专利名称：一种固相片段法合成比伐卢定的方法
技术领域：
本发明涉及一种固相片段法合成多肽的方法，尤其是比伐卢定的固相片段法合成方法。
背景技术：
比伐卢定(Bivalirudin),是ー种近年来应用于临床直接的、特异的、可抑性凝血酶抑制剂，其有效抗凝成分为水蛭素衍生物片段，可以直接通过特异性抑制凝血酶活性而发挥抗凝作用，作用可逆而短暂。早期的临床研究显示比伐卢定抗凝治疗效果确切，且出血事件的发生率较低，和传统肝素抗凝治疗相比使用更为安全。佛罗里达奥克拉心脏病研究所的Bittl自己主持的ー项研究显示，在不稳定型心绞痛及梗塞后心绞痛患者行冠状动脉成形术过程中，比伐卢定的效果比肝素好，比伐卢定组患者术后7天的总终点事件(死 亡、血管再通术及心肌梗死)发生率少于肝素组(6. 2% vs7. 9%, P = O. 039)，出血副作用发生率亦更低(3. 5% vs 9. 3%,P < O. 001)。2000年12月美国食品药物管理局(FDA)批准比伐卢定在美国上市。美国胸科医师学会(ACCP)抗栓和溶栓治疗循证指南和美国心脏学会和心脏病学会2005年于PCI患者抗凝治疗指南指出，比伐卢定克服了肝素、低分子肝素及水蛭素的缺点，具有良好的临床应用前景。可替代肝素用于PCI、不稳定型心绞痛、急性心肌梗死溶栓的治疗，肝素诱导的血小板減少症的抗栓治疗；也可以用于外周动脉介入治疗、心肺移植手术及肾功能不全患者防栓抗栓治疗亦有良好作用，所以可作为普通肝素和Ilb/lIIa受体阻滞剂的替代药和辅助药物。2007年全球销售达2. 55亿美元，目前市场应用正在不断扩大。然而，比伐卢定在我国尚未上市，MedicineS公司也没有在亚洲地区的上市计划，这在很大程度上延误了我国心血管医疗事业一尤其是冠状动脉血管成形术的发展。实现比伐卢定的规模化和产业化生产，能够很好地促进比伐卢定药物在我国医疗事业的应用，提高心脏手术的医疗水平。比伐卢定化学式为D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-IIe-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH目前国内关于比伐卢定合成报道的不多，其中专利号CN200910028793，提供ー种比伐卢定的液相合成方法，这个方案主要是通过液相合成三个全保护的片段N-端全保护的6肽、中段全保护的6肽、C-端全保护的8肽，然后将这三个片段依次在液相中依次缩合得到全保护的比伐卢定。该方案在规模化生产中产生大量的废液，产品也比较难纯化。上述方案エ艺比较繁琐，而且产生的杂质多，产品纯度也比较低，不易进行大規模化生产。
发明内容
本发明提供了一种高收率、提成本、反应条件温和、环境污染小、有利于实现产业化的比伐卢定固相片段法合成エ艺。为了实现上述目标，本发明方案主要包括以下步骤
I)由替代度为 O. 4 O. QmmoI /g 的 Wang Resin 和 Fmoc-Leu-OH 反应制备Fmoc-Leu-Wang Resin,再按序列依次连接12个含Fmoc保护基氨基酸,得13肽片段I-WangResin ；2)由替代度为 O. 4 O. QmmoI /g 的 Wang Resin 和 Fmoc-Gly-ΟΗ 反应制备Fmoc-Gly-Wang Resin,再按序列依次连接6个含Fmoc保护基氨基酸，得7肽片段-2-Chlorotrityl Chloride Resin,裂解得 Fmoc 保护 N 端的 7 肽片段 II ；3) 13肽片段I-Wang Resin与7肽片段II以固相片段法合成比伐卢定-WangResin,经脱保护，裂解，纯化冷冻干燥得比伐卢定。上述比伐卢定固相片段法合成エ艺,其中，步骤I)所述的Fmoc-Leu-Wang Resin是由Wang Resin和Fmoc-Leu-OH在以无水DCM或DMF为反应介质，DIC+HOBt+DMAP偶联剂作用下反应制备；固相合成13肽片段I-Wang Resin，其中依次连接的氨基酸为Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-0H、Fmoc-Pro-0H、Fmoc-IIe_0H、 Fmoc-Glu (OtBu)-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-0H> Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-0H>Fmoc-Gly-0H>Fmoc-Asn (Trt) -OH 和 Fmoc-Gly-ΟΗ,反应介质为在 DCM 或 DMF,脱 Fmoc 保护基采用的试剂为哌啶-DMF，洗涤试剂为无水DMF、DCM和CH3OH,活化试剂为A+B+C，其中A为HOAt 或 HOBt，B 为 HBTU 或 HATU 或 TBTU 或 DIC，C 为 DIEA。