专利名称：桑黄菌中甲基苯二酚的分离技术的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程制药领域。
背景技术：
桑黄，子实体无柄，菌盖扁半球形或马蹄形，2-12*3-21厘米，厚1. 5-10厘米，木质，浅肝褐色至暗灰色或黑色，老时常龟裂，无皮壳，初期有细微绒毛，后变无毛，有同心环棱.边缘钝，深肉桂色至浅咖啡色，下侧无子实层.菌肉深咖啡色，硬，木质.菌管与菌肉近同色，多层，但层次不明显，年老的菌管层充满白色菌丝.管口锈褐色至酱色，圆形，每毫米4-5个.孢子近球形，光滑，无色，5-6*3-4微米.刚毛顶端尖锐，基部膨大，10-25*5-7微米.菌丝不分枝，无横隔，直径3-5微米。目前，真菌产物的纯化方法较多，主要有分级沉淀法、制备性高效液相层析、柱层析法、超滤法、离心沉淀色谱法、等几种方法。而其中应用最多的当属柱层析法，分为两类一是只有分子筛作用的凝胶柱层析，常用的凝胶有葡聚糖凝胶及琼脂糖凝胶。二是离子交换层析。但，主要用于分离多糖，透明质酸等，多数分离后得到的产物为混合物。本发明使用多种层析技术相结合，分离度高，应用此发明可以精致到纯品。
发明内容
本发明公开了一种桑黄菌(火木层孔菌igniarius (L ex Fr) Quel、裂蹄木层孔菌phellinus linteus (Berk et Curt) Teng、鲍氏层孔菌、哈蒂针层孔菌Phellinus hartigii (Allesch et Schnabl) Imaz)中甲基苯二酌·的分离技术。首先制备桑黄粗提物，然后是正相硅 胶层析，使用氯仿与甲醇梯度洗脱，重复一次正相硅胶层析，接着进行氯仿甲醇凝胶层析，最后减压蒸干得到甲基苯二酚。本发明的技术方案如下
桑黄粗提物，由下述方法制得
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是
玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5%
蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5%
硫酸镁 O. 1-0. 5%磷酸二氢钾O. 01-0. 05%
(2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20 35°C温度，摇瓶转速为80 280r/min，pH 3 8条件下，震动培养7 15天；培养中当pH值降到
2.5 4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20 35°C，发酵罐压力
O.1 O. 2公斤/平方厘米，pH 3 8，通气量O. 5 1.1vvm,搅拌速度100 280转/分的条件，培养7 15天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；
(3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2 1/5 ；
(4)用体积百分比为60 95%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的2 5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到60 90% ；
(5)对步骤(4)所得提取液在50 70°C条件下，加热I 2小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5 1/10 ；
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。分离甲基苯二酚的方法
桑黄菌粗提物一正相硅胶层析一氯仿与甲醇梯度洗脱一TLC检测一正相硅胶层析一氯仿甲醇凝胶层析一TLC检测一减压蒸干一无色油状物(甲基苯二酚)。具体方法为
(1)制备桑黄菌粗提物；
(2)将步骤(I)中所得的粗提物与正相硅胶混匀搅拌，干燥后进行硅胶正相柱层析，用洗脱剂洗脱2-5次，得到洗脱液； (3)将步骤(2)中最后一次洗脱液蒸干，等体积硅胶拌样，进行正相硅胶层析，用洗脱剂洗脱；
(4)收集步骤(3)中的洗脱液，减压浓缩，使用氯仿甲醇=1:1溶解，甲醇凝胶柱层析，使用洗脱剂洗脱；
(5)收集步骤(4)得到的洗脱液，使用TLC检测各洗脱液，适度合并洗脱液，减压干燥，即为甲基苯二酚。
图1为4-甲基-1，2-苯二酚的结构式；
图2为4-甲基-1，2-苯二酚的一维核磁共振H谱。
具体实施方式
实例1:
桑黄粗提物，由下述方法制得
