专利名称：合成苦马豆素抗原的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物化学合成苦马豆素抗原的方法，属于有机化学、毒理学和免疫学等技术领域。
背景技术：
苦马豆素(swainsonine，Sff)是疯草中的主要有毒生物碱成分，是马、牛、羊等家畜因采食疯草后出现大批中毒死亡的主要原因。豆科植物疯草的粗蛋白含量高达11% 12%，与苜蓿相当，有着被作为优良饲草的潜力，同时，在防沙固沙中具有重要作用。近年的研究表明，SW具有显著的抗癌活性，为疯草的深入研究与应用提供了更为广阔的前景。因此，如何解决正确有效的防治家畜中毒与充分利用的矛盾，日益成为广泛关注的热点。已经证明，通过制备SW-BSA抗原免疫山羊，能够使山羊采食疯草后中毒的时间显著延迟，显示出其在防治家畜中毒方面的应用前景，但所用的制备方法程序繁琐，反应过程检测困难，产率低，抗原成本过高，抗原的免疫原性不尽如人意，限制了其进一步研究应用。研究SW中毒机理和动物体内代谢动力学以及抗癌机制等急需建立一种SW免疫化学检测新方法，也为SW抗原的制备从而获得高效价的抗体提出了新的要求。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种合成苦马豆素抗原的方法。通过新的技术路线，探索程序简单、过程易于控制和监测，抗原性好，特异性强的合成方法，为其进一步研究应用奠定基础。本发明采用如下技术方案一种合成苦马豆素抗原的方法，首先将卤烃基芳基脂肪酸与醇反应生成卤烃基芳基脂肪酸酯，与苦马豆素反应生成带有芳香环结构的季铵盐，再与氢氧化钠反应脱酯生成钠盐，盐酸调节PH，生成SW-卤烃基芳基脂肪酸；最后与牛血清白蛋白(BSA)缩合成为 SW-BSA，过葡聚糖凝胶柱层析脱盐，冷冻干燥，测定其中BSA与SW的比例，免疫佐剂乳化得到SW免疫抗原。根据权利要求1所述的合成苦马豆素抗原的方法，其特征在于，具体制备按以下步骤进行第一步，化合物1的合成取60mL无水甲醇，冰浴冷却同时搅拌下逐滴加入约40ml乙酰氯，接着加入0. 1 IOg对氯甲基苯甲酸，搅拌过夜。减压蒸除溶剂，残留物进行硅胶柱层析分离，氯仿为洗脱剂，分步收集，得对氯甲基苯甲酸甲酯；将1. 71 171mg(0. 1 IOmmol)的SW和2倍量的对氯甲基苯甲酸甲酯溶于IOml 干燥丙酮，再加入催化量的NaI ；80°C水浴加热回流反应，TLC跟踪检测反应进程，约24h后反应完全。蒸除丙酮，残留物进行硅胶柱层析，依次用氯仿和氯仿-甲醇(1 1)洗脱，收集氯仿-甲醇洗脱部分，蒸除溶剂后得白色固体，即化合物1 ；
第二步化合物2的合成将化合物1溶于6ml甲醇，加入6mL 6mol/L NaOH溶液，搅拌反应2h ；用6mol/L HCl调pH 5-6 ；70°C减压蒸除溶剂，向残留物中加入5ml无水甲醇，搅拌数分钟，过滤，滤渣再用5ml甲醇洗涤，收集并合并滤液和洗涤液，蒸除溶剂；残留物进行硅胶柱层析，甲醇洗脱，分步收集；TLC检测，收集目标物，合并目标管，减压蒸除溶剂，得白色固体状化合物2;第三步，化合物3的合成其操作程序按常规DCC或EDC法进行。将0. 1 IOmmol 化合物 2 和 0. 005 0. 5mmol BSA 溶于 4ml MES 溶液，加入 EDC IOOmg,室温搅拌过夜；次日，将反应液过s印hadex LH-20柱，无离子水洗脱，磺基水杨酸检测，收集蛋白部分，装入透析袋浓缩后冷冻干燥，得白色粉末状目标物——化合物3 ；第四步，SW抗原的制备称取化合物3，即SW-BSA冻干粉，加生理盐水溶解后，加入等量白油佐剂，充分乳化，即为SW抗原。该发明涉及的合成路线简单，反应体系稳定，可通过紫外检测仪对反应过程进行实时检测，同时还可采用紫外光谱分析测定抗原上SW和BSA的摩尔比。抗原为白色油状， 有效含量5mg/mL，免疫有效期12个月，有效保护率达到90%以上。该抗原可用于制备抗SW 单克隆抗体和研究用高效价抗SW抗体，也可用于动物免疫，避免动物因采食疯草引起的中毒。动物经免疫后的抗体水平可通过以SW-OVA作为包被抗原的间接ELISA法检测。
