专利名称：利用离子交换树脂分离高唾液酸含量酪蛋白糖巨肽的方法
技术领域：
本发明涉及活性物质分离技术领域，更具体的说，是涉及一种利用离子交换树脂分离高唾液酸含量酪蛋白糖巨肽的方法。
背景技术：
乳清是工业中干酪和干酪素的副产品，乳糖和乳清蛋白均存在于其中，其营养物质约占原料奶的55%。随着干酪生产量的逐年上升，每年都会有大量等待利用和处理的乳清。一些工业发达的国家已经具备了较强的乳清处理能力，但尽管如此，世界上仍有半数的乳清不能被再次利用。大量乳清的排放不仅仅是资源的浪费，更是对环境造成了严重的污
^fe ο牛乳中的蛋白质80%为酪蛋白。在干酪的制作过程中，用凝乳酶处理牛乳κ-酪蛋白(κ-CN)时，κ-CN被水解为不溶的副κ-CN和一种可溶性的多肽两部分。可溶性的多肽随乳清被分离出去，由于它来源于酪蛋白并含有较多的糖链，被称为酪蛋白糖巨肽 (Casein Glycomacropeptide,CGMP) 0 κ -酪蛋白是酪蛋白中唯一含糖的成分，包括半乳糖、 N-乙酰氨基半乳糖、N-乙酰神经氨酸(唾液酸)等，这些糖大都存在于CGMP肽段上。至少含有一个唾液酸的三糖和四糖占CGMP结构糖链的90%以上。CGMP是一种由64个氨基酸残基组成的多肽片段，由于它富含唾液酸，研究证实该糖巨肽具有较多的生理功能。表面含有唾液酸的靶细胞能够免受流感病毒的感染，CGMP对所有的流感病毒都表现出抑制流感病毒红细胞凝集的作用，当失去唾液酸时就使该作用丧失。脾脏淋巴细胞参与炎症反应，抑制脾细胞的增殖可以用来抑制过敏反应。CGMP可以抑制被鼠伤寒杆菌有丝分裂原的脂多糖所诱导的老鼠脾细胞的增殖，如果将CGMP的唾液酸消化掉就不具有这样的活性。由于唾液酸的存在，CGMP还有增强记忆力的保健作用等。因此CGMP可用于生产多种保健食品和医药品。目前纯化CGMP的方法很多，比如沉淀法、超滤法、双水相系统法、酶交联法等，但这些方法中存在唾液酸含量低、生产成本高等缺点，因此目前CGMP特别是高唾液酸含量 CGMP的生产还未能实现工业化。
发明内容
本发明是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种制备过程简单，成本较低，能获得高唾液酸含量酪蛋白糖巨肽的方法。本发明通过下述技术方案实现一种利用离子交换树脂分离高唾液酸含量酪蛋白糖巨肽的方法，其特征在于，包括下述步骤(1)将含酪蛋白糖巨肽的液态原料的ρΗ值调到5. 0-5. 4与阳离子交换树脂混合， 吸出未吸附液；(2)将步骤(1)得到的未吸附液的ρΗ值调到5. 0-5. 4与阴离子交换树脂混合，酪
4蛋白糖巨肽被吸附后用氯化钠洗脱，收集氯化钠洗脱液；或将步骤(1)得到的未吸附液的 PH值调到3. 5-4. 0再与阳离子交换树脂混合，酪蛋白糖巨肽被吸附后用氯化钠洗脱，收集氯化钠洗脱液；(3)将收集的氯化钠洗脱液用截留分子量8000-14000的透析袋透析进行脱盐，透析截留液冷冻干燥后得到高唾液酸含量的酪蛋白糖巨肽。另一种利用离子交换树脂分离高唾液酸含量酪蛋白糖巨肽的方法，其特征在于， 包括下述步骤(1)将含酪蛋白糖巨肽的液态原料的pH值调到5. 0-5. 