专利名称：乳腺特异性表达水牛prl基因载体、构建及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，尤其是涉及一种乳腺特异性表达水牛PRL基因载体、 构建及其应用。
背景技术：
催乳素(prolactin，PRL)是脑垂体分泌的一种单链多肽类激素，在动物体内具有多种重要的生物学功能，目前已发现的生物学功能超过300种，其中对启动和维持泌乳具有重要意义，对乳蛋白、乳糖和乳脂等重要乳成分的合成起主要调控作用，因而PRL基因是与产奶量密切相关的基因之一。Brym等研究表明，PRL-RsaI位点对奶牛的产奶量和乳脂率具有显著影响。PRL基因缺陷性小鼠中，纯合体雌性小鼠乳腺不发育，切片结果显示，其乳腺腺泡未得到正常发育。假孕兔注射PRL，能引起乳腺腺泡分化，高尔基氏囊泡膨大，腺泡腔内出现大量的脂肪球和蛋白质胶粒。体外实验表明，PRL有促进未分化的乳腺细胞分裂的作用。而乳腺腺泡细胞的发育则需要雌二醇、孕酮与催乳素的协同作用。由此可见，催乳素 PRL基因对奶牛泌乳性能具有重要调节作用。
目前，对PRL的有关研究日益增多，开展实验需要大量PRL蛋白，例如Elisa试剂盒需要标准品；生产各类抗体过程中，也需要PRL蛋白作为抗原。然而，由于PRL仅在垂体组织中大量表达，而垂体是一个很小的内分泌腺(例如成人垂体大小约为1x1. 5x0. 5cm3，重仅约0. 5 0. 6克)，从垂体中提取纯化的催乳素价格极其昂贵，远不能满足市场需求。通过原核表达方法纯化出的PRL蛋白，由于无法确保其序列空间折叠的正确性，生产的蛋白难以保证具有生理活性。市场上的PRL蛋白主要依靠细胞系表达法生产，可是生产成本依然昂贵。因此，急需发展一种可以大量获得廉价RPL蛋白的方法。
此外，2004年中国人均奶类年占有量仅18. 4公斤，在世界上排在百名之后，不及世界平均水平的1/5、亚洲平均水平的1/2。因而，现阶段急需一种可提高动物产奶量的方法，以满足市场对奶制品的需求。发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种乳腺特异性表达水牛PRL基因载体、构建及其应用，利用该乳腺特异性表达水牛PRL基因载体可生产转基因动物，用于生产水牛PRL蛋白并能提高转基因动物的产奶量，以满足市场对廉价RPL蛋白和奶制品的大量需求。
为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案乳腺特异性表达水牛PRL基因载体，该载体是
载体一pMD18T-BCN-PRL/Hi s-BCNpo lyA-cmv-EGFP-SV40polyA，
或载体二pMD18T-BCN-PRL/His-BCNpolyA-EF321-EGFP-IRES-NE0-SV40polyA。
上述乳腺特异性表达水牛PRL基因载体的构建方法，主要包括以下步骤
<1>提取水牛垂体总mRNA，经反转录后，采用特异性引物进行PCR扩增得到全长水牛PRL的cDNA序列，经胶回收纯化PCR产物后，将其TA克隆插入到pMD18T载体中，得到PMD18T-PRL 载体；
<2>以步骤<1>中得到的载体为模板，用加有酶切位点和His标签的引物进行PCR 扩增，得到水牛PRL基因的CDS片段，并将其TA克隆到pMD18T载体中，得到pMD18T_PRL/ His载体；
<3> 以 pMD18T 为载体骨架，依次酶切连入 Kpnl-BCNpolyA-SacI、BamHI-PRL/ His-KpnI, SalI-NotI-BCN-BamHI, SalI-cmv-EGFP-SV40polyA-NotI 或 Sal I-EF3 21-EGFP-1 RES-NE0-SV40polyA-NotI四个片段，得到载体一或载体二。
步骤<1> 引物为上游引物 5，-AGCCTAGGACGAGAGCTTC-3，，下游引物 5，-GGGGTACC GATTTTGACATCGCTACAGAGT-3‘；
步骤<2> 引物为上游引物 5，-CGGGATCCATGCACCATCATCATCATCATCTGGTGCCACGCGG TTCTACCCCCGTCTGTCCCAAT-3，，下游引物 5，-GGGGTACCGATTTTGACATCGCTACAGAGT-3，。
