胺新 异构体中神经鞘氨醇的C4-C5位为顺式双键，糖基R5为单糖或多糖，R3为长链脂肪酸 残基，糖基上3’位或3’、6’位羟基被硫酸酯化，R4为烃基，具体结构如下
2.根据权利要求1所述的α-糖基神经酰胺新异构体分子结构的制备方法，其特征在于，具体制备步骤如下(1)、神经鞘氨醇中间体顺式异构体的合成a、1-炔烃、相转移催化剂先与30%-55%浓碱混合，温度35 45°C，搅拌1 4小 时，然后将溶在极性有机溶剂的保护醛慢慢滴加到反应液中，再继续反应2小时，分离 获得炔醇，经过不同的步骤，获得其他基团；1-炔烃与保护醛的摩尔比1:1 2，1-炔烃 与相转移催化剂的摩尔比1:0.1 0.8，浓碱与极性有机溶剂的体积比1:1 2 ； b、用专用 催化剂把炔醇转化成顺式烯醇，苯甲酰基保护仲醇羟基，水解缩醛，伯醇羟基保护后，再 叠氮化，伯醇羟基去保护，获神经鞘氨醇中间体顺式异构体；(2)、神经酰胺顺式异构体糖基化反应
3.根据权利要求2所述的α-糖基神经酰胺新异构体分子结构的制备方法，其特征在 于，所述的糖基R5包括核糖、脱氧核糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、氨基葡萄糖、半乳 糖、甘露糖、鼠李糖、岩藻糖，乳糖及合成组合的二糖、多糖，还包括在以上糖的羟基 上酰基化、硫酸化、磷酸化，及羟基上连接其他芳香族环、多种氨基酸。
4.根据权利要求2所述的α-糖基神经酰胺新异构体分子结构的制备方法，其特征在 于，所述的α-糖基神经酰胺新异构体中Z表示包括氧-糖基化、硫-糖基化、碳-糖基 化、氮-糖基化。
5.根据权利要求2所述的α-糖基神经酰胺新异构体分子结构的制备方法，其特征在 于，所述的α-糖基神经酰胺新异构体中Z表示包括糖基与顺式神经酰胺之间通过醚键、 酯基、碱基、烃基连接而成。
6.根据权利要求2所述的α-糖基神经酰胺新异构体分子结构的制备方法，其特征在 于，所述的长链脂肪酸残基R3包括C1-C27直链烃，在长链上包括不同位置的双键(顺2式或反式)、芳香基、氨基酸残基、环烷烃、环烯烃、杂环。
7.根据权利要求2所述的所述的α-糖基神经酰胺新异构体分子结构的制备方法，其 特征在于，所述的α-糖基神经酰胺新异构体在合成过程中，采用炔醇碳链构建路线， 1-炔烃包括C10-C18直链烃，其上可有双键或叁键，羟基、烃基。
8.根据权利要求2所述的所述的α-糖基神经酰胺新异构体分子结构的制备方法，其 特征在于，采用炔醇碳链构建路线，所述的浓碱是指碱金属或碱土金属的氢氧化物、碱 金属或碱土金属的醇盐。
9.根据权利要求2所述的所述的α-糖基神经酰胺新异构体分子结构的制备方法，其 特征在于，采用炔醇碳链构建路线，所述的保护醛是指(R) _甘油醛缩酮，Garner醛。
10.根据权利要求2所述的所述的α-糖基神经酰胺新异构体分子结构的制备方法， 其特征在于，采用炔醇碳链构建路线，所述的相转移催化剂指季铵盐，季鳞盐，冠醚， 季铵碱，烷基磺酸盐。
全文摘要
本发明是α-糖基神经酰胺新异构体分子结构及其制备方法，可应用于抗肿瘤免疫治疗，感染性疾病如乙肝、疟疾和几种自身免疫疾病如糖尿病的生物治疗及保湿保健方面的应用等，涉及碳链构建新方法和提供新有机分子的领域，本发明的α-糖基神经酰胺新异构体中神经鞘氨醇的C4-C5位为顺式双键，糖基R5为单糖或多糖，R3为长链脂肪酸残基，糖基上3'位或3'、6'位羟基被硫酸酯化，R4为烃基，本发明采用炔醇碳链构建路线，顺反立体选择性高；反应在温和条件下进行，操作方便；缩短了反应步骤，催化剂与原料成本低，具有显著的经济性，收率较以往工艺高。
文档编号C07H15/12GK102020685SQ20101055107
公开日2011年4月20日 申请日期2010年11月19日 优先权日2010年11月19日
发明者俞永平, 崔艳丽, 张勇民, 毛建卫 申请人:浙江大学