专利名称：自然偶联法制备艾塞那肽的方法
技术领域：
本发明涉及一种多肽药物的制备方法，尤其涉及自然偶联法制备艾塞那肽的方法。
背景技术：
艾塞那肽，英文名为exenatide，其分子结构为 His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-S er-Asp-Leu-Ser-LyS-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-IIe-Glu-Trp-Leu-Ly s-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2。艾塞那肽是由美国礼来公司与Amylin公司共同研发的第一个肠降血糖素类似物，是人工合成的由39个氨基酸组成的多肽，与内源性肠降血糖素如胰高血糖素样肽-1 (GLP-I)作用相似，具有促进葡萄糖依赖的胰岛素分泌，恢复第一时相胰岛素分泌，抑制胰高血糖素的分泌，减慢胃内容物的排空，改善胰腺β细胞的功能等作用。现有技术US69M^4、US7157555、US6902744中，艾塞那肽的制备均采用固相合成的方法。此种方法由于艾塞那肽是含有39个氨基酸的长肽，存在技术难度大、合成周期长、 生产成本高、过程中间体因为不能纯化带来的产物纯度不高，不利于大规模生产等问题。W02011006644A2专利中报道了采用固液结合的方法进行艾塞那肽的合成。将艾塞那肽分为1-10、11-21、22-四、30-39四个片段，固相方法分别合成出每个全保护肽片段，然后将几个片段在液相中偶联得到艾塞那肽。这种方法由于每个片段都是全保护肽，因此存在疏水性强、肽链溶解性差、片段纯化困难、片段间偶联效率低下等问题。艾塞那肽的现有合成方法存在操作繁琐，合成周期长，废液多，不利于环保，成本高昂以及不利于大规模生产的缺点。
发明内容
1)将艾塞那肽分成M条肽片段，M = 2或3 ；其中有L条N端为Thr或Ser肽片段， L = 1或2，T条构成艾塞那肽所需的其他肽片段，L+T = M ；用固相合成方法获得所述的M 条侧链全保护的肽片段；2)将偶联于步骤1) N端为Thr或kr肽片段N端的肽片段C端形成乙缩醛结构； 脱除侧链保护基团，形成肽片段C端乙缩醛结构；3)脱除N端为Thr或Ser肽片段的侧链保护基团和N段保护基团，得N端为Thr 或Ser肽片段；4)利用步骤2)所述的肽片段C端乙缩醛结构以及步骤3)所述的N端为Thr或 Ser肽片段在液相中偶联得到N端保护的艾塞那肽；5)除去N端氨基保护基，纯化处理得艾塞那肽。作为本发明的进一步改进，所述步骤1)所述固相合成方法，所使用的树脂为氨基树脂或2-CTC树脂，其中氨基树脂适用于含有艾塞那肽C端酰胺结构的固相合成，氨基树脂包括 Sieber 树脂、Rink Amide 树脂或 Rink Amide-MBHA 树脂。
2-CTC树脂适用于C端为羧基结构的肽片段固相合成。在片段肽合成过程中需要在弱酸情况下将肽链片段从树脂裂解下来而不影响氨基酸侧链保护基团。而这些侧链保护基团在C端的羧基结构转化为乙缩醛结构以前是必须存在的，用来保证乙酸醛结构产生在C端羧基而不是在侧链羧基上。申请人意外的发现， 2-CTC树脂能够满足该合成反应的要求。作为本发明的进一步改进，所述步骤1)中，参与片段偶联的Thr或Ser使用氨基保护基团，氨基保护基团为Boc。作为本发明的进一步改进，所述步骤将1)中，将肽片段从树脂上裂解下来所用的弱酸为TFE。作为本发明的进一步改进，所述步骤2)中，肽片段C端形成乙缩醛结构，所使用的醛为水杨醛。作为本发明的进一步改进，所述步骤2)包括如下步骤2a)将偶联于步骤1)N端为Thr或Ser肽片段N端的肽片段C端形成乙缩醛结构； 其中，肽片段C端形成乙缩醛结构，所使用的醛为水杨醛。2b)采用酸裂解将所有片段的侧链保护基脱除，形成侧链未保护肽片段。其中，将保护基脱除的酸为TFA。作为本发明的进一步改进，所述步骤4)中，在液相中偶联得到N端保护的艾塞那肽，溶剂为吡啶/醋酸。本发明中M条肽片段选自以下肽片段结构SEQ ID No. 1 =His-Gly-Glu-Gly-OHSEQ ID No. 2 =Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-V al-Arg-Leu-Phe-IIe-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-OHSEQ ID No. 3 =Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2SEQ ID No. 4=His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-OHSEQ ID No. 5 =Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-L eu-Phe-IIe-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-OHSEQ ID No6 =Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Va I-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-OHSEQ ID No. 7 =Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2SEQ ID No. 8 =His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-OHSEQ ID No. 9 :Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-P he-IIe-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-OHSEQ ID No. 10 =Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-OHSEQ ID No. 11 =His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-OHSEQ ID No. 12 =Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-OHSEQ ID No. 13 =Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-OH
SEQ ID No. 14=Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2SEQ ID No. 15 =Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-IIe-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-N H2SEQ ID No. 16 =Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH20作为本发明的进一步改进，所述步骤5)中，除去N端氨基保护基，纯化处理得艾塞那肽；N端氨基保护基为Fmoc，采用DBLK脱除，所述DBLK由体积比为1 4的哌啶和DMF 组成。纯化处理为本领域常用的技术手段，必要时可以包括冻干。现有技术多肽液相片段偶联时，由于合成时选择性的问题，肽链片段的氨基酸侧链必须保护以防止偶联位点出现差错。由于片段的氨基酸侧链是需要保护的，肽片段溶解度很低；如果侧链不保护进行合成，必须是肽链含有Cys这个偶联位点，由于含有Cys的肽链相对较少，限制了技术的使用。艾塞那肽肽链中含有多fkr/Thr，本发明意外的发现，采用N端含有Ser或Thr的肽链可以在不保护侧链的情况下选择性的进行片段偶联，乙缩醛结构主要的作用在于保证片段偶联时的选择性。进行侧链不保护合成的优点在于，解决了片段的溶解、纯化等问题，提高了收率。并且对偶联时的效率有了极大的提高。与现有技术相比，本发明的有益效果是操作简单，合成周期短，成本低，中间体易纯化，后处理容易，副产物少，产品收率高，最终产品纯度高，利于艾塞那肽的大规模生产。