上述乳腺特异性表达水牛PRL基因载体在生产转基因动物中的应用。
采用原核注射法，将载体一或载体二转移到小鼠或水牛胚胎中，得到乳腺特异性表达水牛PRL蛋白的转基因小鼠或水牛。
SalI和PvuI酶切载体一，回收片段溶于TE溶液中，线性化载体质粒经稀释后注入到小鼠的受精卵原核中，再将受精卵移植入同期发情的代孕母鼠的输卵管处，待产出子鼠， 经鉴定得到转基因小鼠。
上述转基因动物在生产水牛PRL蛋白中的应用。
本发明利用β-酪蛋白启动子启动水牛PRL基因，构建了乳腺特异性表达水牛PRL 基因载体，并采用原核注射法，将乳腺特异性表达水牛PRL基因载体转入动物基因组中，使 PRL基因仅在乳腺中表达，建立乳腺特异性表达水牛PRL蛋白的转基因动物。通过对转水牛 PRL基因小鼠的分析检测，确定小鼠乳汁中表达水牛PRL蛋白，且水牛PRL基因的表达可以显著提高乳腺中β酪蛋白以及β-1，4-半乳糖甘转移酶的表达水平。本发明既保证了在乳腺中表达PRL基因，以增加转基因动物的产奶量，又避免了全身表达PRL基因对转基因动物的严重伤害；同时乳腺中表达的PRL蛋白随乳汁排出，可在奶水中纯化得到PRL蛋白，由于生产的PRL蛋白带有His标签，可为后期提纯PRL蛋白提供便利，节约成本。因此，应用本发明可望通过转PRL水牛的制备，获得有大量廉价的的PRL蛋白，并提高水牛的产奶量和乳液中的酪蛋白水平，产生巨大的经济效益和社会效益。
图1是本发明乳腺特异性表达水牛PRL基因载体图，图中双标为 cmv-EGFP-SV40polyA 或 EF321-EGFP-IRES-NE0-SV40polyA，BCN 为 β-酪蛋白启动子，PRL 为牛催乳素⑶S，polyA为β-酪蛋白3 ‘非翻译区。
图2是本发明乳腺特异性表达水牛PRL基因载体的构建路线图。
图3是水牛PRL基因⑶S序列PCR扩增片段电泳图。
图4是本发明乳腺特异性表达水牛PRL基因载体一瞬时转染Bcap37细胞系4 后荧光检测图，图中A为常光，B为荧光。
图5是瞬时转染Bcap37细胞系后RT-PCR检测电泳图，图中3. 8kb和5. 2kb分别是由不同长度的BCN启动子构建的质粒。4
图6是FO代转PRL基因小鼠尾尖基因组DNA PCR检测电泳图，图中1为阴性对照，18道为阳性对照。
图7是转PRL基因母鼠乳汁中PRL浓度Elisa检测中的标准曲线图。
图8是乳腺特异性表达PRL基因对泌乳相关基因表达水平的QRT-PCR检测图。
具体实施方式
一、实验材料和方法
所用载体、细胞系和试剂来源pMD18T载体(购自Takara公司)， PHC79-EF321-EGF P-IRES-NE0 由中国农大提供，pMD18T-BCNpolyA、pMD18T_BCN为发明人自行制备。引物合成以及序列测定由华大基因有限公司完成，Taq酶、T4DNA连接酶、内切酶、 QPT-PCR相关试剂均购自Takara公司，小提质粒以及胶回收试剂盒购自TIANGEN公司，去内毒小提质粒试剂盒购自OMEGA公司，细胞转染以及胞质内注射用外源基因胶回收试剂盒购自QIAGEN公司，细胞转染作用的Bcap37细胞系为申请人保存，体细胞克隆所用试剂均来自 Sigma公司，Western Blot所用抗体来自康为公司，牛PRL Elisa检测试剂盒购自Cusabio 公司。
所用基因组提取、总RNA提取、总蛋白提取、PCR扩增、反转录、酶切、胶回收、连接、 转化、质粒提取、脂质体转染法、显微注射法、精子介导法、Western Blot、Southe rnBlot, Elisa、QRT-PCR等实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》(2000年，科学出版社)或相应的试剂盒说明书。转基因小鼠的生产由广州赛业公司代理。
二、乳腺特异性表达水牛PRL基因载体的构建
