专利名称：以美洲一枝黄花为原料同时提取二咖啡酰奎尼酸和绿原酸的方法
技术领域：
本发明涉及以植物为原料提取制备有效成分的方法，具体涉及从美洲一枝黄花中同时提取纯化二咖啡酰奎尼酸且同时得到绿原酸的方法。
背景技术：
一枝黄花属QS0Iideig0 )为菊科(Xkmipositae )中的一属。一枝黄花属植物全球大约120种，在中国分布有四种，分别为一枝黄花decurrens Lour)、毛果一枝黄花{SoHdago virgaurea )、纯包一枝黄花(Solidagopacifica )禾口美洲一枝黄花{Solidago Canadensis )。其中美洲一枝黄花在我国是入侵植物。美洲一枝黄花又称加拿大一枝黄花，是原产于北美的菊科多年生草本植物，具根状茎，叶披针形或线状披针形，秋季开黄花。适合于在低温的环境中生长，我国于1935年引入作为花卉植物，20世纪80年代扩散蔓延成杂草。美洲一枝黄花在我国主要分布在上海、浙江、江苏、安徽四省市，另外在重庆、福建、贵州、河南、湖北、湖南、江西、山东等地也有分布。美洲一枝黄花以根状茎和种子两种方式进行繁殖，繁殖力很强，对胁迫环境具有较强的耐受性和适应能力，并且通过向体外环境中释放出化学物质，即化感作用，抑制其他植物的生长，可导致入侵地本地植物多样性的丧失。在美洲一枝黄花的大片生长区，每年都需投入大量的人力和物力进行铲除。二咖啡酰奎尼酸(Dicaffeoylquinic acid)是由奎尼酸与二分子的咖啡酸组成的缩酚酸，根据咖啡酸取代位置的不同，可以分为1，3- 二咖啡酰奎尼酸，1，4- 二咖啡酰奎尼酸，1，5- 二咖啡酰奎尼酸，3，4- 二咖啡酰奎尼酸，3，5- 二咖啡酰奎尼酸和4，5- 二咖啡酰奎尼酸；在植物体内，后四种是比较常见的类型。另外，在植物体内，奎尼酸上的羧基被酯化后再与二分子的咖啡酸结合后又会形成一些羧基酯化产物，如Heilmarm等}^Buphtheilmum ■sdici/b/i (牛眼菊)中分离得到3，5-二咖啡酰奎尼酸异丁酯。绿原酸(5-咖啡酰奎尼酸)是由奎尼酸与一分子的咖啡酸组成的缩酚酸，在国内外已有较广泛的研究，具有抗菌、 抗病毒、抑制突变、保肝利胆等多种生物学和药学作用。二咖啡酰奎尼酸类化合物具有比单咖啡酰奎尼酸更为优越的生物学和药学活性， 在抗氧化、抗诱变、肝细胞保护等方面的活性高于含有一个咖啡酰基的绿原酸。国内正在进行临床试验的二咖啡酰奎尼酸新药IBE-5既有抗乙肝病毒的作用，又有抗艾滋病的功效。 动物药效学实验表明，该药在显著抑制猴艾滋病毒复制，降低猴艾滋病毒数量，有效逆转猴艾滋病毒病变方面，作用显著强于鸡尾酒疗法用药，动物试验还显示了 IBE-5在抑制乙肝病毒方面的良好前景(抗艾新药进入临床试验，中国药事，2006，20(1) :45)。由于二咖啡酰奎尼酸在所发现的中药旋复花中含量很低，分离纯化工艺复杂，难以进行规模化生产，因此二咖啡酰奎尼酸新药(IBE-5)主要是通过化学合成方法制备，本发明发现美洲一枝黄花中具有高含量的二咖啡酰奎尼酸(叶中含量0. 99%，花中含量1. 98%)，从中提取分离这种天然药物比化学合成法将有着多方面的优势。