专利名称：一种富马酸生产分离方法
技术领域：
本发明属于生物化工领域，特别涉及一种富马酸的生产分离方法。
背景技术：
富马酸又名延胡索酸，学名反丁烯二酸。外观为白色、无气味的结晶粉末，有水果酸味，其酸味约为柠檬酸的1.5倍，可燃，在空气中稳定。富马酸是一种含有双键的二元羧酸，作为重要的有机化工原料和精细化工产品，广泛应用于食品及饲料添加剂、材料(树月旨、涂料及增塑剂等)、医药、化工等领域。同时富马酸还是一种重要的四碳平台化合物，可以通过氨化、水合、加氢及异构等工艺生产L-天冬氨酸、琥珀酸、1，4_ 丁二醇、马来酸等四碳化合物，因此被美国能源部列为优先发展的12种平台化合物之一。当前工业上主要采用顺酐(又称马来酸酐)异构法生产富马酸，其他可以用来生产富马酸的工艺还包括糠醛氧化法、马来酸酶催化异构法、石蜡发酵法(又称假丝酵母发酵法)以及生物质原料发酵法等。富马酸的生产方法中顺酐异构法、马来酸酶催化异构法及石蜡发酵法采用的原料均为石油基产品，随着石油的枯竭及油价的大幅上涨，这些工艺不符合当前可持续发展的要求，且产品的市场竞争力越来越差。糠醛氧化法的原料虽说可以来自生物质原料，但该工艺的产品收率低、催化剂毒性大，不符合当前绿色环保的时代要求。生物法生产富马酸可以极大缩减原材料成本，避免化学法合成富马酸所带来的环境污染问题；通过代谢调控、基因改造、酶工程等手段是提高生物法生产富马酸的产率重要思路。正是由于这些原因，使得以可再生生物质为原料发酵生产包括富马酸在内的各种平台化合物成为各国政府今后发展的重点方向之一。20世纪初期就开始了霉菌发酵产富马酸的研究工作，随着科学技术的进步，富马酸得率一度到了 30% -40%。富马酸的生物合成法具体包括酶催化转化法和微生物发酵法。20世纪90年代中期出现的酶催化转化法一般都是以马来酸为底物，在马来酸异构酶作用下制备富马酸，但原料马来酸供应不足，且价格昂贵。20世纪70年代石油危机的出现，使得人们加大了对微生物发酵法制备富马酸的研究力度，这一时期人们用来发酵制备富马酸的微生物有霉菌、 酵母及细菌。其中根霉菌Miizopus为重点研究的对象，具体包括米根霉lihizopusoryzae、 少根根霉Rhizopusarrhizus以及黑根霉Rhizopusnigricans等。在这一时期，我国科学家对微生物发酵法生产富马酸的研究工作也进行了一定的探索，其中山西微生物研究所的白照熙等筛选出了具有产富马酸能力的少根根霉，当振荡培养于含有12%葡萄糖的培养基时，富马酸产量为53. 15g/L，得率为45%，同时产生了较多的副产物如苹果酸等，但发酵周期较长，需要11天左右(食品与发酵工业，1988)。美国Purdue大学的Tsao教授等利用米根霉发酵产富马酸，98g/L初始葡萄糖发酵48h，其富马酸产量为338/1，得率为33.7% (Bioprocess Biosyst Eng,2002，25 179 181)。目前全世界富马酸的生产能力为34万t/a，其中我国富马酸年产量达到5万t左右，供求基本处于持平状态。富马酸的主要消费领域为不饱和聚Ra树脂、纸浆料助剂、食品、医药等领域。我国富马酸的应用范围小，用途单一，随着其应用领域的不断拓展，尤其作为一种平台化合物从它出发可以合成很多四碳化合物，在石油资源日益枯竭的情况下，其应用前景将越来越广阔。因此，迫切需要一种廉价，高效生产富马酸的方法。生物酶法具有产物浓度高、收率高、纯度高、副产物少和精制操作容易的优点，是一种较为有效的廉价生产富马酸的方法。本申请通过克隆表达富马酸酶，以L-苹果酸为原料，酶促反应催化脱水的方法通过体外酶法来制备富马酸，提供了一种廉价，高效生产富马酸的方法，具有产物浓度高、收率高、纯度高、副产物少和精制操作容易的优点。本发明优化了反应和分离条件，进一步提高了转化率和产品纯度。