4与阴离子交换树脂混合， 酪蛋白糖巨肽被吸附后用氯化钠洗脱，收集氯化钠洗脱液；(2)将步骤(1)得到的洗脱液用截留分子量8000-14000的透析袋透析进行脱盐， 收集截留液并将截留液的PH值调为5. 0-5. 4再与阳离子交换树脂混合，吸出未吸附液；(3)将步骤(2)得到的未吸附液冷冻干燥后得到高唾液酸含量的酪蛋白糖巨肽。上述两种方法中，制取含有酪蛋白糖巨肽的液态原料的固体原料为脱盐乳清粉。所述阳离子交换树脂和阴离子交换树脂均为苯乙烯系离子交换树脂。含有酪蛋白糖巨肽的液态原料的制备方法为用0.02mol/L醋酸钠缓冲液配制 100mg/ml的乳清粉溶液，500 X g离心20min去除不溶物取上清液。上清液用冰醋酸调节pH 值为5. 0-5. 4得到含有酪蛋白糖巨肽的液态原料；乳清粉与阳离子交换树脂或阴离子交换树脂的质量比为2 5。所述阳离子交换树脂的处理方法为将阳离子交换树脂充分溶胀后，用酸溶液和碱溶液交替淋洗进行转型活化，之后用稀盐酸处理为氢型树脂，最后用去离子水洗至中性所述阴离子交换树脂的处理方法为将阴离子交换树脂充分溶胀后，用酸溶液和碱溶液交替淋洗进行转型活化，之后用氢氧化钠溶液处理为氢氧型树脂，最后用去离子水洗至中性备用。本发明具有下述技术效果UCGMP的等电点在4-5之间，当pH值高于等电点时能够被阴离子交换树脂吸附， 反之则被阳离子交换树脂吸附。本发明中交替运用了互补技术，将分离过程进行了合理的衔接，减少了处理步骤，降低了样品的损耗，从而能够获得高唾液酸含量的CGMP。本发明中每IOOg乳清粉可以制得0. 8-0. 9g纯度大于85%的CGMP，其唾液酸含量在6. 0% (占蛋白质，质量分数)以上。2、本发明的方法中用到的原料和试剂都是对人体无害的，因此由该方法制得的 CGMP能够用于食品和保健药品，并且分离过程不会对环境产生破坏。3、本发明中采用的苯乙烯系离子交换树脂价格低于常用的葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶树脂，并且经再生后可以重复使用。分离过程中无需贵重的器械和苛刻的实验条件，投资少、能耗小、适宜进行工业化生产。4、本发明的方法在利用离子交换树脂的过程中除了能够得到目标产物外，所选分离条件温和且未使用易使乳清蛋白变性的有机溶剂，能保持乳清蛋白的活性，回收如
乳球蛋白、α-乳白蛋白等乳清蛋白，提高了乳清的综合利用率，避免了原料的浪费。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明进行详细说明。本发明中所使用的阳离子交换树脂和阴离子交换树脂为苯乙烯系离子交换树脂。 阳离子交换树脂为001X7或D061，阴离子交换树脂为201X4。利用南京建成生物工程研究所唾液酸试剂盒测定CGMP的唾液酸含量，CGMP纯度用(I-OD28tlA)D21tl)的百分比表示，蛋白质含量测定采用凯氏定氮法。实施例1(1)含有酪蛋白糖巨肽的液态原料的制备取D90脱盐乳清粉(蛋白质含量14%、质量分数；唾液酸含量0. 74g/100g乳清粉) 溶于0.02mol/L的醋酸钠溶液中，使终浓度为100mg/ml。500X g离心20min去除不溶物。 