专利名称：柱层析法从组分i中提取人纤维蛋白原的方法
技术领域：
本发明涉及生物制药领域，特别是一种柱层析法从组分I中提取人纤维蛋白原的方法。
背景技术：
人纤维蛋白原(Human Fibrinogen)即人凝血因子I，是血浆蛋白的主要成份之一，分子量约为34万，等电点5. 5，加温至57°C很快变性。它在血浆中的含量高，约为2-4g/ L，是血浆粘滞性的主要决定因素，肝脏是合成纤原的主要场所。人纤维蛋白原(Fg)能迅速提高血液中纤维蛋白原的含量，通过凝血酶的作用，使纤维蛋白原转化为不溶的纤维蛋白，网络血液中血球等有形成分凝成血块，达到止血的目的。用于治疗产后大出血和因大手术、外伤或内出血等引起的纤维蛋白原缺乏而造成的凝血障碍，以及胸廓、腹部和尿路等大型外科手术的出血等，对治疗血友病的合并症也有效。由于血浆中纤维蛋白原含量十分丰富，并且纤维蛋白原分子量很大，所以纤维蛋白原较易从血浆中分离提纯，而且该产品临床需求量也较大，因此分离纯化人纤维蛋白原， 不仅提高宝贵血浆资源的综合利用，同时在医药卫生方面也有较大意义。人纤维蛋白原是已有国家标准的的血液制品，收录在2010年版《中国药典》三部中，该药在国内已经临床使用多年，其生产工艺已比较成熟，近年也有专利申请号为 200810046747. 5和专利申请号为200910237204. 6的人纤维蛋白原的生产方法，但目前国内外大多数血液制品厂家基本上都采用低温乙醇法以血浆为原料，从Cohn6法的组分I中提取人纤维蛋白原，该法主要缺陷为制品的纯度较低，一般70 80%，外观较差，质量稳定性差。也有报导从冷沉淀中提取人纤维蛋白原，由于冷沉淀中的纤维蛋白原的含量较低，产品最终收率没有从FI高，并且冷沉淀是作为人凝血因子VIII的起始原料，如果用于生产人纤维蛋白原，势必降低人凝血因子VIII的生产量，收率低。因此，人纤维蛋白原的制备方法亟待改进和创新。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明的目的就是提供一种柱层析法从组分I中提取人纤维蛋白原的方法，可有效解决人纤维蛋白原纯度高，稳定性好，收率高的问题。本发明解决的技术方案是，由以下步骤实现(1)组分I沉淀的溶解及过滤沉淀用5 15倍体积的第一溶解液，20_26°C搅拌溶解1小时，溶解后的制品澄清过滤，计量制品体积；(2) S/D灭活将制品温度控制在M ，按每升滤液加IOOml的比例，在搅拌状态下缓慢加入质量浓度的11% S/D溶液，保持制品温度M 6小时；(3)第一次甘氨酸沉淀计量步骤2中灭活液体积，按1. 5 2. 2mol/L浓度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷却至2 8°C，以4200rpm的速度进行连续离心分离40分钟，设定温度0°C，收集沉淀； (4) 一次沉淀的溶解及过滤沉淀用5 10倍体积的第二溶解液，在20_26°C搅拌溶解1小时，溶解后过滤，收集滤液；(5)柱层析DEAE_650M凝胶先用枸橼酸缓冲液平衡，再将步骤中的滤液上柱进行层析，收集流出液，层析结束后用3倍柱床体积的枸橼酸缓冲液洗涤凝胶，并入流出液中；(6)第二次甘氨酸沉淀层析流出液按1. 5 2. 