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是
玉米淀粉 1%葡萄糖 1%
蛋白胨 O. 1%酵母膏 O. 1%
硫酸镁 O. 1%磷酸二氢钾0.01%
(2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以25°C温度，摇瓶转速为110r/min，pH 7条件下，震动培养7天；培养中当pH值降到3时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度25°C，发酵罐压力O.1公斤/平方厘米，pH 3，通气量
O.5-1. lvvm，搅拌速度100转/分的条件，培养7天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；
(3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/3 ；
(4)用体积百分比为70%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的5倍，能够使提取液中乙醇浓度达到55% ；
(5)对步骤(4)所得提取液在70°C条件下，加热I小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5 ；
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。将上述得物称取IOOg与等体积100目正相硅胶混匀搅拌，进行硅胶正相柱层析。层析固定相为200-300目正相硅胶，柱高O. 6m，直径10cm，洗脱剂为分别为氯仿，氯仿甲醇=100:1，分别洗脱2，3个柱体积。并将所得洗脱液分别命名为Fr-l，Fr-2。将Fr_2等体积硅胶拌样，使用硅胶为100目正相硅胶，五倍体积硅胶层析，使用的硅胶为200—300目正相硅胶。洗脱剂为石油醚与丙酮。减压浓缩洗脱液，使用甲醇氯仿=1:1溶解，氯仿甲醇凝胶柱层析，洗脱剂为氯仿甲醇=1:1。使用TLC检测收集的洗脱液，展开剂为石油醚丙酮=20 :1，合并出现斑点的洗脱液，减压蒸干，进行ID-HNMR核磁共振分析，频率为400MHZ，分析结果为 δ 6. 90 - 6. 79 (m, 1H)，6. 76 (d, J = 8. O Hz, 1H)，6. 70 (d, J =1. 3Hz, 1H), 6. 62 (s，1H), 2. 24 (s, 4H) ·证明是 4-甲基-1，2-苯二酚。实例2:
桑黄粗提物，由下述方法制得
(1)发酵培养基配方以克/100毫升计是
玉米淀粉 3%葡萄糖 2%
蛋白胨 0.5%酵母膏 0.5%
硫酸镁 0.5%磷酸二氢钾0.0 5%
(2)将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以30°C温度，摇瓶转速为180r/min，pH6条件下，震动培养15天；培养中当pH值降到2. 5时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度30°C，发酵罐压力0.2公斤/平方厘米，pH 3，通气量O. 5-1. lvvm,搅拌速度180转/分的条件，培养15天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物；
(3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5 ；
(4)用体积百分比为90%的乙醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入乙醇的量是浓缩液体积的4倍，能够使提取液中乙醇浓度达到70% ；
(5)对步骤(4)所得提取液在55°C条件下，加热2.5小时；以常规方法进行分离，并通过二级过滤除去杂质，分离获得乙醇提取液；将上述乙醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/10 ;
