专利名称：一种白喉类毒素疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种白喉类毒素疫苗的制备方法。
背景技术：
白喉类毒素疫苗由白喉杆菌菌种制成，白喉杆菌菌体分泌出来的毒素是单一的多肽链，不含糖基和辅基，蛋白质由560个氨基酸组成，分子量为62kDa，是一种酶原，只有在蛋白酶的作用下，将其切成缺口毒素，才具有生物活性。等电点约为PH4. 1，在pH6时，加热至55°C就很快失去活性而凝固。白喉类毒素包括A、B两个片段，其中B片段是受体结合和 穿膜片段，A片段是毒性片段，通过阻抑蛋白合成中的酶活性，最终引起细胞死亡。它对远端组织和器官也可产生毒性，尤其是心脏及外周和中枢神经系统。现有的制备方法所得到的白喉类毒素疫苗选择性差，质量不高，纯度低(400-600Lf/mg TN),色泽深,用聚丙烯酰胺电泳检查,仍然是一个多种成分的混合体。特别是菌液分离、白喉毒素溶液的浓缩、白喉毒素的提纯、脱盐这些过程较为简单粗放，有些工艺不符合GMP要求而被淘汰，有些工艺方法在大生产条件下使用会受到限制。例如菌液分离工艺中，一般大生产要处理的体积要达到500L以上，若采用离心则不太适合，处理的时间会很长，耗费大量的劳动力；若采用帆布过滤除菌，存在过滤不彻底和帆布材料不符合GMP要求的缺陷；板框过滤的缺点是滤板易堵塞，过滤时间可能过长；切向流过滤不易堵塞，过滤速度也较理想，但对菌体、蛋白的剪切力较大。白喉类毒素溶液的浓缩可采用沉淀剂沉淀后用绸布过滤得到沉淀，然后重悬沉淀，但是绸布用到生产中不符合GMP要求；采用切向流过滤，同样也存在对蛋白的剪切力较大和过滤速度较慢的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种白喉类毒素疫苗的制备方法，以提高白喉类毒素疫苗的生产效率和产品质量。上述目的是通过以下技术方案实现的一种白喉类毒素疫苗的制备方法将白喉杆菌菌种经传代发酵，甲醛脱毒后，将培养液调节PH至6. 9^7. 5，然后用孔径为O. 22、. 45Mm的中空纤维滤膜过滤除去菌体，滤液用孔径为KT40KD中空纤维滤膜进行超滤，直至滤液的体积为原体积的1/8 1/10，然后向滤液中加入质量体积比为25% 27%的硫酸铵，第一次盐析后过滤，向滤液中再次加入质量体积比为159Γ19%的硫酸铵，第二次盐析后离心分离，将离心后的沉淀用注射用水完全溶解后，再次用孔径为IOlOKD的中空纤维滤膜进行超滤，直至滤液中硫酸铵含量小于O. 025%。优选的，超滤中所用的空纤维滤膜的孔径为30KD。所述超滤的进口压力为I. 5 2. 5bar，回流口压力为O. 2 lbar，流速为20(T240L/小时。优选的，所述超滤的流速为220L/小时。本发明先将培养液用孔径为O. 22、. 45Mffl的中空纤维滤膜除去菌体，再进行精制，从而减少后续过滤工艺中菌体和其他杂质碎片堆积引起的孔道堵塞；通过改进盐析方法，有效去除了培养液中的毒素蛋白和其他致敏原；培养液的浓缩和盐析后的脱盐方法采用的均是切向流超滤方法，减少了因对毒素蛋白的剪切造成的抗原破坏，避免了蛋白的沉淀，缩短了制备时间，提高了生产效率。
图I是本发明的工艺流程图；图2是本发明中空纤维滤膜超滤的工作原理图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例I白喉类毒素疫苗的制备方法，包括以下步骤I)白喉类毒素的培养采用白喉杆菌PW8株(CMCC 38007)，在马丁培养基中培养5代后，转入大罐中以深层搅拌，在34 36°C条件下表面通气法培养48 50小时，培养结束后按培养量的O. 6% (V/V)加入甲醛溶液，3(T35°C杀菌30分钟，用管道输送至精制罐中。2)菌液分离取白喉类毒素培养液30L (3241^/1111)，用似!10)3调节溶液？!1值至6.9，采用中空纤维超滤系统中的微滤模块(该系统型号为MUF-HF7美国PALL，其中包含中空纤维膜柱、隔膜泵、储罐、必要的能够承受3Bar以上压力的管道、回流阀和滤出阀，此时所用中空纤维膜柱的孔径为O. 