发明内容
本发明是研究提供一种生物法生产富马酸的分离方法。前述方法采用一种以L-苹果酸为原料，酶促反应催化脱水的方法来制备富马酸。前述方法，其特征在于优化了反应和分离条件，提高了转化率和产品纯度。发明详述一种酶法生产分离富马酸的方法，包括在含有有机溶剂的体系中进行酶反应，通过富马酸酶转化苹果酸为富马酸，所述有机溶剂为乙二醇；所述乙二醇的浓度为50-70% ； 反应结束调节PH值为为1. 5-2. 5进行酸析，离心分离，得到沉淀富马酸。沉淀用水漂洗、离心，除去残留的溶剂和底物；50-70摄氏度干燥3-5个小时后得到富马酸。所述离心分离条件为10000-12000rpm离心5-10分钟；调节pH值用浓盐酸或浓硫酸。有机溶剂反应体系中lmL体系中含有，50%的乙二醇，50mMTris-HCl，lML-苹果酸，20 μ L6mg/mL的富马酸酶，pH值7. 8，70摄氏度反应3小时。所述苹果酸的转化率达到54. 7%。所述富马酸的摩尔收率可以达到27. 6%或以上。本发明中富马酸酶为耐热、耐有机溶剂的富马酸酶和本发明人自行开发酶制剂。本发明中富马酸酶采用分子生物学方法获得，具体如下用分子生物学方法在大肠杆菌中克隆、表达一个来自嗜热栖热菌(Thermus Thermophilus HB8)的富马酸酶。提取该菌基因组后，设计引物，利用PCR方法扩增富马酸酶基因，通过酶切、连接构建基于pET22b (+)的表达载体，并测定其序列如序列2所示，编码如序列1所示的氨基酸序列。用该表达载体转化大肠杆菌BL21(DE!3)后用IPTG诱导，培养 12小时，离心收集菌体，超声破碎细胞，离心后取上清。上清在70摄氏度水浴20分钟使杂质蛋白变性，再次离心，去除杂质蛋白。富马酸酶在弱碱性环境中具有较高酶活，在Tris-盐酸缓冲液pH7. 8中进行反应。 配制Iml反应体系，含有IOOmM Tris-HCl，IOOmM L-苹果酸，0. 5 μ 1富马酸酶，pH值控制在 7. 8。在50%和70%的乙二醇中超过40%的苹果酸转化为富马酸。较高浓度的甲醇和 90 %的乙二醇对酶活影响很大。通过研究富马酸酶的稳定性可以预计酶的使用时间，尽量延长酶的寿命，可以降低生产成本。分别研究了富马酸酶在50%和一70%的乙二醇中的稳定性，发现，70摄氏度保温48小时后，在50%乙二醇中酶活未有明显变化，而70%乙二醇使酶活有所降低。
优化的反应体系为在Iml体积中有，50%的乙二醇，50mM Tris_HCl，lM L-苹果酸，20 μ 1富马酸酶，PH值控制在7. 8。70摄氏度反应3小时后，有7%的苹果酸转化为富马酸。调节PH值为2，酸析沉淀得到富马酸。离心后，沉淀用少量水漂洗两次，除去残留的溶剂和底物。60°C干燥后得到富马酸。
图1 纯化后的富马酸气相质谱2纯化后的富马酸为荷质比，对比数据库鉴定该物质为富马酸。图3:富马酸酶的结构示意图(PDB=IFUP)。右侧为亚基A，左侧为亚基B。图中显示的氨基酸侧链为亚基A118位的组氨酸(中间右侧)和亚基B331位的谷氨酸(中间左侧)，其它氨基酸侧链均未显示。有益效果单批次摩尔收率达到27%以上，通过气相质谱检测，纯度达到了 99%以上。