(6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物。将上述沉淀物称取200g与等体积100目正相硅胶混匀搅拌，进行硅胶正相柱层析。层析固定相为200-300目正相硅胶，柱高O. 8m，直径15cm，洗脱剂为分别为氯仿，氯仿甲醇=100:1，分别洗脱3，4个柱体积。并将所得洗脱液分别命名为Fr-l，Fr-2。将Fr_2等体积硅胶拌样，使用硅胶为100目正相硅胶，五倍体积硅胶层析，使用的硅胶为200—300目正相硅胶。洗脱剂为石油醚与丙酮。减压浓缩洗脱液，使用甲醇氯仿=1:1溶解，氯仿甲醇凝胶柱层析，洗脱剂为氯仿甲醇=1:1。收集洗脱液，使用TLC检测各洗脱液，展开剂为石油醚丙酮=40:1，合并收集出现斑点的洗脱液。减压干燥，进行ID-HNMR核磁共振分析，频率为 400MHZ，分析结果为 δ 6. 90 - 6. 79 (m, 1H)，6. 76 (d, J = 8. O Hz, 1H)，6. 70(d, J =1. 3 Hz, 1H), 6. 62 (s, 1H)，2. 24 (s, 4H) ·证明是 4-甲基-1，2-苯二酚。
权利要求
1.桑黄菌中甲基苯ニ酚的分离方法，其步骤顺序如下 (1)制备桑黄粗提物； (2)将步骤(I)中所得的こ醇沉淀物与正相硅胶混匀搅拌，干燥后进行硅胶正相柱层析，用洗脱剂洗脱2-5次，得到洗脱液； (3)将步骤(2)中最后一次洗脱液蒸干，等体积硅胶拌样，进行正相硅胶层析，用洗脱剂洗脱； (4)收集步骤(3)中的洗脱液，减压浓缩，使用氯仿甲醇=1:1溶解，甲醇凝胶柱层析，使用洗脱剂洗脱； (5)收集步骤(4)得到的洗脱液，使用TLC检测各洗脱液，适度合并洗脱液，减压干燥，即为甲基苯ニ酚。
2.如权利要求1所述的ー种从桑黄菌中分离苯こ醇的方法，其特征在于所述桑黄粗提物，由下述方法制得 (1)发酵培养基配方以克/100毫升计是 玉米淀粉 1-5%葡萄糖 1-5% 蛋白胨 0.1-0.5%酵母膏 0.1-0.5% 硫酸镁 0. 1-0. 5%磷酸ニ氢钾0. 01-0. 05% (2)如权利要求1所述桑黄粗提物的发酵培养方法是，将桑黄菌种以常规方法接种到装有液体培养基的三角烧瓶内，以20 35°C温度，摇瓶转速为80 280r/min，pH 3 8条件下，震动培养7 15天；培养中当pH值降到2. 5 4时，将摇瓶中的种子接种到50L发酵罐的培养液中，以温度20 35°C，发酵罐压カ0.1 0. 2公斤/平方厘米，pH 3 8，通气量0. 5 1.1vvm,搅拌速度100 280转/分的条件，培养7 15天，即可利用桑黄菌丝体发酵全液制备桑黄粗提物； (3)取步骤(2)中所得桑黄菌丝体发酵全液，将其以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/2 1/5 ； (4)用体积百分比为60 95%的こ醇对上述步骤(3)浓缩后的发酵液进行提取，其中，加入こ醇的量是浓缩液体积的2 5倍，能够使提取液中こ醇浓度达到60 90% ； (5)对步骤(4)所得提取液在50 70°C条件下，加热I 2小吋；以常规方法进行分离，并通过ニ级过滤除去杂质，分离获得こ醇提取液；将上述こ醇提取液以常规方式减压浓缩，使其体积浓缩到原体积的1/5 1/10 ； (6)将将步骤(5)所得的浓缩液以低温冷冻干燥的方法进行干燥，得桑黄粗提物； 如权利要求1所述的桑黄菌中甲基苯ニ酚的分离方法，其特征在于所述的甲基苯ニ酚为4-甲基-1，2-苯ニ酚。
3.如权利要求1所述的桑黄菌中甲基苯ニ酚的分离方法，其特征在于，步骤(2)中所述的拌样硅胶为100-200目正相硅胶。
4.如权利要求1所述的桑黄菌中甲基苯ニ酚的分离方法，其特征在于，步骤(2)中所述的层析硅胶为正相200-300目，洗脱剂为氯仿和/或甲醇。
5.如权利要求1所述的桑黄菌中甲基苯ニ酚的分离方法，其特征在于，步骤(3)中所述的硅胶用量为等体积，洗脱剂为石油醚丙酮=20 :1-40:1。
6.如权利要求1所述的桑黄菌中甲基苯ニ酚的分离方法，其特征在于，步骤(4)中所述的凝胶为Sephadex LH-20,洗脱剂为氯仿甲醇=1:1。
7.如权利要求1所述的桑黄菌中甲基苯ニ酚的分离方法，其特征在于，步骤(5)所述的检测要点是出现粉红色斑点，展开剂为石油醚丙酮=20 :1-40:1。
全文摘要
本发明公开了一种桑黄菌(火木层孔菌Phellinusigniarius(LexFr)Quel、裂蹄木层孔菌phellinuslinteus(BerketCurt)Teng、鲍氏层孔菌、哈蒂针层孔菌Phellinushartigii(AlleschetSchnabl)Imaz)中甲基苯二酚的分离技术。首先制备桑黄菌粗提物，然后是正相硅胶层析，使用氯仿与甲醇梯度洗脱，重复一次正相硅胶层析，接着进行氯仿甲醇凝胶层析，最后减压蒸干得到甲基苯二酚。
文档编号C07C37/82GK103044208SQ201210546460
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月15日 优先权日2012年12月15日
发明者宋爱荣, 赵晨, 孙效乐, 黄芳, 田雪梅 申请人:青岛农业大学