离心后的上清液用冰醋酸调节pH值为5. O备用。(2)D061离子交换树脂的处理新购树脂进行活化后才能使用，充分溶胀后用酸碱溶液交替淋洗进行转型活化， 最后用稀盐酸处理为氢型树脂。具体方法如下。阳离子交换树脂的处理取D061阳离子交换树脂，置于去离子水中溶胀24h，用3 倍体积浓度为2%的盐酸浸泡4h (间歇搅拌使转型充分)后用去离子水洗至近中性，再用3 倍体积lmol/L的氢氧化钠浸泡4h(间歇搅拌使转型充分)后用去离子水洗至近中性，最后再用3倍体积2%盐酸浸泡4h(间歇搅拌使转型充分)后用去离子水洗至近中性转为氢型树脂。再用PH值为5. 0、浓度为0. 02mol/L的醋酸钠缓冲溶液平衡三次，吸净缓冲液备用。(3) 201X4阴离子交换树脂的处理新购树脂需要进行活化后才能使用，充分溶胀后用酸碱溶液交替淋洗进行转型， 最后用稀碱液处理为氢氧型树脂。具体方法如下。取201 X 4阴离子交换树脂，置于浓度为0. 2mol/L的氯化钠中溶胀5_8h再逐渐添加去离子水溶胀16-19h，以免树脂吸水胀破。用去离子水洗净氯化钠后用3倍体积浓度为 lmol/L的氢氧化钠浸泡4h，浸泡过程中间歇搅拌使转型充分，用去离子水洗至近中性，再用3倍体积2%的盐酸浸泡4h，浸泡过程中间歇搅拌使转型充分。用去离子水洗至近中性， 加入3倍体积lmol/L的氢氧化钠浸泡4h，浸泡过程中间歇搅拌使转型充分。最后用去离子水洗至近中性转为氢氧型树脂，再用PH值为5. 2、浓度为0. 02mol/L的醋酸钠缓冲溶液平衡三次，吸出缓冲液备用。(4)取200ml步骤⑴制备得到的含有酪蛋白糖巨肽的液态原料与50g经过步骤 (2)处理得到的D061阳离子交换树脂混合，置于20°C恒温振荡器中吸附1.5h后吸出未吸附液。PH值为5. 0时，CGMP带有负电荷不被阳离子交换树脂吸附，而β -乳球蛋白等因带有正电荷吸附于树脂上。此时洗脱D061树脂可以回收部分β-乳球蛋白。未吸附液中CGMP 的含量基本不变。(5)用冰醋酸将未吸附液的PH值调为5. 2与经过步骤(3)处理得到的201X4阴离子交换树脂混合(混合比例为200ml未吸附液50g 201\4阴离子交换树脂)，置于201 恒温振荡器中吸附1.5h后吸出未吸附液。带负电的CGMP和少量的α-乳白蛋白被树脂吸附，其它杂质如乳糖等存在于未吸附液中。向吸附有CGMP的201X4阴离子交换树脂中加入去离子水漂洗2-3次，每次50ml，吸出水后再加入浓度为lmol/L、pH值为4的氯化钠溶
6液100ml，置于20°C恒温振荡器中洗脱2h后吸出上清液(即氯化钠洗脱液)。(6)得到的氯化钠洗脱液使用8000-14000的透析袋透析24h，透析截留液冷冻干燥后得纯度为88%、唾液酸含量为6. 09% (占蛋白质，质量分数)的CGMP 0. Slgo实施例2(1)含有酪蛋白糖巨肽的液态原料的制备取D90脱盐乳清粉(蛋白质含量14%、质量分数；唾液酸含量0. 74g/100g乳清粉) 溶于0.02mol/L的醋酸钠溶液中，使终浓度为100mg/ml。500X g离心20min去除不溶物。 离心后的上清液用冰醋酸调节PH值为5. 2备用。