2mol/L浓度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷却至2 8°C，用离心机以4200rpm的速度进行连续离心分离40分钟，_5°C收集沉淀；(7) 二次沉淀的溶解及过滤沉淀用3 5倍体积的第三溶解液，室温溶解1小时， 溶解后，过滤；(8)配制检测过滤后制品蛋白质含量，根据蛋白质含量用第三溶解液进行配制， 使最终制品中蛋白含量为25g/L ；(9)分装及冻干配制后制品除菌分装于50ml玻璃瓶中，25ml/瓶，分装后冻干；(10)干热灭活步骤9中冻干后制品置于水浴中，保持水浴温度100°C，30分钟。该方法是采用柱层析技术并结合甘氨酸沉淀法从组分I(FI)中提取人纤维蛋白原，该生产工艺中采用的甘氨酸沉淀法比传统的低温乙醇沉淀法条件温和，能够保证制品的活性和制品的稳定性，加入了 DEAE-650M凝胶吸附过程，能够吸附生产过程中夹带的其它凝血因子，进一步保障了制品的稳定，以组分I作原料能够提高每升血浆人纤维蛋白原收率。该法采用甘氨酸作为沉淀剂，使最终制品中夹带有0. 5%左右的甘氨酸，甘氨酸与盐酸精氨酸联合作为制品稳定剂，能够增强制品冻干后的稳定性。所以该生产工艺能够提高制品的质量，纯度、稳定性和最终产品的收率，是制备人纤维蛋白原的创新。
四
图1为本发明的制备工艺流程图。图2为本发明所采用的S/D法对PRV的灭活动力学曲线图。图3为本发明所采用的S/D法处理Sindbis的灭活动力学曲线图。图4为本发明所采用的干热法病毒灭活对EMC的灭活动力学曲线图。
五具体实施例方式以下结合工艺流程图对本发明的具体实施方式
作详细说明。由图1所示，本发明在具体实施中是由以下步骤实现的(1)组分I沉淀的溶解及过滤沉淀用5 15倍体积的第一溶解液，20_26°C搅拌溶解1小时，溶解后的制品澄清过滤，计量制品体积；所述的第一溶解液为每IOOOml注射用水溶液中含有10 14g柠檬酸三钠，9gNaCl，8 12g蔗糖，2 4gTris(三羟甲基氨基甲烷)，3 5g赖氨酸盐酸盐，用HCl调整pH值6. 90-7. 10 ；(2) S/D灭活将制品温度控制在M ，按每升滤液加IOOml的比例，在搅拌状态下缓慢加入质量浓度的11% S/D灭活剂，保持制品温度M ^°C 6小时；所述的11% S/D溶液为，IOOOml注射用水溶液中含有IlOg吐温-80，3 磷酸三丁酯；所述的S/D灭活剂，即用有机溶剂/去污剂混合物(S/D)破坏包膜病毒的脂膜，一旦破坏脂膜的病毒不可能再与感染细胞结合，该法能有效的灭活脂包膜病毒，但不能灭活非包膜病毒；(3)第一次甘氨酸沉淀计量步骤2中灭活液体积，按1. 5 2. 2mol/L浓度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷却至2 8°C，以4200rpm的速度进行连续离心分离40分钟，设定温度0°C，收集沉淀；(4) 一次沉淀的溶解及过滤沉淀用5 10倍体积的第二溶解液，在20_26°C搅拌溶解1小时，溶解后过滤，收集滤液；所述的第二溶解液为，IOOOml注射用水溶液中含有 5 IOg柠檬酸三钠，加HCl调整pH值6. 90-7. 10 ；(5)柱层析DEAE_650M凝胶先用枸橼酸缓冲液平衡，再将步骤中的滤液上柱进行层析，收集流出液，层析结束后用3倍柱床体积的枸橼酸缓冲液洗涤凝胶，并入流出液中，硅胶柱层析流动相为水相；(6)第二次甘氨酸沉淀层析流出液按1. 5 2. 2mol/L浓度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷却至2 8°C，用离心机以4200rpm的速度进行连续离心分离40分钟，_5°C收集沉淀；(7) 二次沉淀的溶解及过滤沉淀用3 5倍体积的第三溶解液，室温溶解1小时，溶解后，过滤；所述的第三溶解液为，IOOOml注射用水溶液中含有14 16. 