专利名称：一种单聚乙二醇化定点修饰胸腺五肽的合成方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种单聚乙二醇化定点修饰胸腺五肽的合成方法。
背景技术：
胸腺五肽(Thymopentin, TP5 )是人工合成小分子多肽，其氨基酸序列为 Arg-Lys-Asp-Val-Tyr，与内源性的胸腺生成素II具有相同的调节机体免疫平衡的生物活性。对于多种免疫功能紊乱或低下，TP5都能通过促进或抑制的双向调节作用使免疫功能趋于正常。目前，临床上用于治疗肿瘤、自身免疫疾病等。但是TP5注射于人体后很快由蛋白酶和氨肽酶降解，药物原型的半衰期仅为30秒。目前临床应用的仅有冻干粉针剂和溶液型注射剂，因此，对于需要长期用药患者，TP5只能采取频繁注射或静脉滴注的方式给药。 因此迫切需要研制新的长效制剂产品。聚乙二醇(PEG)是一种高分子聚合物，无毒，无免疫原性，很容易经肾排出体外。药物的聚乙二醇修饰，即PEG化是将活化的聚乙二醇通过化学方法偶联到蛋白质、多肽、小分子有机药物和脂质体上，从而提高药物在血浆中的稳定性，减少药物的酶解，降低药物的免疫原性，使母体药物在输送、疗效和体内半衰期等方面都有显著改善，从而提高其临床价值和商业价值。蛋白质或多肽分子中存在多个氨基，随机修饰方法对某些蛋白质多肽药物的改善并不能达到预期的效果，修饰后成分复杂、分离困难、药物活性大大下降、有效成分少等。通过定点修饰的方式，PEG修饰剂可以避免随机修饰的盲目性，这样既不影响蛋白质多肽活性中心结构又能选择性干扰某些抗原位点，从而达到特定的修饰目的。采用定点修饰方式所得目标修饰产物一般具备修饰度(即每个偶合物上平均偶联PEG分子的个数)明显降低、产物种类减少、活性保留较好、免疫原性大大降低等特点，同时又便于分离纯化。中国专利CNlO 1870732A公开了一种采用固-液结合法进行单聚乙二醇化胸腺五肽合成方法，该方法先采用液相将PEG(5000da)修饰剂定点修饰到胸腺五肽2位赖氨酸的侧链氨基(ε_ΝΗ2)上得到Lys(PEG)，再经过固相四步缩合反应切割得到 mPEG(5000da)-TP5，改善了原母体药物胸腺五肽的生物降解速度快、酶解稳定性差、生物半衰期短等缺点。但是，该方法的反应要在先已缩合的Lys(PEG)高分子的wang树脂上进行， 反复缩合脱除Fmoc等操作。由于wang树脂作为载体高分子和PEG(5000da)高分子之间的空间位阻过大，而脱除Fmoc与空间位阻有关，反应条件受空间位阻条件的限制，因此脱 Fmoc保护不但受到wang树脂载体的空间位阻而且还有PEG(5000da)高分子的空间位阻的限制，导致脱除FMOC单元很难进行。同时，在固相wang树脂上和PEG高分子之间进行下一步单元的氨基酸缩合反应也很难进行，合成单元要反复操作，导致了原料的大量浪费，得到 PEG化胸腺五肽的产率也只有1
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种反应容易、成本低、产率高的合成单聚乙二醇化定点修饰胸腺五肽的方法。本发明合成单聚乙二醇化定点修饰胸腺五肽的方法，包括以下工艺步骤 (1)固相合成带保护基的胸腺五肽