步骤2) 7 妝片段 II 制备，其中 Fmoc-Gly-ΟΗ 和 2-Chlorotrityl ChlorideResin在以无水DCM或DMF为反应介质，在DIC+HOBt+DMAP作用下反应制备Fmoc-Gly-2-Chlorotrityl Chloride Resin ;其中 Fmoc 保护的氨基酸为Fmoc_Gly-0H、Fmoc-Gly-ΟΗ、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Pro-OH、 Fmoc-Arg(pbf)-OH、 Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH0脱Fmoc保护基采用的试剂为哌啶-DMF，洗涤试剂为无水DMF、DCM和CH3OH,活化试剂为A+B+C，其A为HOAt或HOBt，B为HBTU或HATU或TBTU，C为DIEA或DIC，裂解试剂为TFA-DCM，优选的为5% TFA-DCM。步骤3)固相片段法合成比伐卢定,其中13肽片段I-Wang Resin为Fmoc-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu (OtBu)-Glu (OtBu)-Tyr(OtBu)-Leu-Wang Resin ；7 肽片段 II-2-Chlorotrityl Chloride Resin 为Fmoc-D-Phe-Pro-Arg (pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-2-ChlorotrityI ChlorideResin,活化试剂为 A+B+C，其 A 为 HOAt 或 HOBt，B 为 HBT U 或 HATU 或 TBTU，C 为 DIEA 或DIC,脱N端保护基实际为哌啶/DMF，裂解及脱侧链保护基试剂为TFA/H20/TIS。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图I为本发明13肽片段I-Wang Resin合成エ艺流程图；图2为本发明7肽片段II合成エ艺流程图；图3为本发明固相片段法合成比伐卢定的エ艺流程图。
具体实施例方式下面给出的实例以便对本发明进行具体描述，有必要在此指出，本发明不受本方法作为唯一的限制，在本领域对本发明做出ー些非本质改动和调整，都属于本发明的保护范围。在本权利要求书和说明书中出现的缩写代表的意义为下表
Fmoc9-荷甲氧裁基
HOBtI-羟基苯并三唑 HOAtN-羟基- -偶氮苯并三氮唑
HATU2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，V，N,-四甲基脲六氟磷酸酯
pbf2，24，6，7-五手基-ニ氢苯并呋喃-5-磺酰基
OtBu叔丁氧基
DMFN，N-二甲基甲酰胺
DCMニ氯甲烷
DICN，N' -ニ异丙基碳ニ亚胺
IffiTU2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯
TBTUO -苯并三氮唑-N，N，N' ,N'-四甲基脲四氟硼酸
TFA三氟乙酸
DMAPニ甲氨基吡啶
DIEAN, N- ニ异丙基乙胺
TIS三异丙基硅烧
DICN, N- ニ异丙基碳ニ亚胺
具体实施例说明
实施例I
13 肽片段 I-Wang Resin 的制备
称取Ig替代度为O. 7mmol/g的Wang Resin,加入到固相反应柱中，加入无水IOml DCM溶胀30min后，用无水DMF洗涤3次(每次Imin)，分别将I. 4mmol的Fmoc-Leu-OH、HOBt 溶于5ml无水DMF，再加入I. 4mmol的DIC在O 5°C活化5min后，加入到固相反应柱反应lOmin，再加入O. 2mmol DMAP，在30°C反应5h，反应完毕后分别用无水DMF、CH3OH、DCM、DMF洗漆2、1、1、2次,姆次不少于Imin,检测替代为O. 65mmol/g。用O. Immolこ酸酐和卩比唳封闭树脂上未反应的轻基Ih,得Fmoc-Leu-Wang。依次用IOml体积为25%哌卩定-DMF脱Fmoc-Leu-Wang上Fmoc保护基2次后(第一次反应5min，中间用无水DMF洗涤一次，第二次反应15min)，依次用无水DMF、CH30H，DCM、DMF 洗涤 2、1、1、2 次，每次不少于 lmin。分别取 I. 3mmol 的 Fmoc-Tyr (tBu)-OH、HOBt、HBTU溶于0-5°C的无水DMF，加入O. 65mmol的DIEA活化5min后，加入到固相反应柱，在30°C反应2. 5h，反应终点以茚三酮法检测为准。重复上述步骤依次偶联Fmoc-Glu (OtBu)-0H、Fmoc-Glu (OtBu)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-0H>Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-ΟΗ、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gly-ΟΗ,得 13 妝片段 I-Wang Resin ((Fmoc-Gly-Asn (Trt) -Gly-Asp (OtBu) -Phe-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Ile-Pro-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (OtBu) -Leu-ffang Resin)。