(2)D061阳离子交换树脂和001X7阳离子交换树脂的处理取D061阳离子交换树脂，置于去离子水中溶胀24h，用3倍体积浓度为2%的盐酸浸泡4h (间歇搅拌使转型充分)后用去离子水洗至近中性，再用3倍体积lmol/L的氢氧化钠浸泡4h (间歇搅拌使转型充分)后用去离子水洗至近中性，最后再用3倍体积2%盐酸浸泡4h (间歇搅拌使转型充分)后用去离子水洗至近中性转为氢型树脂。再用PH值为5. 2、 浓度为0. 02mol/L的醋酸钠缓冲溶液平衡三次，吸净缓冲液备用。。将001X7阳离子交换树脂先用浓度为0. 2mol/L的氯化钠溶胀5_8小时，再逐渐添加去离子水溶胀16-19小时，以免树脂吸水胀破。用3倍体积浓度为2%的盐酸浸泡 4h(间歇搅拌使转型充分)后用去离子水洗至近中性，再用3倍体积lmol/L的氢氧化钠浸泡4h(间歇搅拌使转型充分)后用去离子水洗至近中性，最后再用3倍体积2%盐酸浸泡 4h(间歇搅拌使转型充分)后用去离子水洗至近中性转为氢型树脂。再用PH值为3. 8的 0. 02mol/L的醋酸钠缓冲溶液平衡三次，吸净缓冲液备用。(3)取步骤(1)得到的200ml含有酪蛋白糖巨肽的液态原料与50g经过步骤⑵ 处理得到的D061阳离子交换树脂混合，置于20°C恒温振荡器中吸附1. 5h后吸出未吸附液。 pH值为5.2时，CGMP带有负电荷不被阳离子交换树脂吸附，而β-乳球蛋白因带有正电荷吸附于树脂上。此时洗脱D061树脂可以回收部分β-乳球蛋白。(4)用冰醋酸将未吸附液的PH值调为3. 8与经过步骤(2)处理得到的001X7阳离子交换树脂混合，置于20°C恒温振荡器中吸附1.5h后吸出未吸附液。pH值为3. 8时， 带正电的CGMP被树脂吸附。向吸附有CGMP的001X7阳离子交换树脂中加入去离子水漂洗2-3次，每次50ml，吸出水后再加入浓度为lmol/L、pH值为4的氯化钠溶液100ml，置于 20°C恒温振荡器中洗脱2h后吸出上清液(即氯化钠洗脱液)。(5)得到的氯化钠洗脱液使用8000-14000的透析袋透析24h，透析的截留液冷冻干燥后得纯度为86%、唾液酸含量为6. 10% (占蛋白质，质量分数)的CGMP0. 80go实施例3(1)含有酪蛋白糖巨肽的液态原料的制备取D90脱盐乳清粉(蛋白质含量14%、质量分数；唾液酸含量0. 74g/100g乳清粉) 溶于0.02mol/L的醋酸钠溶液中，使终浓度为100mg/ml。500X g离心20min去除不溶物。 离心后的上清液用冰醋酸调节pH值为5. 4备用。(2)001X7阳离子交换树脂的处理将001X7阳离子交换树脂先用浓度为0. 2mol/L的氯化钠溶胀5_8小时，再逐渐添加去离子水溶胀16-19小时，以免树脂吸水胀破。用3倍体积浓度为2%的盐酸浸泡
74h(间歇搅拌使转型充分)后用去离子水洗至近中性，再用3倍体积lmol/L的氢氧化钠溶液浸泡4h (间歇搅拌使转型充分)后用去离子水洗至近中性，最后再用3倍体积2%盐酸浸泡4h (间歇搅拌使转型充分)后用去离子水洗至近中性转为氢型树脂。再用PH值为5. 4、 浓度为0. 02mol/L的醋酸钠缓冲溶液平衡三次，吸净缓冲液备用。(3) 201X4阴离子交换树脂的处理取201 X 4阴离子交换树脂，置于浓度为0. 