将经二氯甲烷处理的Fmoc-Tyr (tBu)-Wang树脂用N，N-二甲基甲酰胺洗涤后，用含哌啶的二甲基甲酰胺溶液脱Fmoc保护基，得到脱保护的树脂Tyr(tBU)-Wang ；将氨基酸 Fmoc-Val-OH、苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯、羟基苯并三唑依次溶解于 DMF，加二异丙基乙胺启动活化酯后，加入到上述脱保护的树脂Tyr(tBU)-Wang中；在氩气保护下，室温搅拌反应4(Γ90分钟，抽滤、洗涤，至此一个循环完成，得到Fmoc保护的二肽树脂；顺次改变上述氨基酸为 Fmoc-Asp (OBzl) -OH, Fmoc-Lys (BOC) -OH, Z-Arg (NO2) -0Η,重复上述步骤 3 次，得到含保护基的 Z-Arg(NO2)-Iys (Boc) -Asp (oBzl)-Val-Tyr (tBu)树脂； 用二氯甲烷、甲醇交替洗涤，抽干后，加入切割试剂，于(T5°C反应3飞小时，收集切割剂，旋干，用(T5°C的冷乙醚沉淀粗肽，除去乙醚后，用体积浓度1(Γ20%冰醋酸水溶液溶解粗肽， 冷冻干燥，纯化，得到带保护基的胸腺五肽Z-Arg (NO2) -Iys-Asp (oBzl) -Val-Tyr。所述含哌啶的二甲基甲酰胺溶液中，哌啶与二甲基甲酰胺的体积比为1:0. 5 1:4。所述氨基酸的用量为Fmoc-Tyr (tBu) -Wang树脂摩尔量的0. 5、倍。所述苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯的用量为氨基酸0. 5、倍。所述1-羟基苯并三唑的用量为氨基酸0. 5、倍。所述二异丙基乙胺用量为氨基酸的广3倍。所述切割试剂是由三氟乙酸、双蒸水、三异丙基硅烷以95:2. 5:2. 5的体积比组成的混合液；所述切割试剂的用量为5 30 ml / g Fmoc-Tyr (tBu)-Wang树脂。(2)液相合成聚乙二醇化胸腺五肽
以氯仿、二氧六环、DMF的混合溶液(氯仿、二氧六环、DMF以1:4:广4:8:1的体积比混合)为溶剂，在碱性条件下，使带保护基的胸腺五肽(Z-Arg (NO2) -Iys-Asp (oBzl) -Val-Tyr) 与单甲氧基聚乙二醇修饰剂(mPEG-SPA)以3:广20: 1的摩尔比，在室温反应M 48小时； 反应结束后，除去溶剂，反应产物用水溶解，过滤掉水不溶物，纯化，冷冻干燥得中间产物Z-Arg (NO2) -Iys (mPEG) -Asp (oBzl) -Val-Tyr。(3)钯碳催化氢化
以无水甲醇为溶剂，在钯碳的作用下，使中间产物Z-Arg (NO2) -Iys (mPEG) -Asp (oBzl)-Val-Ty在室温下催化氢化3 6小时，得到目标产物Arg-lys (mPEG) -Asp-Val-Tyr。所述钯碳与中间产物的质量比为1:0. 5 1:5。本发明合成的产物通过核磁共振氢谱、MALDI-T0F质谱、氨基酸N端测序，确定产物的结构为H-Arg-Lys (mPEG)-ASp-Val-Tyr-0H，说明目标产物合成成功。本发明相对现有技术具有以下优点
1、本发明先采用固相合成技术合成含保护基的TP5，避免了现有技术方法脱除FMOC单元操作难以进行的缺点；再采用液相合成技术将修饰化的聚乙二醇(mPEG-SPA)定点连接到赖氨酸侧链氨基上，一方面达到了定点修饰的目的，另一方面，液相环境避免了固相wang 树脂载体的空间位阻；最后钯碳催化氢化一步脱除所有的保护基得到具有长效作用的聚乙二醇化的胸腺五肽，合成过程简便，成本低，产率高(总产率为20%以上)，便于工业化生产。2、本发明合成的聚乙二醇化的胸腺五肽不易被体内蛋白酶水解，由于分子量大，可显著降低肾清除率，大大延长体内循环时间，从而达到显著延长半衰期、提高机体的生物利用度。3、本发明合成目标产物结构准确，合成路线成熟，稳定，该路线为更高分子量的 PEG以及分支型的PEG修饰提供新策略。
附图的说明