图1为SW-氯甲基苯甲酸甲酯的质谱(MS)；图2为SW-氯甲基苯甲酸甲酯的1H NMR ；图3为SW-氯甲基苯甲酸甲酯13C NMR;图4为关键中间产物苦马豆素-氯甲基苯甲酸的质谱(MS)；图5为关键中间产物苦马豆素-氯甲基苯甲酸的 NMR ；图6为关键中间产物苦马豆素-氯甲基苯甲酸的13C NMR ；图7为氯化N-(4-氨甲酰基苯甲基)苦马豆素铵的质谱(MS)；图8为氯化N-(4-氨甲酰基苯甲基)苦马豆素铵的1H NMR ；图9为氯化N-(4-氨甲酰基苯甲基)苦马豆素铵的13C NMR ；图10化合物1和化合物2层析图，其中B为SW-氯甲基苯甲酸；A为SW-氯甲基苯甲酸甲酯。图11为SW-BSA和酰胺紫外扫描结果；BSA，Sff-BSA浓度均为0. 5X 10_5mol/L，酰胺浓度为 8. 77Xl(T5mol/L。
具体实施例方式为了更清楚的说明本发明，特给出实例对本发明作进一步的详细描述。
实施例1人工抗原的合成 按以下技术路线进行首先将卤烃基芳基脂肪酸与醇反应生成卤烃基芳基脂肪酸酯，后者再与苦马豆素反应生成带有芳环结构的苦马毒素季铵盐。所得产物再与氢氧化
4钠发生酯水解反应，生成SW-芳基脂肪酸结合物，最后与牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白
(OVA)缩合成含有芳环桥的SW-BSA结合物(SW人工抗原)。
权利要求
1.一种合成苦马豆素抗原的方法，其特征在于，首先将卤烃基芳基脂肪酸与醇反应生成卤烃基芳基脂肪酸酯，与苦马豆素反应生成带有芳香环结构的季铵盐，再与氢氧化钠反应脱酯生成钠盐，盐酸调节PH，生成SW-卤烃基芳基脂肪酸；最后与牛血清白蛋白(BSA)缩合成为SW-BSA，过葡聚糖凝胶柱层析脱盐，冷冻干燥，测定其中BSA与SW的比例，免疫佐剂乳化得到SW免疫抗原。
2.根据权利要求1所述的合成苦马豆素抗原的方法，其特征在于，具体制备按以下步骤进行第一步，化合物1的合成取60mL无水甲醇，冰浴冷却同时搅拌下逐滴加入约40ml乙酰氯，接着加入0. 1 IOg 对氯甲基苯甲酸，搅拌过夜。减压蒸除溶剂，残留物进行硅胶柱层析分离，氯仿为洗脱剂，分步收集，得对氯甲基苯甲酸甲酯；将1. 71 171mg(0. 1 IOmmol)的SW和2倍量的对氯甲基苯甲酸甲酯溶于IOml干燥丙酮，再加入催化量的NaI ；80°C水浴加热回流反应，TLC跟踪检测反应进程，约24h后反应完全。蒸除丙酮，残留物进行硅胶柱层析，依次用氯仿和氯仿-甲醇(1 1)洗脱，收集氯仿-甲醇洗脱部分，蒸除溶剂后得白色固体，即化合物1 ；第二步化合物2的合成将化合物1溶于6ml甲醇，加入6mL 6mol/L NaOH溶液，搅拌反应2h ；用6mol/L HCl 调pH 5-6 ;70°C减压蒸除溶剂，向残留物中加入5ml无水甲醇，搅拌数分钟，过滤，滤渣再用 5ml甲醇洗涤，收集并合并滤液和洗涤液，蒸除溶剂；残留物进行硅胶柱层析，甲醇洗脱，分步收集；TLC检测，收集目标物，合并目标管，减压蒸除溶剂，得白色固体状化合物2 ；第三步，化合物3的合成其操作程序按常规DCC或EDC法进行。将0. 1 IOmmol化合物2和0. 005 0. 5mmol BSA溶于4ml MES溶液，加入EDC IOOmg,室温搅拌过夜；次日，将反应液过s印hadex LH-20柱，无离子水洗脱，磺基水杨酸检测，收集蛋白部分，装入透析袋浓缩后冷冻干燥，得白色粉末状目标物——化合物3 ；第四步，SW抗原的制备称取化合物3，即SW-BSA冻干粉，加生理盐水溶解后，加入等量白油佐剂，充分乳化，即为SW抗原。
全文摘要
本发明公开了一种合成苦马豆素抗原的方法，首先将卤烃基芳基脂肪酸与醇反应生成卤烃基芳基脂肪酸酯，与苦马豆素反应生成带有芳香环结构的季铵盐，再与氢氧化钠反应脱酯生成钠盐，盐酸调节pH，生成SW-卤烃基芳基脂肪酸；最后与牛血清白蛋白(BSA)缩合成为SW-BSA，过葡聚糖凝胶柱层析脱盐，冷冻干燥，测定其中BSA与SW的比例，免疫佐剂乳化得到SW免疫抗原。抗原为白色油状，有效含量5mg/mL，免疫有效期12个月，有效保护率达到90％以上。
文档编号C07K14/765GK102250238SQ20111012469
公开日2011年11月23日 申请日期2011年5月16日 优先权日2011年5月16日
发明者周乐, 宋毓民, 王建华, 王爱华, 靳亚平 申请人:西北农林科技大学