2mol/L的氯化钠中溶胀5_8h再逐渐添加去离子水溶胀16-19h，以免树脂吸水胀破。用去离子水洗净氯化钠后用3倍体积浓度为 lmol/L的氢氧化钠浸泡4h，浸泡过程中间歇搅拌使转型充分，用去离子水洗至近中性，再用3倍体积2%的盐酸浸泡4h，浸泡过程中间歇搅拌使转型充分。再用去离子水洗至近中性，用3倍体积lmol/L的氢氧化钠溶液浸泡4h，浸泡过程中间歇搅拌使转型充分。最后用去离子水洗至近中性转为氢氧型树脂，再用PH值为5. 4、浓度为0. 02mol/L的醋酸钠缓冲溶液平衡三次，吸出缓冲液备用。(4)取200ml步骤(1)制备得到的含有酪蛋白糖巨肽的液态原料与50g步骤(3) 处理得到的201X4阴离子交换树脂混合，置于20°C恒温振荡器中吸附1. 5h后吸出未吸附液。未吸附液中为带正电或不带电的β-乳球蛋白以及乳糖、脂肪等。带负电的CGMP和少量的α _乳白蛋白、牛血清白蛋白等被201 X 4阴离子交换树脂吸附。(5)向吸附有CGMP的201X4阴离子交换树脂中加入去离子水漂洗2_3次，每次 50ml，吸出水后再加入浓度为lmol/L、pH值为4的氯化钠溶液100ml，置于20°C恒温振荡器中洗脱2h后吸出上清液(即氯化钠洗脱液)。(6)氯化钠洗脱液使用8000-14000的透析袋透析24h。用冰醋酸将透析截留液的 PH值调为5. 4与步骤⑵处理得到的001 X 7阳离子交换树脂混合，置于20°C恒温振荡器中吸附2h后吸出未吸附液，将未吸附液冷冻干燥后得纯度为85%、唾液酸含量为6. 05% (占蛋白质，质量分数)的CGMP0.85g。
权利要求
1.一种利用离子交换树脂分离高唾液酸含量酪蛋白糖巨肽的方法，其特征在于，包括下述步骤(1)将含酪蛋白糖巨肽的液态原料的PH值调到5.0-5. 4与阳离子交换树脂混合，吸出未吸附液；(2)将步骤(1)得到的未吸附液的pH值调到5.0-5. 4与阴离子交换树脂混合，酪蛋白糖巨肽被吸附后用氯化钠洗脱，收集氯化钠洗脱液；或将步骤(1)得到的未吸附液的PH值调到3. 5-4. 0再与阳离子交换树脂混合，酪蛋白糖巨肽被吸附后用氯化钠洗脱，收集氯化钠洗脱液；(3)将收集的氯化钠洗脱液用截留分子量8000-14000的透析袋透析进行脱盐，透析截留液冷冻干燥后得到高唾液酸含量的酪蛋白糖巨肽。
2.根据权利要求1所述的利用离子交换树脂分离高唾液酸含量酪蛋白糖巨肽的方法， 其特征在于，制取含有酪蛋白糖巨肽的液态原料的固体原料为脱盐乳清粉。
3.根据权利要求1所述的利用离子交换树脂分离高唾液酸含量酪蛋白糖巨肽的方法， 其特征在于，所述阳离子交换树脂和阴离子交换树脂均为苯乙烯系离子交换树脂。
4.根据权利要求1所述的利用离子交换树脂分离高唾液酸含量酪蛋白糖巨肽的方法， 其特征在于，含酪蛋白糖巨肽的液态原料的制备方法为用0. 02mol/L醋酸钠缓冲液配制 100mg/ml的脱盐乳清粉溶液，500 X g离心20min去除不溶物取上清液；上清液用冰醋酸调节PH值为5. 0-5. 4得到含有酪蛋白糖巨肽的液态原料；脱盐乳清粉与阳离子交换树脂或阴离子交换树脂的质量比为2 5。