5g的枸橼酸钠，30 55g盐酸精氨酸，7 9g的氯化钠，用HCl或NaOH调整溶液pH6. 9 7. 1 ；(8)配制检测过滤后制品蛋白质含量，根据蛋白质含量用第三溶解液进行配制， 使最终制品中蛋白含量为25g/L ；(9)分装及冻干配制后制品除菌分装于50ml玻璃瓶中，25ml/瓶，分装后冻干；(10)干热灭活步骤9中冻干后制品置于水浴中，保持水浴温度100°C，30分钟。所述的步骤(1)中所称的澄清过滤采用滤板澄清过滤，其滤板孔径为0. 7 μ m 1. 0 μ m ；所述的步骤(3)和步骤(6)中甘氨酸的浓度为1. 5 2. 2mol/L。本发明在具体实施中，还可由以下实施例给出实施例1 本发明在具体实施中由以下步骤实现(1)组分I沉淀的溶解及过滤沉淀用5倍体积的第一溶解液，20°C搅拌溶解1小时，溶解后的制品澄清过滤，计量制品体积；所述的第一溶解液为每IOOOml注射用水溶液中含有10g柠檬酸三钠，9g NaCl，8g蔗糖，2g Tris，3g赖氨酸盐酸盐，用HCl调整pH值为 6. 90 ；灭活将制品温度控制在M°C，按每升滤液加IOOml的比例，在搅拌状态下缓慢加入质量浓度的11% S/D灭活剂，保持制品温度6小时；(3)第一次甘氨酸沉淀计量步骤2中灭活液体积，按1. 5mol/L浓度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷却至2°C，以4200rpm的速度进行连续离心分离40分钟，0°C收集沉淀；(4) 一次沉淀的溶解及过滤沉淀用5倍体积的第二溶解液，在20°C搅拌溶解1小时，溶解后过滤，收集滤液；所述的第二溶解液为，IOOOml注射用水溶液中含有5g柠檬酸三钠，加HCl调整pH值为6. 90 ；(5)柱层析DEAE_650M凝胶先用枸橼酸缓冲液平衡，再将步骤中的滤液上柱进行层析，收集流出液，层析结束后用3倍柱床体积的枸橼酸缓冲液洗涤凝胶，并入流出液中；(6)第二次甘氨酸沉淀层析流出液按1. 5mol/L浓度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷却至2°C，用离心机以4200rpm的速度进行连续离心分离40分钟，_5°C收集沉淀；(7) 二次沉淀的溶解及过滤沉淀用3倍体积的第三溶解液，室温溶解1小时，溶解后，过滤；所述的第三溶解液为，IOOOml注射用水溶液中含有14g的枸橼酸钠，30g盐酸精氨酸，7g的氯化钠，用HCl或NaOH调整溶液pH为6. 9 ；(8)配制检测过滤后制品蛋白质含量，根据蛋白质含量用第三溶解液进行配制， 使最终制品中蛋白含量为25g/L ；(9)分装及冻干配制后制品除菌分装于50ml玻璃瓶中，25ml/瓶，分装后冻干；(10)干热灭活步骤9中冻干后制品置于水浴中，保持水浴温度100°C，30分钟。所述的步骤(1)中所称的澄清过滤采用滤板澄清过滤，其滤板孔径为0. 7 μ m。实施例2:(1)组分I沉淀的溶解及过滤沉淀用8倍体积的第一溶解液，23°C搅拌溶解1小时，溶解后的制品澄清过滤，计量制品体积；所述的第一溶解液为每IOOOml注射用水溶液中含有12g柠檬酸三钠，9gNaCl，IOg蔗糖，3g Tris, 4g赖氨酸盐酸盐，用HCl调整pH值为 7 ；(2) S/D灭活将制品温度控制在25°C，按每升滤液加IOOml的比例，在搅拌状态下缓慢加入质量浓度的11% S/D灭活剂，保持制品温度25°C 6小时；(3)第一次甘氨酸沉淀计量步骤2中灭活液体积，按1. 