图1为本发明实施例1步骤(1)得到的带保护基的胸腺五肽的ESI-MS表征； 图2为本发明实施例1步骤(2)得到的聚乙二醇化胸腺五肽的结构表征； 图3、4为本发明实施例1步骤(3)得到的钯碳催化氢化产物的结构表征。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明合成单聚乙二醇化定点修饰胸腺五肽的方法作进一步说明。实施例1
(1)固相合成带保护基的胸腺五肽
A 将 Fmoc-Tyr (tBu)-Wang 树脂 1. 5g (1%DVB, 100-200 目，S=O. 3mmol/g)在二氯甲烷 (DCM)浸泡30分钟，抽干，二甲基甲酰胺(DMF)洗涤(洗三次，每次三分钟)后；将哌啶与二甲基甲酰胺(DMF)的混合溶液(哌啶/ 二甲基甲酰胺=1/4 (ν/ν))加入到上述洗涤后的树脂中，机械搅拌30分钟，脱Fmoc保护基，DMF洗涤(洗三次，每次三分钟)，得到脱保护的树脂 Tyr (tBu) -Wango加入茚检试剂(5%茚三酮醇溶液)，沸水中加热三分钟，显蓝色，Fmoc基脱除完全。B 将氨基酸 FMOC-Val-OH 458mg (1. 35mmol,3eq))、苯并三氮唑-N, N，N，，N，-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU) 512. 06mg(l. 35mmol, 3eq) ,1-羟基苯并三唑(HoBt) 182. 66mg(l. 35mmol, 3eq)、依次溶解于DMF，加446 μ L 二异丙基乙胺(DIEA)启动活化酯后， 加入到上述脱保护的树脂Tyr(tBU)-Wang中；反应体系用氩气保护，机械搅拌45分钟，抽干，DMF溶液洗三次，每次三分钟；茚检试剂检测无色，得到FMOC-Val-Tyr (tBu) -Wang 二肽树脂，至此一个循环完成。将FMOC-Val-Tyr (tBu) -Wang 二肽树脂用同样的方法脱Fmoc保护基，得到脱保护的 Val-Tyr (tBu)-Wang 树脂；将 FMOC-Asp (0 1)-OH 601. 4mg(l. 35mmol, 3eq)、苯并三氮唑-N，N，N，，N，-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU) 512. 06mg (1. ;35mmol，!3eq)、1-羟基苯并三唑(HoBt) 182. 66mg(l. 35mmol, 3eq)依次溶解于DMF，加446 μ L 二异丙基乙胺 (DIEA)启动活化酯后，加入到脱保护的Val -Tyr (tBu) -Wang树脂中，反应体系用氩气保护，机械搅拌45分钟，抽干，DMF溶液洗三次，每次三分钟；茚检试剂检测无色，得到FMOC-Asp (oBzl) -Val-Tyr (tBu) -Wang三肽树脂，至此两个循环完成。将FMOC- Asp (oBzl) -Val-Tyr (tBu) -Wang 三肽树脂用同样的方法脱 Fmoc 保护基，得到脱保护的 Asp (oBzl) -Val-Tyr (tBu) -Wang 三肽树脂；将 FMOC-Lys (BOC) -OH 633mg(l. 35mmol, 3eq)、苯并三氮唑_N，N，N，，N，-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU) 512. 06mg(l. ;35mmol，!3eq)、1-羟基苯并三唑(HoBt) 182. 