22Mm)，对发酵液进行切向流超滤，去除菌体，所述的切向流超滤步骤为开启泵前，检查管道流路，打开微滤柱管道滤出端和回流端的阀门，关闭超滤柱所有阀门，关闭低端排放阀门；打开泵控制开关，调整泵的控制旋钮，使泵的进口压力达到1.5 3.5bar，回流口压力达到O. 2"lbar,开始微滤，收集滤出端液体；待料液浓缩到5000ml开始洗滤，洗滤时，将洗滤用缓冲液出口连接到出液罐上，调整缓冲液出液的流速和滤出端流速相一致，洗滤到3飞倍，停止洗滤；洗滤停止后，关掉泵的电源开关，先打开滤出端的低位排放阀，收集系统内的滤出液并合并到收集罐内，待排放干净后打开回流端的低位排放阀门，将系统内的液体全部排放完毕。3)超滤浓缩收集滤出液I. 5L，用孔径为30KD的中空纤维滤膜进行切向流超滤浓缩，具体步骤为开启泵前，检查管道流路，打开超滤柱管道滤出端和回流端的阀门，关闭微滤柱所有阀门，关闭低端排放阀门；打开泵控制开关，调整泵的控制旋钮，使泵的进口压力达到1.5 2.5bar，回流口德压力达到O. 2 lbar，开始超滤，控制滤液的流速为200L/小时，收集回流端液体；待浓缩至原体积的1/8时，停止超滤浓缩。关掉泵的电源开关，先打开回流端的低位排放阀门，收集系统内的回流液体，合并到浓缩液中，待回流液排放干净后，再打开滤出端的低位排放阀门，将系统内的滤出液全部排放完毕；收集浓缩液200ml。4)两次盐析将浓缩液用硫酸铵二段盐析法进行盐析沉淀，一段盐析时，向浓缩液中加入质量体积比为25%的硫酸铵，静置24小时，用板框滤器(型号为40*40*10)过滤，收集滤液230ml，在收集到的滤液中再次加入质量体积比为19%的硫酸铵，静置24小时，在低温(2 8°C)离心机上离心,5020g, 30min,取糊状沉淀70ml。
5)超滤脱盐上述沉淀用注射用水300ml完全溶解后，采用中空纤维超滤系统中的超滤模块(该系统型号为MUF-HF7包含中空纤维膜柱、隔膜泵、储罐、必要的能够承受3Bar以上压力的管道、回流阀和滤出阀，此时所用中空纤维膜柱的孔径为30KD，对上清液进行切向流透析洗滤，所述洗滤步骤为开启泵前，检查管道流路，打开超滤柱管道滤出端和回流端的阀门，关闭微滤柱所有阀门，关闭低端排放阀门；打开泵控制开关，调整泵的控制旋钮，使泵的进口压力达到I. 5^2. 5bar,回流口的压力达到O. 2 lbar，开始超滤，控制滤液的流速为240L/小时，收集回流端液体；超滤脱盐时，将脱盐用缓冲液出口连接到出液罐上，并通过调整滤出阀和隔膜泵的频率控制滤出液的流速，使缓冲液出液的流速和滤出端流速相一致，检测样品中残余硫酸铵的质量百分含量小于O. 025%时为合格，停止超滤脱盐。得到白喉类毒素疫苗280ml，浓度为1140Lf/ml，批号为20090201。实施例2白喉类毒素疫苗的制备方法，包括以下步骤I)白喉类毒素的培养培养方法同实施例I。2)菌液分离取发酵液30L，用NaHCO3调节溶液pH值在7. 5，采用中空纤维超滤系统中的微滤模块(该系统型号为MUF-HF7美国PALL，其中包含中空纤维膜柱、隔膜泵、储罐、必要的能够承受3Bar以上压力的管道、回流阀和滤出阀，此时所用中空纤维膜柱的孔径为O. 45Mm)，对发酵液进行切向流超滤，去除菌体，所述的切向流超滤步骤为开启泵前，检查管道流路，打开微滤柱管道滤出端和回流端的阀门，关闭超滤柱所有阀门，关闭低端排放阀门；打开泵控制开关，调整泵的控制旋钮，使泵的进口压力达到I. 5^2. 5bar,回流口德压力达到O. 2"lbar,开始微滤，收集滤出端液体；待料液浓缩到一定体积时6000ml开始洗滤，洗滤时，将洗滤用缓冲液出口连接到出液罐上，调整缓冲液出液的流速和滤出端流速相一致，洗滤到所需要的倍数后3飞倍，停止洗滤。洗滤停止后，关掉泵的电源开关，先打开滤出端的低位排放阀，收集系统内的滤出液并合并到收集罐内，待排放干净后打开回流端的低位排放阀门，将系统内的液体全部排放完毕。3)超滤浓缩