具体实施例方式本发明中酶活的定义为一分钟内转化1 μ mol底物定义为IU实施例1富马酸酶基因的克隆表达以及序列测定嗜热栖热菌Hiermus thermophilus HB8购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心。菌种活化后，接种于50ml LB培养基中，在65摄氏度水浴摇床中培养40小时后，8000rpm 离心IOmin收集菌体。基因组DNA提取采用北京博迈德科技发展有限公司提供的细菌基因组提取试剂盒(具体方法参见说明书)。PCR扩增富马酸酶基因使用如下引物，5' -GGAATTCcatatggaataccggattgagcgggaca-3'5， -CCCAAGCTTGctacgccccctcgtggggctt-3，PCR 反应体系含有 0. 2 μ L 基因组 DNA，0. 2 μ L Taq 聚合酶，0. 4 μ L dNTPs, 2 μ L 缓冲液，引物各0. 5 μ L，加双蒸水补至20 μ Lo反应条件为预变性95度5min，95度变性lmin， 退火65度lmin，延伸72度1. 5min,循环30次。PCR产物用1 %的琼脂糖进行凝胶电泳，所得到的约1400bp条带进行切胶回收、纯化后，用限制性内切酶NdeI和HindIII在37度酶切3小时。表达载体pET22b(+)在同样条件下处理。得到的酶切产物用琼脂糖凝胶电泳分离、回收。纯化后，两个酶切产物用T4连接酶在16度连接16小时。用该连接产物转化大肠杆菌ToplO感受态细胞，涂布带有氨苄抗性LB琼脂平板，37度过夜培养后，挑取适量菌斑，在LB培养基中过夜培养，用试剂盒提取质粒，测序验证插入片段，并测定其序列如序列2所示，编码如序列1所示的氨基酸序列。带有正确插入片段的表达载体转化大肠杆菌 BL21 (DE3)，得到重组富马酸酶大肠杆菌。来自嗜热栖热菌HB8的富马酸酶基因由1401个碱基编码，GC含量为67%，起始密码子是较稀有的GTG，转译由TAG结束。富马酸酶基因共编码了 466个氨基酸。这个富马酸酶属于II类富马酸酶(EC 4.2. 1.2)，即不需要金属离子或辅因子，亦称为富马酸酶C。在自然条件下，富马酸酶为4聚体，由4个相同的亚基构成。将上步获得的重组富马酸酶大肠杆菌接种于50mL LB培养基中于37度培养，再转接到IL LB培养基中培养至0D600约0. 8，用0. 4mM的IPTG诱导，过夜培养，然后8000rpm离心收集菌体。用40mL的Tris-HCl缓冲液(lOOmM，pH7. 8)重悬后，进行超声波破碎。离心后取上清。70度热变性30min，然后12000rpm离心lOmin，去除部分大肠杆菌蛋白。酶液用Bradford法测定蛋白含量(参见精编分子生物学实验指南，科学出版社，1999)，每升LB 培养基的重组富马酸酶大肠杆菌可以得到19aiig富马酸酶。实施例2反应条件反应体系如下在IOOmL体系中含有，50%的乙二醇，50mM Tris_HCl，lM L-苹果酸，2mL富马酸酶阳！！^/！！^…！！值控制在？^。70摄氏度反应3小时后，有7%的苹果酸