国外研究表明，美洲一枝黄花中含有绿原酸(5-咖啡酰奎尼酸)和二咖啡酰奎尼酸，(Marie-Eve et al. A New Labdane Diterpene from the Flowers of Solidago canadensis, Journal of Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2008, 56(1):82-84), 但未报道具体含量，本发明经研究发现，美洲一枝黄花中二咖啡酰奎尼酸含量在叶和花中的含量分别达到0. 99%和1. 98%，因此用美洲一枝黄花制备二咖啡酰奎尼酸和绿原酸具有重要的现实意义，对于二咖啡酰奎尼酸药物的原料开拓有巨大的应用价值，对清除美洲一枝黄花是经济可行的方法。本课题组公开的中国发明专利一枝黄花中提取分离绿原酸的方法(陈育如等，CN 101445456A)提出了以一枝黄花为原料提取分离绿原酸的方法，其中未涉及二咖啡酰奎尼酸的提取与分离。本发明提出用美洲一枝黄花即能提取分离绿原酸，还能同时提取其中高含量的二咖啡酰奎尼酸，是对本课题组上一专利的深入研究，是对美洲一枝黄花中咖啡酰奎尼酸类物质的充分开发与利用。中国发明专利菊芋中二咖啡酰奎尼酸组分的分离提纯方法(CN 101747195A)以菊芋为原料分离提纯二咖啡酰奎尼酸类化合物，纯化工艺需用到分离材料kphadex LH20, 此材料价格昂贵(进口产品23000元/KG，国产10000元/KG)，因而带来生产成本高昂；且美洲一枝黄花的成份与菊芋成份差异很大，从美洲一枝黄花中提取绿原酸和二咖啡酰奎尼酸的方法与从菊芋中提取不同。本发明所采用的萃取分离后以聚酰胺与硅胶联用等方法所用的填料成本较低。菊芋主要由人工种植得到，需要有人力和物力的费用，而美洲一枝黄花是我国的入侵植物，在荒地自行大量生长，资源量非常大，仅在浙江省2004年Γ11月间，美洲一枝黄花发生面积达1. 119万hm2 (蔡冲.构建浙江省外来入侵生物防范体系的构想，浙江农业科学，2007，(5): 564-566)。因此以美洲一枝黄花作为原料有着充足的低成本来源，且收获过程本身即是对入侵植物的有效清理，可以极大地降低生产二咖啡酰奎尼酸、绿原酸的原料成本及清理美洲一枝黄花的成本，可有效解决以往清理美洲一枝黄花只有投入而无任何效益的问题，提取有效成份后的提取剩余物还可用本课题组开发的已获授权的微生物发酵剂(陈育如等.微生物发酵菌剂及用该发酵菌剂生产饲料或乙醇的方法， ZL200410065656. 8;微生物发酵剂，ZL 200410065178. 0)将其全部转化为饲料或有机肥料产品，使之物尽其用。中国发明专利“烟草作为制备绿原酸原料的应用及用烟草制备绿原酸的方法”(陈育如等，ZL 200410065M0.6)提出了以烟草废料为原料提取制备绿原酸的方法。烟草废料是一种低成本的原料，但烟草中的烟碱含量较高，所提取得到的绿原酸中含有烟碱，如不彻底分离将影响其在医药和食品等方面的应用。从美洲一枝黄花中提取二咖啡酰奎尼酸和绿原酸产品，无需考虑烟碱的影响，比烟草原料有着更大的优势，为二咖啡酰奎尼酸和绿原酸的生产提供了大宗无毒的原料。
发明内容
