专利名称：G蛋白偶联受体的分离提取方法
技术领域：
本发明属于生物分离工程与技术领域，具体是应用超滤技术分离提纯G蛋白偶联受体的方法。
背景技术：
G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors,GPCRs)是具有七次跨膜结构的细胞膜蛋白，它可以与激素、神经递质、光、气味等小分子物质发生相互作用，在细胞信号传递中发挥着重要作用。人类重大疾病的发生(如自身免疫性、传染性、过敏性疾病等)都与 GPCRs功能紊乱有关。目前，三分之二以上的药物开发以及十分之一以上的世界前200种最畅销药物都是以 GPCRs 作为药物靶点(Cell. Mol. Life Sci. 2006,63 :1149-1164)。尽管GPCRs作为药物开发目标蛋白的重要性已经非常清楚，但是关于它们原子级精细结构的了解却相对较少(Nature 2008，453 :363-368 ；Science 2007，318 1266-1273)，这大大降低了结构依赖性药物设计的针对性。原因有二 ( 一)天然细胞或组织中GPCRs的含量很低，需要通过重组表达技术获得，然而将它们转运嵌入表达载体质膜的效率较低，加之它们对宿主细胞的毒害作用，增加了重组表达的难度。(二)由于膜蛋白的结构复杂，且稳定性较差，所以在提纯过程中需要添加去污剂以保持其结构和活性，这对 GPCRs的产量造成一定影响，加之传统分离工艺的过程复杂、耗时较长，导致最终获得的高纯度蛋白质数量非常有限，仅达毫克级。近年来，随着新型重组表达方法的建立，GPCRs的产量有了突破性增长，表达量可达10mg/L以上，但经传统工艺提纯后，GPCRs的损失极为严重，损失率高达90% (PLoS 0ne2009，doi :10. 1371/journal. pone. 0004509)。所以，GPCRs 的提纯技术已经成为研究其结构的主要瓶颈之一(Bri. J. Pharmacol. 2006，147 :S27_S37)。目前，急需开发操作条件更为温和的新型分离纯化技术来替代或部分替代GPCRs传统提纯工艺，以满足膜蛋白结构生物学研究发展的需要。超滤膜是指膜孔径在I-IOOnm之间，具有不对称结构的复合膜。由于其孔径尺寸与生物大分子的尺寸较为接近，故可用于生物大分子如蛋白质等的分离与纯化O^ood Chem. 2010，122 :747-752)。超滤分离是分子级的，即可截留溶液中的大分子溶质，同时使小分子溶质透过；有时也可以通过调节溶液中微环境，使预分离的蛋白质分子和膜表面带有不同性质的电荷，再通过蛋白质分子之间、蛋白质与膜表面之间的静电作用，达到分离的目的。目前，在生物加工领域，超滤技术常用于蛋白质的纯化与浓缩，在工业上已有较多应用， 但由于自然体系中蛋白质种类复杂，且存在较多的同工酶，使用超滤法直接分离得到高纯度的功能蛋白质的实例极少，且这方面的研究仍处于实验室规模(J. Membr. Sci. 2010,352 231-238)。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简单，易于实现G蛋白偶联受体规模化制备的超滤提取方法。本发明采取的技术路线是(1)将细胞膜或G蛋白偶联受体重组表达的工程菌菌体等，在表面活性剂浓度为 0-5% (w/v)的缓冲液下破碎、增溶，离心取上清液；(2)利用截留分子量为100_300kDa的超滤膜对步骤1得到的上清液进行超滤分离，截留液即为高纯度的G蛋白偶联受体产品。超滤分离条件为表面活性剂浓度为0-5% (w/v)，溶液pH值2-10，离子强度O-IM0本发明提取方法中，步骤(1)中的增溶时间为30分钟以上；步骤(1)中的离心条件为4°C，离心力大于1000g，离心时间大于10分钟。本发明具有操作简单，分离浓缩同步进行，且产品回收率高，可实现G蛋白偶联受体规模化制备等特点，具有良好的应用前景。