8mol/L浓度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷却至5°C，以4200rpm的速度进行连续离心分离40分钟，0°C收集沉淀；(4) 一次沉淀的溶解及过滤沉淀用7倍体积的第二溶解液，在23°C搅拌溶解1小时，溶解后过滤，收集滤液；所述的第二溶解液为，IOOOml注射用水溶液中含有7. 5g柠檬酸三钠，加HCl调整pH值为7 ；(5)柱层析DEAE_650M凝胶先用枸橼酸缓冲液平衡，再将步骤中的滤液上柱进行层析，收集流出液，层析结束后用3倍柱床体积的枸橼酸缓冲液洗涤凝胶，并入流出液中；(6)第二次甘氨酸沉淀层析流出液按1. 8mol/L浓度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷却至5°C，用离心机以4200rpm的速度进行连续离心分离40分钟，_5°C收集沉淀；(7) 二次沉淀的溶解及过滤沉淀用4倍体积的第三溶解液，室温溶解1小时，溶解后，过滤；所述的第三溶解液为，IOOOml注射用水溶液中含有15. 2g的枸橼酸钠，43g盐酸精氨酸，Sg的氯化钠，用HCl或NaOH调整溶液pH为7 ；(8)配制检测过滤后制品蛋白质含量，根据蛋白质含量用第三溶解液进行配制， 使最终制品中蛋白含量为25g/L ；(9)分装及冻干配制后制品除菌分装于50ml玻璃瓶中，25ml/瓶，分装后冻干；(10)干热灭活步骤9中冻干后制品置于水浴中，保持水浴温度100°C，30分钟。所述的步骤(1)中所称的澄清过滤采用滤板澄清过滤，其滤板孔径为0.85 μ m。实施例3 (1)组分I沉淀的溶解及过滤沉淀用15倍体积的第一溶解液，搅拌溶解1小时，溶解后的制品澄清过滤，计量制品体积；所述的第一溶解液为每IOOOml注射用水溶液中含有14g柠檬酸三钠，9g NaCl，12g蔗糖，4g Tris，5g赖氨酸盐酸盐，用HCl调整pH值为 7. 10 ；(2) S/D灭活将制品温度控制在，按每升滤液加IOOml的比例，在搅拌状态下缓慢加入质量浓度的11% S/D灭活剂，保持制品温度6小时；(3)第一次甘氨酸沉淀计量步骤2中灭活液体积，按2. 2mol/L浓度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷却至8°C，以4200rpm的速度进行连续离心分离40分钟，0°C收集沉淀；(4) 一次沉淀的溶解及过滤沉淀用10倍体积的第二溶解液，在搅拌溶解1 小时，溶解后过滤，收集滤液；所述的第二溶解液为，IOOOml注射用水溶液中含有10g柠檬酸三钠，加HCl调整pH值为7. 10 ；(5)柱层析DEAE_650M凝胶先用枸橼酸缓冲液平衡，再将步骤中的滤液上柱进行层析，收集流出液，层析结束后用3倍柱床体积的枸橼酸缓冲液洗涤凝胶，并入流出液中；(6)第二次甘氨酸沉淀层析流出液按2. 2mol/L浓度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷却至8°C，用离心机以4200rpm的速度进行连续离心分离40分钟，_5°C收集沉淀；(7) 二次沉淀的溶解及过滤沉淀用5倍体积的第三溶解液，室温溶解1小时，溶解后，过滤；所述的第三溶解液为，IOOOml注射用水溶液中含有16. 5g的枸橼酸钠，55g盐酸精氨酸，9g的氯化钠，用HCl或NaOH调整溶液pH为7. 1 ；(8)配制检测过滤后制品蛋白质含量，根据蛋白质含量用第三溶解液进行配制， 使最终制品中蛋白含量为25g/L ；(9)分装及冻干配制后制品除菌分装于50ml玻璃瓶中，25ml/瓶，分装后冻干；(10)干热灭活步骤9中冻干后制品置于水浴中，保持水浴温度100°C，30分钟；所述的步骤(1)中所称的澄清过滤采用滤板澄清过滤，其滤板孔径为Ι.Ομπι。本发明产品经测试完全达到或超过了《中国药典》2010年版(三部)的相关要求和国内已上市的同类产品，相关数据的对比分析见下表本发明产品与国内上市销售产品质量比较资料(规格0. 5g/瓶)
