专利名称：一种高效结合IgG的重组蛋白A及其工程菌的构建方法
技术领域：
发明一种高效结合IgG的重组蛋白A及其基因工程菌的构建方法，属于分子生物学和基因工程领域。
背景技术：
蛋白A，即金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)，是一种胞壁蛋白，90 %以上的金黄色葡萄球菌的细胞壁上均含有这种蛋白，但是不同菌株所含蛋白A的量不同。由于蛋白A分子不含有胱氨酸及半胱氨酸，所以蛋白A分子内无二硫键。有人对蛋白A的稳定性做了研究，研究发现蛋白A有很好的稳定性，用4mol/L尿素、硫氰盐酸、6mol/L的盐酸胍和pH2. 5的酸性条件，以及加热煮沸均不影响其活性。蛋白A是一种单链多肽，与胞壁肽聚糖呈共价结合，是完全抗原。蛋白A中的E、D、 A、B、C区域能与多种哺乳动物血清中IgG的Fc段发生非特异性结合，是蛋白A中IgG的抗体结合区，结合后IgG分子的Fab段仍然保持同相应抗原分子发生特异性结合的特性。利用蛋白A与IgG的这种特性提取纯化IgG，比常规采用硫酸铵、DEAE柱或免疫梯度离心等法简便且纯度高。目前主要利用从金黄色葡萄球菌表面直接提取的方法来获取蛋白A，该方法的对蛋白A提取效率不好，由于金黄色葡萄球菌细胞壁上的蛋白A含量少，很难大量提取获取， 且金黄色葡萄球菌是一种致病菌，直接从菌上分离蛋白A会增加工作的危险性，产品的安全性会降低。在这方面生物法显示了其优越性。利用基因工程手段从金黄色葡萄球菌的染色体中分离出表达蛋白A的基因序列，将该序列通过一系列分子生物学方法转化到大肠杆菌中，并使其在大肠杆菌中表达。应用这种方法可以避免直接从用致病性的金黄色葡萄球菌中分离蛋白A，而是从对人体无毒的大肠杆菌中分离目的蛋白，降低了工作的危险性，且蛋白A可在表达宿主中大量表达，从而为蛋白A的大量生产提供了可能。通过分子生物学方法构建表达重组蛋白A的基因工程菌还可以根据使用蛋白A的目的进行人工修饰，将蛋白A作为亲和层析柱的配基提取纯化IgG时，可以在蛋白A的C端设计一个半胱氨酸用来结合活化介质，这样可以增加蛋白A对IgG的吸附容量，提高亲和柱的效率。
发明内容
本发明有两方面主要研究内容内容一本发明利用分子生物学方法，设计了一种重组蛋白A，主要作为亲和色谱柱的配基用于提取纯化IgG。利用金黄色葡萄球菌蛋白A中IgG抗体结合区的蛋白片段，并在该片段的C端添加了一个半胱氨酸构成了重组蛋白A。以半胱氨酸的-SH来结合活化介质将蛋白A固定到活化介质上，提高蛋白A亲和色谱柱对IgG的吸附容量，从而增加工作效率。内容二 本发明利用了基因工程手段从金黄色葡萄球菌中克隆了内容一重组蛋白 A的基因，构建了重组质粒pMD18-T-spa，并将其转化到E. coil JM109成功构建了基因工程菌pMDIS-T-spa/E.coil JM109，用于保藏目的基因及增加目的基因的拷贝数。构建了重组质粒pET-28a-spa，并将其转化到E. coil BL21 (DE3)成功构建了基因工程菌pET_28a_spa/ Ε. coilBL21，并利用IPTG诱导该基因工程菌成功表达重组蛋白A，为进一步利用基因工程菌大量生产重组蛋白A提供了可能。本发明的技术方案内容一方案利用分子生物学方法，以NCBI公布的蛋白A的抗体结合区E、D、A、B、 C区域的基因序列为模板设计引物，并在C端引物上添加了一个半胱氨酸密码子。内容二方案从金黄色葡萄球菌中提取染色体作为模板，根据内容一设计好的引物及提前设计好的PCR扩增条件和扩增体系进行PCR。利用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收。