具体实施例方式下面结合实施例进一步描述本发明。实施例1，从基因重组的大肠杆菌中提取G蛋白偶联受体CCR3的方法，步骤(1)通过离心取250mL发酵液中的菌体，加入40mL的PBS缓冲溶液(50mM，pH8. 0， 表面活性 Fos choline-14(FC-14)浓度为 1. 0% (w/v))，超声破碎 lh，IOOOOg 离心 30min， 取上清液35mL ；(2)利用PBS缓冲溶液(50mM，pH8. 0)将步骤(1)获得的35mL上清液稀释至面活性 choline-14(FC-14)浓度为 0. 02% (w/v)，得到 1. 75L 稀释液；(3)利用截留分子量为300kDa的平板式超滤膜(聚醚砜材质，0. 09m2)对步骤(2) 获得的1. 75L稀释液进行分离浓缩至截留液体积为230mL。超滤膜进料口和出料口的操作压力分别为:0. 03MPa和0. 07MPa，流速为3. 8L/h ；(4)将步骤(3)获得的230mL截留液冻干后，得到G蛋白偶联受体CCR3约O.Mg， 产品经SDS-PAGE电泳分析，G蛋白偶联受体CCR3纯度高于84. 3%。实施例2，从基因重组的大肠杆菌中提取G蛋白偶联受体CXCR4的方法，步骤(1)通过离心取200mL发酵液中的菌体，加入30mL的PBS缓冲溶液(100mM，pH7. 8， 表面活性 N-dodecyl- β -D-maltoside (DM)浓度为 0. 5 % (w/v))，超声破碎 40min，IOOOOg 离心30min，取上清液^mL ；(2)利用PBS缓冲溶液(lOOmM，pH7. 8)将步骤(1)获得的^mL上清液稀释至面活性DM浓度为0.01% (w/v)，得到1. 3L稀释液；(3)利用截留分子量为IOOkDa的平板式超滤膜(聚醚砜材质，0. 09m2)对步骤(2) 获得的1. 3L稀释液进行分离浓缩至截留液体积为200mL。超滤膜进料口和出料口的操作压力分别为:0. 03MPa和0. 07MPa，流速为3. 6L/h ；(4)将步骤(3)获得的200mL截留液冻干后，得到G蛋白偶联受体CXCR4约 0. 414g，产品经SDS-PAGE电泳分析，G蛋白偶联受体CXCR4的纯度为85. 6%。
权利要求
1.G蛋白偶联受体的分离提取方法，是以截留分子量为100-300kDa的超滤膜超滤处理G蛋白偶联受体的粗酶液，最终获得高纯度的G蛋白偶联受体；所述G蛋白偶联受体的粗酶液是将细胞膜或G蛋白偶联受体重组表达的工程菌菌体破碎、表面活性剂增溶、离心后获得上清液。
2.根据权利要求1所述的提取G蛋白偶联受体的方法，其特征在于所述用截留分子量为100-300kDa的超滤膜处理时，表面活性剂浓度为0_5% (w/v)，溶液pH值2_10，离子强度 0-1M。
3.根据权利要求1或2所述的提取G蛋白偶联受体的方法，其特征在于所述表面活性剂为离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂或两亲性肽分子表面活性剂。
4.根据权利要求1或2或3所述的G蛋白偶联受体的提取方法，其特征在于所述用截留分子量为100-300kDa的超滤膜的组件形式为中空纤维素膜、平板膜或卷式膜。
5.权利要求1-4所述的提取G蛋白偶联受体的方法，经操作条件改进及超滤膜优化，可用于分离和纯化其它膜蛋白质。
全文摘要
本发明提涉及G蛋白偶联受体的分离提纯方法。其特点是关键工艺确定使用超滤技术从不同原料中分离提纯G蛋白偶联受体。本发明的分离提纯方法可获得纯度在80％以上的提取物，得率大于87％。本发明具有工艺简单，提取周期短，易于过程放大等特点，可实现G蛋白偶联受体的规模化制备，具有良好的应用前景。
文档编号C07K14/72GK102558344SQ20121006071
公开日2012年7月11日 申请日期2012年3月9日 优先权日2012年3月9日
发明者刘建国, 吕建仁, 崔占峰, 葛保胜 申请人:中国石油大学(华东)