权利要求
1.一种柱层析法从组分I中提取人纤维蛋白原的方法，其特征在于，是由以下步骤实现(1)组分I沉淀的溶解及过滤沉淀用5 15倍体积的第一溶解液，2046°C搅拌溶解 1小时，溶解后的制品澄清过滤，计量制品体积；所述的第一溶解液为每IOOOml注射用水溶液中含有10 14g柠檬酸三钠，9g NaCl, 8 12g蔗糖，2 4gTris，3 5g赖氨酸盐酸盐，用HCl调整pH值6. 90-7. 10 ；(2)S/D灭活将制品温度控制在M ^TC,按每升滤液加IOOml的比例，在搅拌状态下缓慢加入质量浓度的11% S/D灭活剂，保持制品温度M 6小时；所述的11% S/ D灭活剂为，IOOOml注射用水溶液中含有110g吐温_80，33g磷酸三丁酯；(3)第一次甘氨酸沉淀计量步骤2中灭活液体积，按1.5 2. 2mol/L浓度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷却至2 8°C，以4200rpm的速度进行连续离心分离40分钟，设定温度0°C，收集沉淀；(4)一次沉淀的溶解及过滤沉淀用5 10倍体积的第二溶解液，在20-26°C搅拌溶解1小时，溶解后过滤，收集滤液；所述的第二溶解液为，IOOOml注射用水溶液中含有5 IOg柠檬酸三钠，加HCl调整pH值6. 90-7. 10 ；(5)柱层析DEAE-650M凝胶先用枸橼酸缓冲液平衡，再将步骤中的滤液上柱进行层析，收集流出液，层析结束后用3倍柱床体积的枸橼酸缓冲液洗涤凝胶，并入流出液中；(6)第二次甘氨酸沉淀层析流出液按1.5 2. 2mol/L浓度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷却至2 8°C，用离心机以4200rpm的速度进行连续离心分离40分钟，_5°C收集沉淀；(7)二次沉淀的溶解及过滤沉淀用3 5倍体积的第三溶解液，室温溶解1小时，溶解后，过滤；所述的第三溶解液为，IOOOml注射用水溶液中含有14 16. 5g的枸橼酸钠， 30 55g盐酸精氨酸，7 9g的氯化钠，用HCl或NaOH调整溶液pH6. 9 7. 1 ；(8)配制检测过滤后制品蛋白质含量，根据蛋白质含量用第三溶解液进行配制，使最终制品中蛋白含量为25g/L;(9)分装及冻干配制后制品除菌分装于50ml玻璃瓶中，25ml/瓶，分装后冻干；(10)干热灭活步骤9中冻干后制品置于水浴中，保持水浴温度100°C，30分钟。 所述的步骤(1)中所称的澄清过滤采用滤板澄清过滤，其滤板孔径为0.7μπι 1. 0 μ m ；所述的步骤(3)和步骤(6)中甘氨酸的浓度为1. 5 2. 2mol/L。