如图1和图2所示，根据NCBI上公布的牛PRL的mRNA序列(NM_173953. 2)设计合成的特异性引物，上游引物5’ -AGCCTAGGACGAGAGCTTC-3，(见序列表SEQ. ID. No. 2的碱基序列)，下游引物 5，-GGGGTACCGATTTTGACATCGCTACAGAGT-3，(见序列表 SEQ. ID. No. 3 的碱基序列)。从屠宰场取新鲜的水牛垂体组织，保存于液氮中运回到实验室。采用Trizol 试剂提取总RNA，电泳检测总RNA质量后进行反转录反应。取2uL反转产物为模板，用上述引物进行 PCR扩增，扩增条件:94°C,30sec ；61°C，30sec ；72°C，55sec ；共 35 个循环。1. 5% 的琼脂糖电泳检测到901bp的特异性片段(见序列表SEQ. ID. No. 1的碱基序列)，将该片段进行胶回收后TA克隆到pMD18T载体中，得到pMD18T-PRL载体并进行测序。
以pMD18T-PRL载体为模板，用加有酶切位点和His标签的引物扩增得到PRL的 CDS 区。上游引物 5’ -CGGGATCCATGCACCATCATCATCATCATCTGGTGCCACGCGGTTCTACCCCCGTCTG TCCCAAT-3，(见序列表 SEQ. ID. No. 5 的碱基序列)；下游引物 5，-GGGGTACCGATTTTGACATCGC TACAGAGT-3，(见序列表 SEQ. ID. No. 6 的碱基序列)。扩增条件:94 V，30sec ；61°C，30sec ； 72°C，5kec;共35个循环。1. 5%的琼脂糖电泳检测到804bp的特异性片段(见图3，见序列表SEQ. ID. No. 4的碱基序列)，将该片段进行胶回收后TA克隆插入到pMD18T载体中，得到pMD18T-PRL/His载体并测序。
将事先制备的p-BCNpolyA载体和环状的pMD18T载体用McI和KpnI酶切连接，转化DH5 α菌，筛选出阳性克隆，得到pMDIST-BCNpolyA载体；将该载体与上述pMD18T-PRL/His载体用BamHI和KpnI酶切连接，转入DH5 α中筛选出阳性克隆， 得到pMD18T-PRL-BCNpolyA载体；将该载体与事先制备的p-BCN载体用BamHI和Sal酶切连接，转入DH5 α中筛选出阳性克隆，得到pMD18T-BCN-PRL-BCNpolyA载体；将该载体分别与事先制备的p-BCNcmV-EGFP-SV40pOlyA载体和经过酶切位点改造的 pEF321-EGFP-IRES-NE0-SV40polyA载体用NotI和Sal酶切连接，转入DH5 α中筛选出阳性克隆,得到供原核注射的 pMD18T-BCN-PRL/His-BCNpolyA-cmv-EGFP-SV40poIyA 载体(载体一)和可供筛选的 pMD18T-BCN-PRL/His-BCNpolyA-EF321-EGFP-IRES-NE0-SV40polyA 载体 (载体二)。
三、细胞水平上检测乳腺特异性表达水牛PRL基因载体
将pMD18T-BCN-PRL/Hi s-BCNpolyA-cmv-EGFP-SV40poIyA 载体用 Lipo2000 脂质体转染法，转染Bcap37细胞系。如图4所示，4 后观察荧光，可见绿色荧光表达，收集细胞提取总RNA和总蛋白。总RNA经反转录后，PCR方法检测PRL基因的表达情况，检测引物 上游引物 5，-ACCCCCGTCTGTCCCAAT-3，；下游引物 5，-GATTTTGACATCGCTACAGAGT-3，。扩增条件:94°C,30sec ；6rC,30sec ；72°C,55sec ；共35个循环。1. 5%的琼脂糖电泳检测证明 (如图5所示，将Bcap37细胞系分为四组，用脂质体2000分别转染这3. 81ABCN启动的PRL 载体、5. 21ABCN启动的PRL载体、EGFP-Nl载体以及空白对照(只加脂质体2000)；图中A 显示，3. 81ABCN启动子与5. 21Λ启动子启动的水牛PRL两个载体RT-PCR扩增得到与相应质粒PCR扩增相同的804bp的PRL阳性片段，而EGFP-Nl以及空白对照则没有扩增得到阳性片段；图中B显示，四组细胞均可扩增得到190bp的β -action内参基因的阳性片段)，BCN 可启动PRL基因在Bcap37中转录。总蛋白进行^festern Blot检测，一抗为小鼠抗6XHis 蛋白抗体，二抗为羊抗鼠抗体，检测结果呈阳性。以上结果表明，BCN启动子可在Bcap37细胞系中启动PRL/His的表达。