用PCR回收产物16°C过夜连接克隆质粒PMD18-T，将连接产物转化感受态 E. coil JM109，挑取阳性转化子到IOml液体LB培养基中，37°C摇床培养过夜，提取质粒，酶切验证正确后加入甘油，-20°C保藏备用。提取基因工程菌pMD18-T-spa/E. coil JM109的质粒，用同一组限制性内切酶对重组质粒pMD18-T-spa和质粒pET_28a进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收双酶切产物， 利用T4DNA连接酶16 °C过夜连接重组质粒pETj8a-Spa，用连接产物转化感受态E. coil BL21 (DE3)，挑取阳性转化子到IOml液体LB培养基中，37°C摇床培养过夜，提取质粒，酶切验证正确后加入甘油，-20°C保藏备用，即成功构建了基因工程菌pETj8a-Spa/E. coil BL21。将冻管保藏的基因工程菌pET-^a-spa/E. coil BL21按的接种量转接到IOml 液体LB培养基中，37°C摇床培养过夜。次日按1 %的接种量转接，待菌液OD6tltl约0. 6 0. 8 时加入终浓度lmmol/L的IPTG，30°C诱导过夜表达。次日取Iml表达菌液，离心后弃上清液，用100 μ 1 ρΗ7· 6的Tris-HCl溶解沉淀，加30 μ 1上样缓冲液，混勻，沸水浴30min,离心取上清进行SDS-PAGE检测。本发明的有益效果蛋白A因其能与人及多种哺乳动物的IgG结合，从而被应用于IgG的提取。利用蛋白A提取IgG比传统IgG提取方法简便、纯度高。建立一种利用分子生物学方法设计一种高效结合IgG的重组蛋白A，并利用基因工程手段构建过量表达重组蛋白A菌株的方法有利于增加生产效率和工作安全性。本发明设计的重组蛋白A只包含其IgG抗体结合区，减小了蛋白A的分子量，缩短了蛋白A的肽链长度从而减少了与介质及 IgG结合的位阻效应，同时利用C端添加的半胱氨酸结合活化介质有利于提高蛋白A亲和色谱柱对IgG的吸附容量，增加了 IgG的提取效率，降低了生产成本，而且，由于本发明的表达宿主是大肠系统，没有毒副作用或毒副作用很小，从而增加了蛋白A生产的安全性，为工业化生产提供了可能。
图1重组质粒pMD18-T_spa的构建。图2重组质粒pMD18-T_spa酶切验证(证明是反接)。1 λ-HindIII degest marker ；2 =BamH I 单酶切；3 =BamH I 禾口 Noc I 双酶切；4 :DL 2000degest marker图3重组质粒pET18a-spa的构建。图 4 重组质粒 pET-28a-spa 酶切验证。1 λ -Hind III degest marker ；2 :Bam HI 单酶切；3 =BamH I 和 Noc I 双酶切；4 :DL 2000degest marker图5重组蛋白A的表达。1:含质粒pET18a;2:含重组质粒pET18a-spa;3: Protein Marker
具体实施例方式实施例1 重组蛋白A抗体结合区引物设计根据NCBI公布的基因序列，利用DNAMAN软件设计引物P1和P2。P1 :5，-ACCGCCATGGTATTGAAAAAGAAAAACATT-3，Noc IP2 :5，-ACCGGGATCCTTAACATAGTTCGCGACGACGTCC-3，Bam H I引物中斜体部分为酶切位点，在引物P2中加了一个半胱氨酸密码子和一个终止密码子。以蛋白A的IgG抗体结合区设计引物其目的在于有效的减少肽链的长度，减少结合介质和IgG时的位阻效应。在蛋白A的C端设计一个半胱氨酸，目的是以半胱氨酸的-SH 来结合活化介质，提高对IgG的吸附容量。