66mg(1. ;35mmol，!3eq)、 依次溶解于DMF，加446yL 二异丙基乙胺(DIEA)启动活化酯后，加入到脱保护的Asp (oBzl) -Val-Tyr (tBu) -Wang三肽树脂中，反应体系用氩气保护，机械搅拌45分钟，抽干，DMF溶液洗三次，每次三分钟；茚检试剂检测无色，得到FMOC-Iys (Boc) -Asp (oBzl)-Val-Tyr (tBu)四肽树脂，至此三个循环完成。将FMOC-Iys (Boc) -Asp (oBzl)-Val-Tyr (tBu)四肽树脂用同样的方法脱Fmoc保护基，得到脱保护的Iys (Boc) -Asp (oBzl) -Val-Tyr (tBu)四肽树脂；将 Z-Arg(NO2)-OH 477mg(1. ；35讓ol，!3eq)、苯并三氮唑-N，N，N，，N，-四甲基脲六氟磷酸酯 (HBTU) 512. 06mg(l. 35mmol, 3eq) ,1-羟基苯并三唑(HoBt) 182. 66mg(l. 35mmol, 3eq) 依次溶解于DMF，加446 μ L 二异丙基乙胺(DIEA)启动活化酯后，加入到脱保护的Iys (Boc) -Asp (oBzl) -Val-Tyr (tBu)四肽树脂中，反应体系用氩气保护，机械搅拌45分钟，抽干，DMF溶液洗三次，每次三分钟；茚检试剂检测无色，得到Z-Arg (NO2) -Iys (Boc) -Asp (oBzl) -Val-Tyr (tBu)五肽树脂，用二氯甲烷、甲醇交替洗涤，抽干后，加入15ml 切割试剂(三氟乙酸(TFA)双蒸水三异丙基硅烷=95:2. 5 :2.5(v/v))，冰浴反应4小时， 每20分钟机械搅拌1分钟；收集切割剂，再用TFA洗涤2次，合并切割剂与TFA，减压旋转抽干，用冰乙醚(4(T60ml)沉淀，静置，吸走上清，加20%冰醋酸水溶液溶解，冻干，用葡聚糖凝胶柱粗处理(葡聚糖凝胶的规格为G25)，再用半制备高效液相进行纯化(液相体系为5% 95%乙腈/水/0. 三氟乙酸，流速为anl/min，时间为60min)，53% ACN出峰，Rt 23.79 min收集主峰，冻干，得到带保护基的胸腺五肽Z-Arg (NO2)-Iys-Asp (oBzl)-Val-Tyr纯品 253. 2mg，产率 59.35%。ESI-MS 表征为=ESI-MS[ M + H ] +949.6 (见图 1)。固相合成路线如下所示
权利要求
1.一种单聚乙二醇化定点修饰胸腺五肽的合成方法，包括以下工艺步骤(1)固相合成带保护基的胸腺五肽将经二氯甲烷处理的Fmoc-Tyr (tBu)-Wang树脂用N，N-二甲基甲酰胺洗涤后，用含哌啶的二甲基甲酰胺溶液脱Fmoc保护基，得到脱保护的树脂Tyr(tBU)-Wang ；将氨基酸 Fmoc-Val-OH、苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯、羟基苯并三唑依次溶解于 DMF，加二异丙基乙胺启动活化酯后，加入到上述脱保护的树脂Tyr(tBU)-Wang中；在氩气保护下，室温搅拌反应4(Γ90分钟，抽滤、洗涤，至此一个循环完成，得到Fmoc保护的二肽树脂；顺次改变上述氨基酸为 Fmoc-Asp(OBzl)-OH, Fmoc-Lys (BOC) -OH, Z-Arg (NO2)-0Η，重复上述步骤 3 次，得到含保护基的 Z-Arg(NO2)-Iys (Boc) -Asp (oBzl)-Val-Tyr (tBu)树脂； 用二氯甲烷、甲醇交替洗涤，抽干后，加入切割试剂，于(T5°C反应3飞小时，收集切割剂，旋干，用(T5°C的冷乙醚沉淀粗肽，除去乙醚后，用体积浓度1(Γ20%冰醋酸水溶液溶解粗肽， 冷冻干燥，纯化，得到带保护基的胸腺五肽Z-Arg (NO2) -Iys-Asp (oBzl) -Val-Tyr ；(2)液相合成聚乙二醇化胸腺五肽以氯仿、二氧六环、DMF的混合溶液为溶剂，在碱性条件下，使带保护基的胸腺五肽(Z-A rg (NO2) -Iys-Asp (oBzl) -Val-Tyr )与单甲氧基聚乙二醇修饰剂(mPEG-SPA)以 3 Γ20 1 的摩尔比，在室温反应对 48小时；反应结束后，除去溶剂，反应产物用水溶解，过滤掉水不溶物，纯化，冷冻干燥得中间产物 Z-Arg (NO2) -Iys (mPEG) -Asp (oBzl) -Val-Tyr ；(3)钯碳催化氢化以无水甲醇为溶剂，在钯碳作用下，使中间产物Z-Arg (NO2) -Iys (mPEG) -Asp (oBzl) -Va I-Ty在室温下催化氢化3 6小时，得到目标产物Arg-lys (mPEG) -Asp-Val-Tyr。
2.如权利要求1所述单聚乙二醇化定点修饰胸腺五肽的合成方法，步骤(1)中所述含哌啶的二甲基甲酰胺溶液中，哌啶与二甲基甲酰胺的体积比为1:0. 5 1:4。
3.如权利要求1所述单聚乙二醇化定点修饰胸腺五肽的合成方法，其特征在于步骤 (1)中所述氨基酸的用量为Fmoc-Tyr (tBu)-Wang树脂摩尔量的0. 5、倍。
4.如权利要求1所述单聚乙二醇化定点修饰胸腺五肽的合成方法，其特征在于步骤 (1)中所述苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸酯的用量为氨基酸0. 5、倍。
5.如权利要求1所述单聚乙二醇化定点修饰胸腺五肽的合成方法，其特征在于步骤 (1)中所述1-羟基苯并三唑的用量为氨基酸0. 5、倍。
6.如权利要求1所述单聚乙二醇化定点修饰胸腺五肽的合成方法，其特征在于步骤 (1)中所述二异丙基乙胺用量为氨基酸的广3倍。
7.如权利要求1所述单聚乙二醇化定点修饰胸腺五肽的合成方法，其特征在于步骤 (1)中所述切割试剂是由三氟乙酸、双蒸水、三异丙基硅烷以95:2. 5:2. 5的体积比组成的混合液。
8.如权利要求1所述单聚乙二醇化定点修饰胸腺五肽的合成方法，其特征在于步骤(1)中所述切割试剂的用量为5 30ml / g Fmoc-Tyr (tBu)-Wang树脂。
9.如权利要求1所述单聚乙二醇化定点修饰胸腺五肽的合成方法，其特征在于步骤(2)中所述氯仿、二氧六环、DMF的混合溶液中，氯仿、二氧六环、DMF以1:4:广4:8:1的体积比混合。
10.如权利要求1所述单聚乙二醇化定点修饰胸腺五肽的合成方法，其特征在于步骤(3)中，所述钯碳与中间产物的质量比为1:0. 5 1:5。
全文摘要
本发明提供了一种单聚乙二醇化定点修饰胸腺五肽的合成方法，属于生物医药领域。该方法先采用固相合成含保护基的TP5，避免了现有技术方法脱除FMOC单元操作难以进行的缺点；再在液相中将修饰化的聚乙二醇定点连接到赖氨酸侧链氨基上，达到了定点修饰的目的，同时液相环境避免了固相wang树脂载体的空间位阻；最后钯碳催化氢化一步脱除所有的保护基得到具有长效作用的聚乙二醇化的胸腺五肽，合成过程简便，成本低，产率高(总产率为20%以上)，便于工业化生产。本发明合成的聚乙二醇化的胸腺五肽不易被体内蛋白酶水解，由于分子量大，可显著降低肾清除率，大大延长体内循环时间，从而达到显著延长半衰期、提高机体的生物利用度。
文档编号C07K1/02GK102443049SQ201110400168
公开日2012年5月9日 申请日期2011年12月6日 优先权日2011年12月6日
发明者倪京满, 史敏, 王锐 申请人:倪京满, 王锐