实施例27肽片段II的制备称取2g 替代度为 O. 7mmol/g 的 2-Chlorotrityl Chloride Resin,加入到固相反应柱中，加入无水DCM溶胀30min后，用IOml无水DMF洗涤3次(每次lmin)，分别加入
2.4mmol 的 Fmoc-Gly_0H、H0Bt、溶于 5ml 无水 DMF 中，再加入 I. 4mmol 的 DIC 在 O 5°C活化5min后，加入到固相反应柱反应lOmin，再加入O. 4mmol DMAP，在30°C反应5h，用IOml无水DMF洗漆2次,每次lmin,检测替代为O. 68mmol/g。用O. 2mmolこ酸酐和卩比唳封闭树脂上未反应的氨基 Ih,得 Fmoc-Gly-2-Chlorotrityl Chloride Resin。依次用 20ml 体积为25%哌唳/DMF脱Fmoc-Leu-Wang上Fmoc保护基2次后(第一次反应5min,第二次反应lOmin，中间用IOml DMF洗涤I次)，依次用无水DMF、CH3OH, DCM、DMF洗涤2、I、1、2次，每次不少于lmin。分别取2. 4mmol的Fmoc-Gly-0H、HOBt、HBTU溶于0_5°C的无水DMF，カロ入lmmol DIEA活化5min，加入到固相反应柱，在30°C反应2h，反应终点以茚三酮法检测为准。重复上述步骤依次连接 Fmoc-Gly-0H、Fmoc-Gly-0H、Fmoc-Pro-0H、Fmoc-Arg(pbf) -0H、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-D-Phe-OH。得 7 妝片段 II-2-Chlorot;rityl Chloride Resin。实施例3固相片段法合成比伐卢定取过量I. 5倍的7肽片段II，过量2倍的H0Bt、HUBT、溶于0_5°C的无水DMF，加入过量I. 5倍的DIEA活化5min后，加入到固相合成柱中，在0_30°C反应l_5h (反应终点以却三酮法检测为准)，无水DMF洗漆3次,得伐卢定-Wang Resin (D-Phe-Pro-Arg (pbf) -PrO-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn (Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu (OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu(OtBu) -Glu (OtBu) -Tyr (OtBu) -Leu-ffang Resin)。加入 15ml 25 % 的哌唳-DMF 为 Fmoc 脱保护剂2次后(第一次反应5min，第二次反应lOmin，中间用IOml DMF洗涤I次)，依次用DMF、DCM、CH3OH洗涤2、1、3次，每次不少于2min ;加入15ml体积比为95 2. 5 2. 5的TFA/H20/TIS作为裂解、侧链保护基脱除试剂反应2-3h，后滤入无水冰こ醚在_5 5°C下静止3 5h，高速离心后经高压液相制备，冷冻干燥的精比伐卢定。其纯度> 99. 5%，单杂质
<O. 2%，总收率达53%。本实施例中选取了替代度为O. 7mmol/g的Wang Resin与Fmoc-Leu-OH反应制备 Fmoc-Leu-Wang Resin ;替代度为 O. 7mmol/g 的 2-Chlorotrityl Chloride Resin 和Fmoc-Gly-ΟΗ 反应制备 Fmoc-Gly-2-Chlorotrityl Chloride Resin ;还可以选取替代度为 O. 4 O. 9mmol/g 范围的任一 Wang Resin 和 Fmoc-Leu-OH 反应制备 Fmoc-Leu-WangResin ；以及替代度为 O. 4 O. 9mmol/g 范围的任一 2-Chlorotrityl Chloride Resin 和Fmoc-Gly-ΟΗ 反应制备 Fmoc-Gly-2-Chlorotrityl Chloride Resin ;均能够实现本发明的技术方案，并取得本发明的所述的技术效果。