实施例2 重组质粒pMD18-T_spa的构建[1]从金黄色葡萄球菌提取的染色体DNA作为模板，提取方法用接种环从新鲜的金黄色葡萄球菌平板上挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37°C振荡过夜，次日取400 μ 1 菌液，8000r/min离心;3min，弃上清，用0. 5ml TE洗涤一次细胞，离心弃上清，再用0. 5ml TE 充分悬浮细胞，加入50 μ 1 10mg/ml的溶菌酶液，混勻，37°C水浴2_3h，加入100 μ 1 10% 305，混勻，371保温301^11，加入5(^1 10mg/ml的蛋白酶K，65°C反应汕，期间每隔半小时混勻一次，加入等体积饱和酚，混勻，8000r/min离心5min，上清移入另一个离心管中，往上清液中加入等体积的饱和酚再次抽提，转移上清到另一离心管中，加入等体积氯仿抽提两次，8000r/min离心5min，将上清移入另一管中，加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的醋酸钠，室温放置5min，8000r/min离心2min，弃上清，用70%乙醇悬浮细胞，离心，倒掉液体， 倒置于吸水纸上，室温晾干，用50 μ 1 TE溶解，-20°C保藏备用。[2]以金黄色葡萄球菌总DNA为模板，利用实施例1提供的引物做PCR扩增，扩增条件为94°C，5min，1 个循环；94 °C，40s，56 °C，lmin30s，72 °C，lmin30s，35 个循环；72°C， 10min，l 个循环；15°C，10min，l 个循环。扩增体系:ddH20 17 μ 1，模板 2 μ 1，引物 P1O. 5 μ 1， 引物 P2O. 5 μ 1，dNTP Mix 2 μ 1，ex-buffer 2. 5 μ 1，ex-Taq 0. 5 μ 1。利用琼脂糖凝胶回收
盒对目的基因进行回收。[3]构建重组质粒pMD18-T_spa，导入到感受态Ε. coil JM109。连接体系PCR凝胶回收产物4.8 μ 1，solution I 5 μ l，pMD18_T质粒0. 5 μ 1，16°C过夜连接。转化方法将连接好的10 μ 1 pMD18-T-spa加入到120 μ 1感受态Ε. coil JM109中，于冰上放置45min， 42°C热击90s，放置冰上2min，加入800 μ 1 LB液体培养基，37°C摇床培养lh，离心，倒掉大部分上清液，留150μ 1与沉淀混勻，涂布到氨苄青霉素平板(Amp+LB)上，于37°C培养箱培养9h左右，挑去平板上的阳性菌落到IOml液体LB培养基中，37°C摇床过夜培养。提取质粒，经酶切验证连接成功后，将菌液加入终浓度17% (w/v)的甘油，_20°C冰箱保藏。实施例3 重组质粒pET18a-spa的构建构建重组载体pET18a-spa，将实施例2 [3]中提取的质粒和质粒pET_28a用BamH I和Noc I双酶切，利用凝胶回收盒回收后进行连接，连接体系目的基因酶切产物7. 5μ1，pET-28a酶切产物0. 5 μ 1，T4DNA连接酶buffer 1 μ 1，T4DNA连接酶1 μ 1，16 °C过夜连接。 将连接好的重组质粒pETj8a-Spa转化到感受态Ε. coil BL21，转化方法参照实施例2[3]， 用卡那霉素平板(Kana+LB)挑取阳性菌落。37°C摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后加入甘油，-20°C冰箱保藏备用。实施例4 重组蛋白A表达及进行SDS-PAGE检测将实施例3得到的菌按的接种量接到新的LB液体培养基中，当菌液0D_约 0. 6 0. 8时加入终浓度lmmol/L的IPTG诱导表达，30°C摇床过夜培养。取所得菌液Iml 于1. 5ml离心管中，8000r/min离心2min，倒掉上清，加入100 μ 1 ρΗ6. 8的Tris-HCl缓冲液将菌体混勻，加入30 μ 1蛋白胶上样缓冲液，沸水浴30min，8000r/min离心^iin取上清作为样品进行SDS-PAGE检测，其中SDS-PAGE使用5%的分离胶和15%的浓缩胶，采用不连续垂直电泳，用考马斯亮蓝R250染色，以含有空载质粒pET48a的E. coil BL21做空白对照。