2.根据权利要求1所述的柱层析法从组分I中提取人纤维蛋白原的方法，其特征在于， 由所述的以下步骤实现(1)组分I沉淀的溶解及过滤沉淀用5倍体积的第一溶解液，20°C搅拌溶解1小时， 溶解后的制品澄清过滤，计量制品体积；所述的第一溶解液为每IOOOml注射用水溶液中含有10g柠檬酸三钠，9g NaCl，8g蔗糖，2g Tris，3g赖氨酸盐酸盐，用HCl调整pH值为 6. 90 ；灭活将制品温度控制在M°C，按每升滤液加IOOml的比例，在搅拌状态下缓慢加入质量浓度的11% S/D灭活剂，保持制品温度6小时；(3)第一次甘氨酸沉淀计量步骤2中灭活液体积，按1. 5mol/L浓度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷却至2°C，以4200rpm的速度进行连续离心分离40分钟，0°C收集沉淀；(4)一次沉淀的溶解及过滤沉淀用5倍体积的第二溶解液，在20°C搅拌溶解1小时， 溶解后过滤，收集滤液；所述的第二溶解液为，IOOOml注射用水溶液中含有5g柠檬酸三钠，加HCl调整pH值为6. 90 ；(5)柱层析DEAE-650M凝胶先用枸橼酸缓冲液平衡，再将步骤(4)中的滤液上柱进行层析，收集流出液，层析结束后用3倍柱床体积的枸橼酸缓冲液洗涤凝胶，并入流出液中；(6)第二次甘氨酸沉淀层析流出液按1.5mol/L浓度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷却至2°C，用离心机以4200rpm的速度进行连续离心分离40分钟，_5°C收集沉淀；(7)二次沉淀的溶解及过滤沉淀用3倍体积的第三溶解液，室温溶解1小时，溶解后， 过滤；所述的第三溶解液为，IOOOml注射用水溶液中含有14g的枸橼酸钠，30g盐酸精氨酸，7g的氯化钠，用HCl或NaOH调整溶液pH为6. 9 ；(8)配制检测过滤后制品蛋白质含量，根据蛋白质含量用第三溶解液进行配制，使最终制品中蛋白含量为25g/L;(9)分装及冻干配制后制品除菌分装于50ml玻璃瓶中，25ml/瓶，分装后冻干；(10)干热灭活步骤9中冻干后制品置于水浴中，保持水浴温度100°C，30分钟。所述的步骤(1)中所称的澄清过滤采用滤板澄清过滤，其滤板孔径为0.7 μ m。
3.根据权利要求1所述的柱层析法从组分I中提取人纤维蛋白原的方法，其特征在于， 由所述的以下步骤实现(1)组分I沉淀的溶解及过滤沉淀用8倍体积的第一溶解液，23°C搅拌溶解1小时，溶解后的制品澄清过滤，计量制品体积；所述的第一溶解液为每IOOOml注射用水溶液中含有12g柠檬酸三钠，9g NaCl，10g蔗糖，3g Tris，4g赖氨酸盐酸盐，用HCl调整pH值为7 ； 灭活将制品温度控制在25°C，按每升滤液加IOOml的比例，在搅拌状态下缓慢加入质量浓度的11% S/D灭活剂，保持制品温度25°C 6小时；(3)第一次甘氨酸沉淀计量步骤2中灭活液体积，按1.8mol/L浓度加入甘氨酸粉末， 充分溶解后冷却至5°C，以4200rpm的速度进行连续离心分离40分钟，0°C收集沉淀；(4)一次沉淀的溶解及过滤沉淀用7倍体积的第二溶解液，在23°C搅拌溶解1小时， 溶解后过滤，收集滤液；所述的第二溶解液为，IOOOml注射用水溶液中含有7. 5g柠檬酸三钠，加HCl调整pH值为7 ；(5)柱层析DEAE-650M凝胶先用枸橼酸缓冲液平衡，再将步骤中的滤液上柱进行层析，收集流出液，层析结束后用3倍柱床体积的枸橼酸缓冲液洗涤凝胶，并入流出液中；(6)第二次甘氨酸沉淀层析流出液按1.8mol/L浓度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷却至5°C，用离心机以4200rpm的速度进行连续离心分离40分钟，_5°C收集沉淀；(7)二次沉淀的溶解及过滤沉淀用4倍体积的第三溶解液，室温溶解1小时，溶解后， 过滤；所述的第三溶解液为，IOOOml注射用水溶液中含有15. 2g的枸橼酸钠，43g盐酸精氨酸，Sg的氯化钠，用HCl或NaOH调整溶液pH为7 ；(8)配制检测过滤后制品蛋白质含量，根据蛋白质含量用第三溶解液进行配制，使最终制品中蛋白含量为25g/L;(9)分装及冻干配制后制品除菌分装于50ml玻璃瓶中，25ml/瓶，分装后冻干；(10)干热灭活步骤9中冻干后制品置于水浴中，保持水浴温度100°C，30分钟。所述的步骤(1)中所称的澄清过滤采用滤板澄清过滤，其滤板孔径为0.85 μ m。