为使入侵植物美洲一枝黄花得到有效的资源化利用和同时得到绿原酸(5-咖啡酰奎尼酸)和二咖啡酰奎尼酸产品，本发明提出了以美洲一枝黄花为原料提取纯化二咖啡酰奎尼酸和绿原酸的方法。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案实现
1)溶剂提取(可有微波或超声波辅助)将美洲一枝黄花粉碎或直接取原料，用甲醇或乙醇或丙酮溶液经提取过滤后，减压浓缩；
2)溶剂萃取将浓缩的提取液用石油醚脱脂后，先后用不同的有机溶剂进行萃取，分别得到含有二咖啡酰奎尼酸的萃取液和含有绿原酸的萃取液；
3)二咖啡酰奎尼酸纯化将含有二咖啡酰奎尼酸的萃取液浓缩后，上大孔树脂柱后经洗脱剂洗脱，收集含有二咖啡酰奎尼酸的组分；浓缩后上聚酰胺柱，经洗脱收集含有二咖啡酰奎尼酸的组分，浓缩后上硅胶柱，经洗脱收集含有二咖啡酰奎尼酸的组分，浓缩、精制后得到含量80% 95%的二咖啡酰奎尼酸；
4)绿原酸纯化将含有绿原酸的萃取液浓缩后，先后经大孔树脂、聚酰胺、硅胶精制后得到含量90%以上的绿原酸产品。上述提取纯化方法中，提取原料为美洲一枝黄花的叶或花或全草。上述提取纯化方法中，提取溶剂为体积浓度20% 95%的甲醇或乙醇或丙酮，最好用体积浓度40% 80%的甲醇或乙醇或丙酮。上述提取纯化方法所用的溶剂萃取中，经石油醚萃取脱脂后，可先用甲酸甲酯或乙酸甲酯或乙酸乙酯或乙酸丁酯进行萃取，再用正戊醇或异戊醇或正丁醇进行萃取。上述提取纯化方法，在对二咖啡酰奎尼酸的纯化中，所得的二咖啡酰奎尼酸为 3，4-0- 二咖啡酰奎尼酸，3，5-0- 二咖啡酰奎尼酸，4，5-0- 二咖或啡酰奎尼酸，1，3-0- 二咖啡酰奎尼酸，1，4-0- 二咖啡酰奎尼酸或1，5-0- 二咖啡酰奎尼酸中的一种或几种。上述提取纯化方法，在对二咖啡酰奎尼酸的纯化中，含有二咖啡酰奎尼酸的萃取液，经浓缩后上大孔树脂柱吸附后，用去离子水和体积浓度25% 80%甲醇或乙醇或丙酮洗脱，最好用体积浓度50% 60%的甲醇或乙醇或丙酮洗脱，收集含有二咖啡酰奎尼酸组分的洗脱液，浓缩得聚酰胺柱上样液，吸附洗脱后，经浓缩、精制得到产品。上述提取纯化方法，在对二咖啡酰奎尼酸的纯化中，可以用乙酸乙酯或丙酮或甲醇或乙醇洗脱，也可用其中二种或三种溶剂按不同的配比洗脱。上述提取纯化方法，在对绿原酸的纯化中，含有绿原酸的萃取液浓缩后上大孔树脂柱吸附后，经洗脱，收集再经聚酰胺柱、硅胶分离后，精制得到产品。上述提取纯化方法，在对二咖啡酰奎尼酸和绿原酸的纯化中，所用的大孔树脂为非极性或极性大孔树脂，最好用极性树脂，树脂可以是NKA-9、NKA- II、AB_8、LSA-7、 LSA-20、XDA-I、)(DA-8、HPD-100、HPD-500、ADS-17、ADS-7 中的一种或几种，所列树脂并非仅限于以上的一种或几种。本发明的有益效果是大量的入侵植物美洲一枝黄花为二咖啡酰奎尼酸和绿原料的分离纯化提供了丰富的植物资源，极大地降低了原料成本和生产成本；可以同时得到二咖啡酰奎尼酸和绿原酸两种高附加值产品。使原来以人工合成的抗艾滋或乙肝新药IBE-5 可从天然产物中大量提取，且工艺简单，操作方便，使用的大孔树脂、聚酰胺和硅胶等材料均可再生使用，生产成本低，过程绿色、环保。美洲一枝黄花的叶提取液、花提取液、绿原酸标品、二咖啡酰奎尼酸之一标品的 HPLC分析分别如图1、图2、图3、图4所示。