四、乳腺特异性表达水牛PRL蛋白转基因小鼠的生产与检测
采用去内毒素质粒提取试剂盒提取pMD18T-BCN-PRL/ His-BCNpolyA-cmv-EGFP-SV40polyA质粒，用SalI和PvuI双酶切该质粒，进行胶回收，回收片段溶于TE溶液中。线性化质粒载体稀释后注入到小鼠的受精卵原核中，将受精卵移植入同期发情的代孕母鼠的输卵管处，待产出子鼠。取产出的子鼠尾尖组织，提基因组DNA后进行PCR检测，得到8只阳性小鼠(如图6所示，2、3、7、9、10、12、14和15道)。将经鉴定得到的转基因小鼠进行EGFP荧光检测，发射光525nm，激发光488nm，添加了荧光背景滤光片425nm，曝光时间为^ec,其中4只小鼠中检测明显的绿色荧光，1只检测到微弱的绿色荧光，3只未检测绿色荧光。
将FO代转基因小鼠与野生型小鼠交配，得到Fl代转基因小鼠。提取其尾尖组织基因组DNA进行PCR检测筛选，为避免假阳性，选择两对引物进行扩增，电泳检测均为阳性的小鼠留种传代。
将哺乳期转PRL基因母鼠与仔鼠隔离4小时后，腹腔注射0. 3IU的缩宫素，IOmin 后腹腔注射速眠新麻醉小鼠，用蘸有温水的棉球轻敷乳头周围后采奶。将采集到的奶水按 1 10的体积加ddH20稀释后，4°C 5000g离心lOmin，取中间溶液层做狗8丨6111 Blot检测。 一抗为小鼠抗6XHis蛋白抗体，二抗为羊抗鼠抗体，检测结果呈阳性。由此证明，BCN启动子可在活体小鼠乳腺中启动PRL/His的表达，并在奶水中检测到PRL/His蛋白。
五、转基因小鼠奶水中水牛PRL蛋白浓度检测
将产仔第十天的母鼠与仔鼠隔离4小时后，腹腔注射0. 3IU的缩宫素，IOmin后腹腔注射速眠新麻醉小鼠，用蘸有温水的棉球轻敷乳头周围后采奶。将采集到的奶水按 1 10的体积加ddH20稀释后，4°C 5000g离心lOmin，取中间溶液层用作水牛PRL Elisa 检测。如图7所示，将标准品组数据做拟合曲线分析，y = 51091Xe(-6 1022x), R2 = 0.9991， 计算得到小鼠奶水中水牛PRL的平均浓度为56. 71ng/ml，个体最高浓度为104. 8ng/ml。
六、乳腺特异性表达PRL基因对泌乳相关基因表达的影响
提取产仔第十天的母鼠的乳腺组织总RNA，反转录后，用去离子水稀释到lOOng/μΙ左右，作为实时定量的模板。检测引物乳脂合成相关基因——乙酰辅酶A羧化酶ACACA的上游引物5’ -GAGGAGAACATCAAATACATCAG-3’，下游引物 5，-ATCCTTACAACTTCT GCTCG-3，；乳糖合成相关基因——β -1,4-半乳糖基转移酶B4galtl 的上游引物5，-CGGCATTCAAGAGACAAGA-3，，下游引物5，-CGCATCGTTTCCTTTGTA-3，； 乳蛋白相关基因——β酪蛋白CSN2的上游引物5，-TAGCACCCTTCCTTCCAC-3，，下游引物5，-GTACATTTCCAGTTTCAGTCAG-3，；PRL 的上游引物5，-GCTGCCATACCTCCTCC, 下游引物5，-GGTGACTAGGTGATACAGAGG-3，；内参基因β-actin的上游引物 5，-CATCCGTAAAGACCTCTATGC-3，，下游引物 5，-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3，。扩增条件 95°C,20sec ；60°C,20sec ；72°C,30sec ；共40个循环。实验结果表明(见图8，小鼠分为四组第一组为奶水中检测到PRL蛋白，紫外灯下见绿色荧光，尾尖组织基因组检测PRL与 EGFP基因为阳性的转PRL基因小鼠；第二组为奶水中未检测到PRL蛋白，紫外灯下见绿色荧光，尾尖组织基因组检测PRL与EGFP基因为阳性的转PRL基因小鼠；第三组为奶水中未检测到PRL蛋白，紫外灯下未见绿色荧光，尾尖组织基因组检测PRL与EGFP基因为阳性的转PRL基因小鼠；第四组为非转基因小鼠。取以上四组泌乳第10天母鼠乳腺，QRT-PCR检测 ACACA、B4galtl、CSN2、PRL基因的表达水平，结果显示PRL基因表达的小鼠乳腺中B4galtl 和CSN2基因的表达水平较其他组显著提高，其中CSN2基因的表达水平极显著提高)，与对照组相比，水牛PRL基因的表达显著提高了乳糖合成相关基因和乳蛋白中β酪蛋白基因的表达水平，而对乳脂相关基因的表达无显著影响。