4.根据权利要求1所述的柱层析法从组分I中提取人纤维蛋白原的方法，其特征在于， 由所述的以下步骤实现(1)组分I沉淀的溶解及过滤沉淀用15倍体积的第一溶解液，26°C搅拌溶解1小时， 溶解后的制品澄清过滤，计量制品体积；所述的第一溶解液为每IOOOml注射用水溶液中含有14g柠檬酸三钠，9g NaCl，12g蔗糖，4g Tris，5g赖氨酸盐酸盐，用HCl调整pH值为 7. 10 ；灭活将制品温度控制在^TC,按每升滤液加IOOml的比例，在搅拌状态下缓慢加入质量浓度的11% S/D灭活剂，保持制品温度6小时；(3)第一次甘氨酸沉淀计量步骤2中灭活液体积，按2.2mol/L浓度加入甘氨酸粉末， 充分溶解后冷却至8°C，以4200rpm的速度进行连续离心分离40分钟，0°C收集沉淀；(4)一次沉淀的溶解及过滤沉淀用10倍体积的第二溶解液，在搅拌溶解1小时， 溶解后过滤，收集滤液；所述的第二溶解液为，IOOOml注射用水溶液中含有10g柠檬酸三钠，加HCl调整pH值为7. 10 ；(5)柱层析DEAE-650M凝胶先用枸橼酸缓冲液平衡，再将步骤(4)中的滤液上柱进行层析，收集流出液，层析结束后用3倍柱床体积的枸橼酸缓冲液洗涤凝胶，并入流出液中；(6)第二次甘氨酸沉淀层析流出液按2.2mol/L浓度加入甘氨酸粉末，充分溶解后冷却至8°C，用离心机以4200rpm的速度进行连续离心分离40分钟，_5°C收集沉淀；(7)二次沉淀的溶解及过滤沉淀用5倍体积的第三溶解液，室温溶解1小时，溶解后， 过滤；所述的第三溶解液为，IOOOml注射用水溶液中含有16. 5g的枸橼酸钠，55g盐酸精氨酸，9g的氯化钠，用HCl或NaOH调整溶液pH为7. 1 ；(8)配制检测过滤后制品蛋白质含量，根据蛋白质含量用第三溶解液进行配制，使最终制品中蛋白含量为25g/L;(9)分装及冻干配制后制品除菌分装于50ml玻璃瓶中，25ml/瓶，分装后冻干；(10)干热灭活步骤9中冻干后制品置于水浴中，保持水浴温度100°C，30分钟；所述的步骤(1)中所称的澄清过滤采用滤板澄清过滤，其滤板孔径为Ι.Ομπι。
全文摘要
本发明涉及柱层析法从组分I中提取人纤维蛋白原的方法，可有效解决人纤维蛋白原纯度高，稳定性好，收率高的问题，本发明由以下步骤实现(1)FI沉淀的溶解及过滤；(2)S/D灭活；(3)第一次甘氨酸沉淀；(4)一次沉淀的溶解及过滤；(5)柱层析；(6)第二次甘氨酸沉淀；(7)二次沉淀的溶解及过滤；(8)配制；(9)分装及冻干；(10)干热灭活；该法采用甘氨酸作为沉淀剂，使最终制品中夹带有0.5％左右的甘氨酸，甘氨酸与盐酸精氨酸联合作为制品稳定剂，能够增强制品冻干后的稳定性，提高制品的质量、纯度和最终产品的收率，是制备人纤维蛋白原的创新。
文档编号C07K1/16GK102212129SQ20111007855
公开日2011年10月12日 申请日期2011年5月5日 优先权日2011年5月5日
发明者刘国荣, 时凯, 江景玉, 皮川真, 陈惠珍, 雷文成 申请人:邦和药业股份有限公司