5.根据权利要求1所述的利用离子交换树脂分离高唾液酸含量酪蛋白糖巨肽的方法， 其特征在于，所述阳离子交换树脂的处理方法为将阳离子交换树脂充分溶胀后，用酸溶液和碱溶液交替淋洗进行转型活化，之后用盐酸处理为氢型树脂，最后用去离子水洗至中性所述阴离子交换树脂的处理方法为将阴离子交换树脂充分溶胀后，用酸溶液和碱溶液交替淋洗进行转型活化，之后用氢氧化钠溶液处理为氢氧型树脂，最后用去离子水洗至中性备用。
6.一种利用离子交换树脂分离高唾液酸含量酪蛋白糖巨肽的方法，其特征在于，包括下述步骤(1)将含酪蛋白糖巨肽的液态原料的PH值调到5.0-5. 4与阴离子交换树脂混合，酪蛋白糖巨肽被吸附后用氯化钠洗脱，收集氯化钠洗脱液；(2)将步骤(1)得到的洗脱液用截留分子量8000-14000的透析袋透析进行脱盐，收集截留液并将截留液的PH值调为5. 0-5. 4再与阳离子交换树脂混合，吸出未吸附液；(3)将步骤(2)得到的未吸附液冷冻干燥后得到高唾液酸含量的酪蛋白糖巨肽。
7.根据权利要求6所述的利用离子交换树脂分离高唾液酸含量酪蛋白糖巨肽的方法， 其特征在于，制取含有酪蛋白糖巨肽的液态原料的固体原料为脱盐乳清粉。
8.根据权利要求6所述的利用离子交换树脂分离高唾液酸含量酪蛋白糖巨肽的方法， 其特征在于，所述阳离子交换树脂和阴离子交换树脂均为苯乙烯系离子交换树脂。
9.根据权利要求6所述的利用离子交换树脂分离高唾液酸含量酪蛋白糖巨肽的方法， 其特征在于，含有酪蛋白糖巨肽的液态原料的制备方法为用0. 02mol/L醋酸钠缓冲液配制100mg/ml的乳清粉溶液，500 X g离心20min去除不溶物取上清液。上清液用冰醋酸调节 PH值为5. 0-5. 4得到含有酪蛋白糖巨肽的液态原料；乳清粉与阳离子交换树脂或阴离子交换树脂的质量比为2 5。
10.根据权利要求6所述的利用离子交换树脂分离高唾液酸含量酪蛋白糖巨肽的方法，其特征在于，所述阳离子交换树脂的处理方法为将阳离子交换树脂充分溶胀后，用酸溶液和碱溶液交替淋洗进行转型活化，之后用稀盐酸处理为氢型树脂，最后用去离子水洗至中性备用；所述阴离子交换树脂的处理方法为将阴离子交换树脂充分溶胀后，用酸溶液和碱溶液交替淋洗进行转型活化，之后用氢氧化钠溶液处理为氢氧型树脂，最后用去离子水洗至中性备用。
全文摘要
本发明公开了一种利用离子交换树脂分离高唾液酸含量酪蛋白糖巨肽的方法，旨在提供一种制备过程简单，成本较低，能获得高唾液酸含量酪蛋白糖巨肽的方法。将含酪蛋白糖巨肽的液态原料的pH值调到5.0-5.4与阳离子交换树脂混合，吸出未吸附液；将未吸附液的pH值调到5.0-5.4与阴离子交换树脂混合，酪蛋白糖巨肽被吸附后用氯化钠洗脱；或将未吸附液的pH值调到3.5-4.0再与阳离子交换树脂混合，酪蛋白糖巨肽被吸附后用氯化钠洗脱；将氯化钠洗脱液透析脱盐，透析截留液冷冻干燥后得到高唾液酸含量的酪蛋白糖巨肽。本发明中交替运用了互补技术，将分离过程合理衔接，减少了处理步骤，降低了样品的损耗，能够获得高唾液酸含量的CGMP。
文档编号C07K14/47GK102219846SQ20111009903
公开日2011年10月19日 申请日期2011年4月20日 优先权日2011年4月20日
发明者刁瑞丽, 闫亚丽, 陈庆森 申请人:天津商业大学