权利要求
1.一种乳腺特异性表达水牛PRL基因载体，其特征在于该载体是载体一 pMDIST-BCN-PRL/Hi s-BCNpo IyA-Cmv-EGFP-SV4OpolyA,或载体二 pMD18T-BCN-raL/His-BCNpolyA-EF32l-EGFP-IRES-NE0-SV40polyA。
2.根据权利要求1所述乳腺特异性表达水牛PRL基因载体的构建方法，其特征在于主要包括以下步骤<1>提取水牛垂体总mRNA，经反转录后，采用特异性引物进行PCR扩增得到全长水牛PRL的cDNA序列，经胶回收纯化PCR产物后，将其TA克隆插入到pMD18T载体中，得到 PMD18T-PRL 载体；<2>以步骤<1>中得到的载体为模板，用加有酶切位点和His标签的引物进行PCR扩增，得到水牛PRL基因的CDS片段，并将其TA克隆到pMD18T载体中，得到pMD18T_PRL/His 载体；<3> 以 pMD18T 为载体骨架，依次酶切连入 Kpnl-BCNpolyA-SacI、BamHI-raL/His-KpnI、 SalI-NotI-BCN-BamHI、SalI-cmv-EGFP-SV40polyA-NotI 或 SalI-EF321-EGFP-IRES-NE0_S V40polyA-NotI四个片段，得到所述载体一或载体二。
3.根据权利要求2所述乳腺特异性表达水牛PRL基因载体的构建方法，其特征在于 步骤<1>所述引物为上游引物5，-AGCCTAGGACGAGAGCTTC-3，，下游引物5，-GGGGTACCGATT TTGACATCGCTACAGAGT-3 ‘；步骤 <2> 所述引物为上游引物 5，-CGGGATCCATGCACCATCATCATCATCATCTGGTGCCACGCGG TTCTACCCCCGTCTGTCCCAAT-3，，下游引物 5，-GGGGTACCGATTTTGACATCGCTACAGAGT-3，。
4.根据权利要求1所述乳腺特异性表达水牛PRL基因载体在生产转基因动物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于采用原核注射法，将所述载体一或载体二转移到小鼠或水牛胚胎中，得到乳腺特异性表达水牛PRL蛋白的转基因小鼠或水牛。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于Aall和PvuI酶切所述载体一，回收片段溶于TE溶液中，线性化载体质粒经稀释后注入到小鼠的受精卵原核中，再将受精卵移植入同期发情的代孕母鼠的输卵管处，待产出子鼠，经鉴定得到所述转基因小鼠。
7.根据权利要求4所述转基因动物在生产水牛PRL蛋白中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种乳腺特异性表达水牛PRL基因载体、构建及其应用，利用β-酪蛋白启动子启动水牛PRL基因，构建了乳腺特异性表达水牛PRL基因载体，并将该载体转入动物基因组中获得乳腺特异性表达水牛PRL蛋白的转基因动物，其乳汁特异性表达水牛PRL蛋白，且水牛PRL基因的表达可以显著提高乳腺中β酪蛋白以及β-1,4-半乳糖甘转移酶的表达水平。因此，应用本发明可望通过转PRL水牛的制备，获得有大量廉价的的PRL蛋白，并提高水牛的产奶量和乳液中的酪蛋白水平，产生巨大的经济效益和社会效益。
文档编号C07K14/575GK102492722SQ20111040087
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月6日 优先权日2011年12月6日
发明者任艳萍, 刘庆友, 李湘萍, 石德顺, 陆凤花 申请人:广西大学