收集滤出液I. 9L，用孔径为30KD的中空纤维滤膜进行切向流超滤浓缩，所述超滤步骤为开启泵前，检查管道流路，打开超滤柱管道滤出端和回流端的阀门，关闭微滤柱所有阀门，关闭低端排放阀门；打开泵控制开关，调整泵的控制旋钮，使泵的进口压力达到I. 5^2. 5bar,回流口的压力达到O. 2 lbar，开始超滤，控制滤液的流速为220L/小时，收集回流端液体；待浓缩至原体积的1/10时，停止超滤浓缩。关掉泵的电源开关，先打开回流端的低位排放阀门，收集系统内的回流液体，合并到浓缩液中，待回流液排放干净后，再打开滤出端的低位排放阀门，将系统内的滤出液全部排放完毕，收集浓缩液230ml。4)两次盐析将浓缩好的样品溶液230ml用硫酸铵二段盐析法进行盐析沉淀，一段盐析时，向 浓缩液中加入质量体积比为27%的硫酸铵，静置24小时，用板框滤器(型号为40*40*10)过滤，收集滤液270ml，再在收集到的滤液中加入质量体积比为15 %的硫酸铵，静置24小时，在低温(2 8°C )离心机上离心,5020g, 30min,取糊状沉淀90ml。5)超滤脱盐沉淀用注射用水300ml完全溶解后，采用中空纤维超滤系统(该系统型号为MUF-HF7，包含中空纤维膜柱、隔膜泵、储罐、必要的能够承受3Bar以上压力的管道、回流阀和滤出阀，此时所用中空纤维膜柱的孔径为30KD，对上清液进行切向流透析洗滤，所述洗滤步骤为开启泵前，检查管道流路，打开超滤柱管道滤出端和回流端的阀门，关闭微滤柱所有阀门，关闭低端排放阀门；打开泵控制开关，调整泵的控制旋钮，使泵的进口压力达到1.5 2.5bar，回流口的压力达到O. 2 lbar，开始超滤，控制滤液的流速为220L/小时，收集回流端液体。超滤脱盐时，将脱盐用缓冲液出口连接到出液罐上，并通过调整滤出阀和隔膜泵的频率控制滤出液的流速，使缓冲液出液的流速和滤出端流速相一致，检测样品中残余硫酸铵的质量百分含量小于O. 025%为合格，停止超滤脱盐。得到白喉类毒素疫苗290ml，浓度为11 IOLf/ml，批号为20090202。上述两批疫苗的动物免疫效果试验，结果见表I。表I. 20090101、20090202批白喉类毒素疫苗的效价结果
Wk 1
2009010197 IU/ml
2009020291 IU/ml
传统工艺均值 93 IU/ml本发明制备的两个批次的白喉类毒素疫苗的各项生化检测结果如下表2. 20090201、20090202批白喉类毒素疫苗的各项生化检测结果
权利要求
1.一种白喉类毒素疫苗的制备方法，其特征在于将白喉杆菌菌种经传代发酵，甲醛脱毒后，将培养液调节PH至6. 9^7. 5，然后用孔径为O. 22、. 45Mm的中空纤维滤膜过滤除去菌体，滤液用孔径为IOlOKD中空纤维滤膜进行超滤，直至滤液的体积为原体积的1/8 1/10,然后向滤液中加入质量体积比为25% 27%的硫酸铵盐析,静置24小时后过滤，向滤液中再次加入质量体积比为15°/Γ19%的硫酸铵盐析，静置24小时后离心分离，将离心后的沉淀用注射用水完全溶解后，再次用孔径为IOlOKD的中空纤维滤膜进行超滤，直至滤液中硫酸铵的质量百分含量小于O. 025%。
2.根据权利要求I所述的白喉类毒素疫苗的制备方法，其特征在于超滤中所用的空纤维滤膜的孔径为30KD。
3.根据权利要求I所述的白喉类毒素疫苗的制备方法，其特征在于所述超滤的进口压力为I. 5 2. 5bar，回流口压力为O. 2 lbar，液体流速为20(T240L/小时。
4.根据权利要求3所述的白喉类毒素疫苗的制备方法，其特征在于所述超滤的液体流速为220L/小时。
全文摘要
本发明公开了一种白喉类毒素疫苗的制备方法，该方法是以白喉杆菌菌株为原料，经过白喉类毒素的培养、菌液分离、超滤浓缩、两次盐析和超滤脱盐等步骤制备而成的。本发明先将培养液用中空纤维滤膜除去菌体，再进行精制，从而减少后续过滤工艺中菌体和其他杂质碎片堆积引起的孔道堵塞；通过改进盐析方法，有效去除了培养液中的毒素蛋白和其他致敏原；培养液的浓缩和盐析后的脱盐方法采用的均是切向流超滤方法，减少了因对毒素蛋白的剪切造成的抗原破坏，避免了蛋白的沉淀。本发明缩短了白喉类毒素疫苗的制备时间，提高了生产效率。
文档编号C07K14/34GK102961740SQ20121052945
公开日2013年3月13日 申请日期2012年12月10日 优先权日2012年12月10日
发明者李佩珊, 陈亮, 白磊, 凌霜, 杨以梅, 杨海燕, 薛红刚, 李新国 申请人:武汉生物制品研究所有限责任公司