图1美洲一枝黄花(叶)浸提液HPLC图； 图2美洲一枝黄花(花)浸提液HPLC图3绿原酸标准品HPLC图； 图4 二咖啡酰奎尼酸之一标准品HPLC图。
具体实施例方式下面将结合具体实施方式
进一步说明本发明，举例是为说明本发明的过程而非仅限于实施例。实施例1
1)取美洲一枝黄花的叶100g，用体积浓度70%的乙醇1000ml，在超声辅助下提取，过滤，浓缩。2)浓缩液经石油醚脱脂，用甲酸甲酯萃取后，再用异戊醇萃取。3)上步甲酸甲酯萃取液，浓缩后，上HPD-100大孔树脂柱吸附，依次用去离子水和体积浓度25%的甲醇洗脱，收集含有二咖啡酰奎尼酸的洗脱液浓缩。浓缩液上聚酰胺柱吸附，用30%甲醇洗脱，浓缩后洗脱液上硅胶柱，乙酸乙酯洗脱，洗脱液浓缩干燥，得到含量为 81%的二咖啡酰奎尼酸0. 40g。4)上步异戊醇萃取液，浓缩后，上NKA-9大孔树脂柱吸附，依次用去离子水和甲醇溶液洗脱，收集含有绿原酸的洗脱液浓缩。浓缩液上聚酰胺柱吸附后，经洗脱、浓缩、硅胶精制，得到含量为92%的绿原酸0. 42g。实施例2
1)取美洲一枝黄花的叶100g，用体积浓度50%的甲醇2000ml，在超声辅助下提取，过滤，浓缩。2 )浓缩液经石油醚脱脂，用乙酸甲酯萃取后，再用正丁醇萃取。3)上步乙酸甲酯萃取液，浓缩后，上AB-8大孔树脂柱吸附，依次用去离子水和体积浓度80%的乙醇洗脱，收集含有二咖啡酰奎尼酸的洗脱液，经聚酰胺柱吸附，用85%乙醇洗脱后，收集含有二咖啡酰奎尼酸的洗脱液，浓缩后洗脱液上硅胶柱，丙酮洗脱，洗脱液浓缩干燥，得到含量为83%的二咖啡酰奎尼酸0. 37g。4)上步正丁醇萃取液，浓缩后，上ADS-17大孔树脂柱吸附，依次用去离子水和乙醇溶液洗脱，收集含有绿原酸的洗脱液，浓缩。浓缩液上聚酰胺柱吸附后，经洗脱，浓缩、精制后，得到含量为93%的绿原酸0. 40g。实施例3
1)取美洲一枝黄花的叶100g，用体积浓度60%的丙酮1600ml，经提取，过滤，浓缩。2)浓缩液经石油醚脱脂，用乙酸乙酯萃取后，再用正戊醇萃取。3)上步乙酸乙酯萃取液，浓缩后，上ADS-7大孔树脂柱吸附，依次用去离子水和体积浓度60%的乙醇洗脱，收集含有二咖啡酰奎尼酸的洗脱液浓缩。经聚酰胺柱吸附、洗脱， 和硅胶精制后，得到含量为92%的二咖啡酰奎尼酸0. 32g。4)上步正戊醇萃取液，浓缩后，上NKA- II大孔树脂柱吸附，依次用去离子水和乙醇溶液洗脱，收集含有绿原酸的洗脱液浓缩。经聚酰胺柱吸附、洗脱、浓缩和精制后，得到含量为90%的绿原酸0. 45g。实施例4
1)取美洲一枝黄花的叶100g，用体积浓度55%的乙醇1600ml，在微波辅助下提取，过滤，浓缩。2)浓缩液经石油醚脱脂，用乙酸丁酯萃取后，再用异戊醇萃取。3)上步乙酸丁酯萃取液，浓缩后，上LSA-7大孔树脂柱吸附，依次用去离子水和体积浓度50%的甲醇洗脱，收集含有二咖啡酰奎尼酸的洗脱液浓缩。经聚酰胺柱吸附、洗脱和精制后，得到含量为95%的二咖啡酰奎尼酸0. 30g。4)上步异戊醇戊醇萃取液，浓缩后，上XDA-8大孔树脂柱吸附，依次用去离子水和丙酮溶液洗脱，收集含有绿原酸的洗脱液浓缩。经聚酰胺柱吸附、洗脱和硅胶精制后，得到含量为91%的绿原酸0. 44g。实施例5