转化为富马酸。实施例3富马酸的分离提取将上述优化反应条件的反应液，加入浓盐酸调节pH值为2进行酸析，12000rpm离心5分钟沉淀得到富马酸。沉淀用20mL水漂洗、离心两次，除去残留的溶剂和底物。60摄氏度干燥后得到3. 2g富马酸。摩尔收率为27.6%。实施例4富马酸的分离提取将上述优化反应条件的反应液，加入浓盐酸调节pH值为1. 5进行酸析，IOOOOrpm 离心5分钟沉淀得到富马酸。沉淀用20mL水漂洗、离心两次，除去残留的溶剂和底物。65 摄氏度真空离心干燥后得到3. 3g富马酸。摩尔收率为四％。实施例5富马酸的分离提取将上述优化反应条件的反应液，加入浓盐酸调节pH值为2. 5进行酸析，12000rpm 离心5分钟沉淀得到富马酸。沉淀用20mL水漂洗、离心两次，除去残留的溶剂和底物。50 摄氏度干燥后得到3. 2g富马酸。摩尔收率为27.9%。实施例6富马酸的分离提取将上述优化反应条件的反应液，加入浓硫酸调节PH值为2进行酸析，12000rpm离心5分钟沉淀得到富马酸。沉淀用20mL水漂洗、离心两次，除去残留的溶剂和底物。70摄氏度干燥后得到3. 2g富马酸。摩尔收率为观％。实施例7富马酸纯度的测定取Img真空干燥固体粉末，溶于ImL乙腈，取出50 μ L到新试管，加入等体积三甲基硅烷衍生化，室温反应池。乙腈稀释10倍后，经气相质谱鉴定，产品为富马酸，未有明显苹果酸被检出。气相质谱条件为气相色谱型号为GC-2010，质谱型号为GCMS-QP2010，均由岛沣公司(SHIMADZU)提供；柱箱温度80°C，进样口温度300°C，进样模式为分流模式，分流比20，载气为氦气，柱流量0. 80mL/min ；初始温度80. 0°C，保持2min，以25. 0°C /min升温至 300. 0°C，保持 2. 5min ；色谱柱采用 HP-5ms (30m X 0. 1 μ m X 0. 25mm)；离子源温度 200°C, 界面温度250°C，溶剂切割时间anin。
权利要求
1.一种通过富马酸酶酶法生产富马酸的分离方法，包括在含有有机溶剂的体系中进行酶反应，所述有机溶剂为乙二醇；所述乙二醇的浓度为50-70%，分离提取富马酸的步骤为，调节PH值为1.5-2. 5进行酸析，离心分离，得到沉淀富马酸，沉淀用水漂洗、离心， 50-70°C干燥3-5个小时后得到富马酸。
2.如权利要求1所述通过富马酸酶酶法生产富马酸的分离方法，其特征在于所述离心分离条件为10000-12000rpm离心5-10分钟。
3.如权利要求1所述通过富马酸酶酶法生产富马酸的分离方法，其特征在于所述有机溶剂的体系为在IOOmL体系中含有，50%的乙二醇，50mMTris-HCl，lM L-苹果酸，2mL6mg/ mL的富马酸酶，pH值7. 8，70°C。
4.如权利要求1所述通过富马酸酶酶法生产富马酸的分离方法，其特征在于调节pH值为 1. 5、2 或 2. 5。
5.如权利要求1所述通过富马酸酶酶法生产富马酸的分离方法，，其特征在于富马酸的摩尔收率达到27.6%。
全文摘要
本发明公开了一种富马酸生产分离方法，本发明属于生物化工领域，特别涉及一种富马酸的生产分离方法。包括在含有有机溶剂的体系中进行酶反应，所述有机溶剂为乙二醇；所述乙二醇的浓度为50-70％，分离提取富马酸的步骤为，调节pH值为1.5-2.5进行酸析，离心分离，得到沉淀富马酸，沉淀用水漂洗、离心，50-70℃干燥3-5个小时后得到富马酸。单批次摩尔收率达到27％以上，通过气相质谱检测，纯度达到了99％以上。
文档编号C07C51/42GK102492733SQ201110402079
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月6日 优先权日2011年12月6日
发明者刘珞, 宋嘉宁, 王芳, 谭天伟, 邓利 申请人:北京化工大学