以上内容是比伐卢定和成路线最佳优选方案之一，以及对本发明所做的进ー步详细说明，但并不能认定本发明的具体实施只限于这些说明，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演及替换，都应当视为本发明保护范围。
权利要求
1.一种固相片段法合成比伐卢定的方法，包括以下步骤 1)由替代度为O.4 O. QmmoI /g的Wang Resin和Fmoc-Leu-OH反应制备Fmoc-Leu-Wang Resin,再按序列依次连接12个含Fmoc保护基氨基酸,得13肽片段I-WangResin ； 2)由替代度为O.4 O. 9mmol/g的Wang Resin和Fmoc-Gly-OH反应制备Fmoc-Gly-Wang Resin,再按序列依次连接剩余的6个含Fmoc保护基氨基酸,得7肽片段-2-Chlorotrityl Chloride Resin,裂解得 Fmoc 保护 N 端的 7 肽片段 II ； 3)13肽片段I-Wang Resin与7肽片段II以固相片段法合成比伐卢定-Wang Resin,经脱保护，裂解，纯化冷冻干燥得纯比伐卢定。
2.根据权利要求I所述的一种固相片段法合成比伐卢定的方法，其特征在于，Fmoc-Leu-OH 和 Wang Resin 在 DIC+HOBt+DMAP 作用下反应制备 Fmoc-Leu-WangResin ;固相逐步合成13肽片段I-Wang Resin,其中Fmoc保护的氨基酸为Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-0H>Fmoc-Glu(OtBu)-0H> Fmoc-Pro-0H> Fmoc-IIe-OH>Fmoc-Glu (OtBu)-OH、Fmoc-Glu (OtBu)-0H> Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asp (OtBu)-0H>Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn (Trt) -OH 和 Fmoc-Gly-OH。
3.根据权利要求I所述的一种固相片段法合成比伐卢定的方法，其特征在于，制备7肽片段 II，其中 Fmoc-Gly-OH 和 2-Chlorotrityl Chloride Resin 在 DIEA 作用下反应制备Fmoc-Gly-2-Chlorotrityl Chloride Resin ;其中 Fmoc 保护的氨基酸为Fmoc_Gly-0H、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg (pbf) -OH、Fmoc-Pro-OH 和 Fmoc-D-Phe-OH,裂解试剂为 TFA-DCM。
4.根据权利要求1-3任意一项权利要求所述的一种固相片段法合成比伐卢定的方法，其特征在于，反应介质为无水DMF或DCM，脱Fmoc保护基试剂为哌啶/DMF，洗涤试剂为无水DMF,DCM 和 CH3OH,活化试剂为A+B+C，其 A 为 HOAt 或 HOBt，B 为 HBTU 或 HATU 或 TBTU，C 为DIEA 或 DIC。
5.根据权利要求1-3任意一项权利要求所述的一种固相片段法合成比伐卢定的方法，其特征在于，氨基酸活化温度为I 10°c，偶联、裂解温度为I 30°C。
6.根据权利要求1-3任意一项权利要求所述的一种固相片段法合成比伐卢定的方法，其特征在于，13肽片段I-Wang Resin为Fmoc-Gly-Asn(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Phe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ile-Pro-Glu (OtBu)-Glu(OtBu) -Tyr(OtBu)-Leu-ffang Resin ；
7 肽片段 II-2-Chlorotrityl Chloride Resin 为Fmoc-D-Phe-Pro-Arg(pbf)-Pro-Gly-Gly-Gly-2-Chlorotrityl Chloride Resin。
全文摘要
本发明提供一种固相片段法合成比伐卢定的方法。首先用固相逐步法合成一个13肽片段I-Wang Resin，一个N端被Fmoc保护的7肽片段II，二者采用固相片段法偶联合成比伐卢定-Wang Resin；最后经过脱保护、裂解、纯化，冷冻干燥得到纯比伐卢定。该方法相对已有的固相逐步法或液相片段法来说具有工艺操作简单、收率、纯度高、环境污染小、易大规模化生产等优点。
文档编号C07K7/08GK102731624SQ20121019662
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月14日 优先权日2012年6月14日
发明者姚程成, 康国伟, 杨毅跃, 蒙相锋 申请人:无锡市凯利药业有限公司