1)取美洲一枝黄花的叶100g，用体积浓度95%的乙醇1200ml，在微波辅助下提取，过滤，浓缩。2 )浓缩液经石油醚脱脂，用甲酸甲酯萃取后，再用正丁醇萃取。3)上步甲酸甲酯萃取液，浓缩后，上LSA-20大孔树脂柱吸附，依次用去离子水和体积浓度80%的甲醇洗脱，收集含有二咖啡酰奎尼酸的洗脱液浓缩。经聚酰胺柱吸附、洗脱后，经硅胶精制，得到含量为84%的二咖啡酰奎尼酸0. 36g。4)上步正丁醇萃取液，浓缩后，上XDA-I大孔树脂柱吸附，依次用去离子水和甲醇溶液洗脱，收集含有绿原酸的洗脱液浓缩。经聚酰胺柱吸附、洗脱、精制后，得到含量为95% 的绿原酸0. 38g。实施例6
1)取美洲一枝黄花的叶100g，用体积浓度40%的甲醇1800ml，在超声辅助下提取，过滤，浓缩。2 )浓缩液经石油醚脱脂，用乙酸甲酯萃取后，再用正戊醇萃取。3)上步乙酸甲酯萃取液，浓缩后，上NKA- II大孔树脂柱吸附，依次用去离子水和体积浓度25%的乙醇洗脱，收集含有二咖啡酰奎尼酸的洗脱液，经聚酰胺柱吸附、洗脱、精制后，得含量90%的二咖啡酰奎尼酸0. 33g。4)上步正戊醇萃取液，浓缩后，上HPD-500大孔树脂柱吸附，依次用去离子水和乙醇溶液洗脱，收集含有绿原酸的洗脱液浓缩。经聚酰胺柱吸附、洗脱、精制后，得到含量92% 的绿原酸0. 41g。实施例7
与实施例1的提取及纯化工艺过程基本相同，所不同的是用于提取的原料为美洲一枝黄花的花或全草100g，提取溶剂为20%的乙醇2500ml。实施例8
与实施例2的提取及纯化工艺过程基本相同，所不同的是用于提取的原料为美洲一枝黄花的花或全草，提取溶剂为20%甲醇2500ml。实施例9
与实施例3的提取及纯化工艺过程基本相同，所不同的是用于提取的原料为美洲一枝
7黄花的花或全草，提取溶剂为95%甲醇1200ml。实施例10
与实施例4的提取及纯化工艺过程基本相同，所不同的是用于提取的原料为美洲一枝黄花的花或全草，提取溶剂为60%的乙醇1600ml。实施例11
与实施例5的提取及纯化工艺过程基本相同，所不同的是用于提取的原料为美洲一枝黄花的花或全草，提取溶剂为40%的乙醇1800ml。实施例12
与实施例6的提取及纯化工艺过程基本相同，所不同的是用于提取的原料为美洲一枝黄花的花或全草，提取溶剂为80%的甲醇1500ml。实施例13
与实施例6的提取及纯化工艺过程基本相同，所不同的是用于提取的原料为美洲一枝黄花的花或全草，提取溶剂为60%的丙酮1500ml。实施例14
与实施例6的提取及纯化工艺过程基本相同，所不同的是用于提取的原料为美洲一枝黄花的花或全草，提取溶剂为20%的丙酮1500ml。实施例15
与实施例6的提取及纯化工艺过程基本相同，所不同的是用于提取的原料为美洲一枝黄花的花或全草，提取溶剂为95%的丙酮1500ml。
权利要求
1.以美洲一枝黄花为原料同时提取二咖啡酰奎尼酸和绿原酸的方法，包括以下步骤1)提取将美洲一枝黄花粉碎或直接取原料，用甲醇或乙醇或丙酮等溶液提取过滤后，减压浓缩；2)溶剂萃取将浓缩的提取液用石油醚脱脂后，先后用不同的有机溶剂进行萃取，分别得到含有二咖啡酰奎尼酸的萃取液和含有绿原酸的萃取液；3)二咖啡酰奎尼酸纯化将含有二咖啡酰奎尼酸的萃取液浓缩后，上大孔树脂柱，经洗脱剂洗脱，收集含有二咖啡酰奎尼酸的组分；浓缩，上聚酰胺柱后洗脱，收集含有二咖啡酰奎尼酸的组分，浓缩干燥后溶解上硅胶柱，经洗脱收集含有二咖啡酰奎尼酸的组分，浓缩干燥和精制后，得到含量为80% 95%的二咖啡酰奎尼酸；4)绿原酸纯化将含有绿原酸的萃取液浓缩后，先后经大孔树脂和聚酰胺吸附分离， 硅胶精制后，得到含量90%以上的绿原酸产品。