图1 本发明总的工艺流程图
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。氨基树脂和2-CTC树脂购自天津南开和成有限公司，各种保护氨基酸购自吉尔生化有限公司。说明书和权利要求书中所使用英文缩写的含义列于下表中说明书和权利要求书中所使用的缩写的含义列于下表中
权利要求
1.一种艾塞那肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤1)将艾塞那肽分成M条肽片段，M=2或3；其中有L条N端为Thr或Ser肽片段，L=I或 2，T条构成艾塞那肽所需的其他肽片段，L+T=M ；用固相合成方法获得所述的M条侧链全保护的肽片段；2)将偶联于步骤1)N端为Thr或Ser肽片段N端的肽片段C端形成乙缩醛结构；脱除侧链保护基团，形成肽片段C端乙缩醛结构；3)脱除N端为Thr或Ser肽片段的侧链保护基团和N段保护基团，得N端为Thr或kr 肽片段；4)利用步骤2)所述的肽片段C端乙缩醛结构以及步骤3)所述的N端为Thr或Ser肽片段在液相中偶联得到N端氨基保护的艾塞那肽；5)除去N端氨基保护基，纯化处理得艾塞那肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤1)所述固相合成方法，所使用的树脂为氨基树脂或2-CTC树脂，其中氨基树脂适用于含有艾塞那肽C端酰胺结构的固相合成，2-CTC树脂适用于C端为羧基结构的肽片段固相合成。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于氨基树脂包括Sieber树脂、Rink Amide 树脂或 Rink Amide-MBHA 树脂。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于参与片段偶联的Thr或Ser使用氨基保护基团，氨基保护基团为Boc。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于肽片段C端形成乙缩醛结构，所使用的醛为水杨醛。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤5)所述N端氨基保护基为 Fmoc，脱除试剂为DBLK。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于M条肽片段选自以下肽片段结构 SEQ ID No. 1 =His-Gly-Glu-Gly-OHSEQ ID No. 2 =Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-A rg-Leu-Phe-IIe-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-OH SEQ ID No. 3 =Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 SEQ ID No. 4 =His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-OHSEQ ID No. 5 =Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-P he-IIe-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-OHSEQ ID No6 =Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Ar g-Leu-Phe-IIe-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-OH SEQ ID No. 7 =Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 SEQ ID No. 8 =His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-OHSEQ ID No. 9 =Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-I Ie-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-OHSEQ ID No. 10 =Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-OHSEQ ID No. 11 =His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-OHSEQ ID No. 12 :Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-OHSEQ ID No. 13 :Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-OHSEQ ID No. 14 :Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2SEQ ID No. 15 Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2SEQ ID No. 16 :Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2 O
8.根据权利要求1或6所述的制备方法，其特征在于N端为Thr或Ser肽片段为SEQ ID No. 3或SEQ ID No. 12，构成艾塞那肽所需的其他肽片段SEQ ID No. 11。
全文摘要
本发明涉及了一种制备艾塞那肽的方法，包括以下步骤1)将艾塞那肽分成若干条肽片段，其中有N端为Thr或Ser肽片段以及构成艾塞那肽所需的其他肽片段，用固相合成方法获得；2)将偶联于步骤1)N端为Thr或Ser肽片段N端的肽片段C端形成乙缩醛结构；脱除侧链保护基团；3)脱除N端为Thr或Ser肽片段的侧链保护基团和N段保护基团；4)利用步骤2)所述的肽片段以及步骤3)所述肽片段在液相中偶联得到N端保护的艾塞那肽；5)除去N端氨基保护基，纯化处理得艾塞那肽；该工艺具有反应操作简单、中间体可控、反应周期短、收率高、成本低等特点，具有可观的经济实用价值和广泛的应用前景。
文档编号C07K1/06GK102532302SQ201110396050
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月2日 优先权日2011年12月2日
发明者刘建, 唐洋明, 宓鹏程, 袁建成, 马亚平 申请人:深圳翰宇药业股份有限公司