权利要求
1.一种高效结合IgG的重组蛋白A及其工程菌的方法，其特征是根据NCBI公布的基因序列利用DNAMAN对蛋白A的五个IgG抗体结合区E、D、A、B、C区域设计引物，并在蛋白A 的C端引物上添加了一个半胱氨酸，做为亲和层析的配基使用时利用半胱氨酸的巯基结合活化介质，增加蛋白A对IgG的吸附容量。
2.构建克隆重组质粒pMD18-T-spa其目的在于保存目的基因，减少每次连接都需PCR 的工作量；其特征是以金黄色葡萄球菌染色体为模板，克隆得到大量编码蛋白A的基因，然后与克隆载体PMD18-T连接，得到重组质粒pMD18-T-spa，将重组质粒转化到感受态E. coil JM109进行复制和保存；(1)克隆蛋白A抗体结合区基因根据权利要求1所设计的引物对金黄色葡萄球菌基因组进行PCR得873bp的特异性条带；(2)构建重组质粒pMD18-T-spa利用凝胶回收试剂盒对目的基因进行回收，将回收到的目的基因与PMD18-T质粒16°C 过夜连接，转化感受态Ε. coli JM109，利用氨苄青霉素平板挑取阳性菌落，转接到LB培养基37°C振荡培养12h，提取质粒，酶切验证正确后用甘油于-20°C保藏菌种。
3.构建重组质粒pETj8a-Spa，其特征是提取权利要求2所构建菌的质粒，用BamHI 和Noc I对所提取质粒和质粒pET-28a双酶切，利用T4DNA连接酶于16°C过夜连接，转化感受态E. coli BL21，利用卡那霉素平板挑取阳性菌落，转接到LB培养基中，37°C振荡培养 12h，提取质粒，酶切验证正确后加入甘油，于-20°C保藏菌种。
4.重组蛋白A的诱导表达及其SDS-PAGE验证，其特征在于活化权利要求3构建的表达菌株，转接到LB培养基中，当菌液OD6tltl约0. 6 0. 8时添加终浓度lmmol/L的IPTG，于30°C 诱导表达，振荡培养过夜，次日将菌液离心，弃上清，用PH7. 6的Tris-HCl充分悬浮细胞，加入25% (ν/ν)的上样缓冲液，沸水浴30min，离心后取上清液进行SDS-PAGE验证，SDS-PAGE 采用5%的浓缩胶和15%的分离胶。
全文摘要
本发明公开了一种高效结合IgG的重组蛋白A及其工程菌的构建方法。根据NCBI公布的基因序列对金黄色葡萄球菌蛋白A的IgG抗体结合区E、D、A、B、C区域设计重组蛋白A引物，并在C端引物中添加一个半胱氨酸密码子。以金黄色葡萄球菌的基因组为模板，扩增得到编码重组蛋白A抗体结合区的基因(spa)，将其与质粒pMD18-T连接，转化感受态E.coil JM109，得到大量重组质粒pMD18-T-spa，从而保存基因和增加基因的拷贝数。提取重组质粒，用Noc I和BamH I对重组质粒和质粒pET-28a进行双酶切，连接重组质粒pET-28a-spa，转化感受态E.coil BL21，添加终浓度1mmol/L的IPTG于30℃诱导表达，经SDS-PAGE验证表达成功。
文档编号C07K16/00GK102373225SQ20111012491
公开日2012年3月14日 申请日期2011年5月16日 优先权日2011年5月16日
发明者吴璞强, 夏海锋, 金雄华, 饶志明 申请人:江南大学