2.如权利要求1所述方法，其特征在于所述1)中提取原料为美洲一枝黄花的叶或花或全草。
3.如权利要求1所述方法，其特征在于所述1)中提取溶剂为体积浓度20% 95%的甲醇或乙醇或丙酮，最好用体积浓度40% 80%的甲醇或乙醇或丙酮。
4.如权利要求1所述方法，其特征在于所述2)中石油醚萃取脱脂后，可先用甲酸甲酯或乙酸甲酯或乙酸乙酯或乙酸丁酯进行萃取，再用正戊醇或异戊醇或正丁醇进行萃取。
5.如权利要求1所述方法，其特征在于所述3)中所得的二咖啡酰奎尼酸物质为 3，4-0- 二咖啡酰奎尼酸，3，5-0- 二咖啡酰奎尼酸，4，5-0- 二咖或啡酰奎尼酸，1，3-0- 二咖啡酰奎尼酸，1，4-0- 二咖啡酰奎尼酸或1，5-0- 二咖啡酰奎尼酸中的一种或几种。
6.如权利要求1所述方法，其特征在于所述3)中，含有二咖啡酰奎尼酸的萃取液，浓缩后上大孔树脂柱吸附后，依次用去离子水和体积浓度25% 80%甲醇或乙醇或丙酮洗脱，最好用体积浓度50% 60%的甲醇或乙醇或丙酮洗脱，收集含有二咖啡酰奎尼酸组分的洗脱液，浓缩得聚酰胺柱上样液。
7.如权利要求1所述方法，其特征在于所述3)中，聚酰胺柱上样液在聚酰胺柱中吸附后，依次用去离子水和体积浓度30% 85%甲醇或乙醇或丙酮洗脱，最好用体积浓度70% 80%的甲醇或乙醇或丙酮，收集含有二咖啡酰奎尼酸组分的洗脱液，经浓缩干燥得到粉末。
8.如权利要求1所述方法，其特征在于所述3)中，过聚酰胺柱得到的粉末溶解后上硅胶柱，可以用乙酸乙酯或丙酮或甲醇或乙醇洗脱，也可用其中二种或三种溶剂按不同的配比洗脱。
9.如权利要求1所述方法，其特征在于所述4)中，含有绿原酸的萃取液浓缩后上大孔树脂柱，吸附后，依次用去离子水和甲醇或乙醇或丙酮溶液洗脱，收集含有绿原酸的洗脱液；浓缩得聚酰胺柱上样液，吸附后，依次用去离子水和甲醇或乙醇或丙酮溶液洗脱，收集含有绿原酸的洗脱液，浓缩后再用硅胶精制。
10.如权利要求1所述方法，其特征在于所述3)和所述4)中所用的大孔树脂为非极性或极性大孔树脂。
全文摘要
本发明公开了以美洲一枝黄花为原料，同时提取分离二咖啡酰奎尼酸、绿原酸的方法。将美洲一枝黄花用甲醇或乙醇或丙酮等溶剂(可用微波或超声波辅助)浸提，浓缩，石油醚脱脂后，先后用不同的有机溶剂进行萃取，经分离纯化得到含量80%～95%的二咖啡酰奎尼酸和含量90%以上的绿原酸。本发明工艺简单，操作方便，所用柱填料可回收利用。本发明分离纯化美洲一枝黄花中二咖啡酰奎尼酸和绿原酸是对美洲一枝黄花的有效利用，变被动清除为主动利用，使之变废为宝，有着良好的环境、经济和社会效益。
文档编号C07C69/732GK102391120SQ20111040350
公开日2012年3月28日 申请日期2011年12月7日 优先权日2011年12月7日
发明者张伟娜, 张怡斐, 王建芬, 陈育如 申请人:南京师范大学