用于调节铁稳态的组合物及其使用方法
【专利摘要】本公开涉及血幼素-IgG?Fc结构域融合蛋白及由其衍生的变体、衍生物、片段和肽模拟物，以及利用这些融合蛋白调节铁稳态和治疗铁稳态相关疾病的方法。
【专利说明】用于调节铁稳态的组合物及其使用方法
[0001]相关申请
[0002]本申请要求2011年I月19日提交的美国临时专利申请号61/434，405的优先权，该临时专利申请的全文通过引用纳入本文。
【技术领域】
[0003]本公开总体涉及铁稳态紊乱的治疗、预防和改善，尤其与贫血的管理相关。本公开更具体地涉及血幼素(hemojuvelin)-免疫球蛋白Fe结构域融合蛋白及由其衍生的变体、衍生物和肽模拟物以及利用这些组合物改变人体内的血清铁、血清血红蛋白和/或血细胞比容水平的方法。
【背景技术】
[0004]铁是几乎每种有机体的生长和生存所需要的必需元素。红血球(RBC)含有血红蛋白(Hb)，一种红色的、富含铁的蛋白，其从肺部携带氧气至身体的所有肌肉和器官，在这些肌肉和器官中血红蛋白反应以提供身体正常活动所需的能量。当红血球数目或它们含有的血红蛋白数量降至低于正常水平时，身体接收到比其发挥正常功能所需更少的氧气、产生更少的能量。这种情况通常称为贫血。婴儿和儿童贫血的常见原因是铁缺乏。美国多达20%的儿童以及发展中国家中80%的儿童在18岁以前的某个时间会患有贫血。Martin，P.L.等，The Anemias, Principles and Practices of Pediatrics (儿科贫血、原理与实践)，1657 (Lippincottl994,第二版)。
[0005]哺乳动物中，铁平衡主要在十二指肠吸收膳食中的铁这个水平调节。在人类中，遗传性血色素沉着病(HH)是由膳食铁过量吸收引起的一种常见的常染色体隐性遗传疾病，导致血浆和多个器官(尤其包括胰腺、肝脏、和皮肤)中铁超负荷，并由于铁沉积而引起这些器官和组织的损伤。
[0006]青少年血色素沉着病是一种由编码主要的铁调节激素铁调素(HAMP)和血幼素(HFE2)的基因突变而引起的铁超负荷紊乱(Roetto，A.，等.2003.Nut.Genet.33:21-22 ；Papaniko I aou, G.,等2004.Nut.Genet.36:77-82.)。已证明血幼素是骨形态发生蛋白(BMP)的辅助受体，血幼素介导的BMP信号调节铁调素表达和铁代谢(Babitt，J.L.，等2006.Nat.Genet.38:531-539 ；Babitt, J.L.，等.2007.J Clin Invest.117:1933-1939.)。然而，铁调素在体内的内源BMP调节子是未知的。
[0007]血幼素(也称为RGMc)是排斥导向分子(Repulsive Guidance Molecules)蛋白家族的成员，该家族包括RGMa和DRAGON(RGMb)，它们有50-60 %的氨基酸同一性(Samad，Τ.A.，等 2004.J.Neurosc1.24:2027-2036.)。
[0008]需要一种成本有效的、高效的方法来调节铁调素表达和铁代谢。
【发明内容】
[0009]本公开提供血幼素(“HJV”)-免疫球蛋白Fe结构域融合蛋白。本公开还提供利用这些蛋白治疗铁稳态紊乱的方法。HJV可以是哺乳动物HJV。更具体地，HJV可以是小鼠或人HJV。
[0010]本公开还提供组合物，该组合物含有与SEQ ID NO:9的序列95%相同的融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物或肽模拟物。一种实施方式中，所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物或肽模拟物的经尺寸排阻色谱确定的纯度至少为98%。另一种实施方式中，所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物或肽模拟物是糖基化的。某些实施方式中，SEQ IDN0.1和SEQ ID N0.9的天冬酰胺83、天冬酰胺178和天冬酰胺337是N-糖基化位点。在该实施方式的一个方面，糖基化模式是哺乳动物糖基化模式。具体而言，糖基化模式来自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
[0011]另一种实施方式中，所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物或肽模拟物的N-末端氨基酸是谷氨酰胺。在该实施方式的一个方面，所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物或肽模拟物的N-末端是QCKILRCNAE (SEQ ID NO: 10)。另一种实施方式中，N-末端片段可以是来自SEQ ID NO:1或9的头150个氨基酸的任何片段。
[0012]另一种实施方式中，组合物是基本无热原的。另一种实施方式中，所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物或肽模拟物的血清半衰期是至少10小时。另一种实施方式中，所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物或肽模拟物以Kd至少为10_7M结合骨形态发生蛋白-6( “BMP-6”)，并抑制BMP-6信号转导。另一种实施方式中，将组合物给予对象时组合物增加对象的血细胞比容。另一种实施方式中，将组合物给予贫血对象一个月或更长时间时,组合物增加贫血对象的血细胞比容至至少正常水平。
[0013]另一种实施方式中，所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物或肽模拟物形成同型二聚体。在该实施方式的一个方面，同型二聚体在Fe铰链区内形成。更具体而言，同型二聚体通过SEQ ID NO:9中的半胱氨酸373、380和/或383之间的化学相互作用而形成。具体而言，化学相互作用是二硫键。
[0014]本公开还提供了编码所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物的核酸分子。一种实施方式中，所述核酸分子包含与SEQ ID NO:11的序列95%相同的序列。
[0015]本公开还提供哺乳动物细胞，所述细胞包含编码所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物的核酸分子。一种实施方式中，所述细胞是CHO细胞。
[0016]本公开还提供治疗对象中导致贫血的铁稳态紊乱的方法，该方法通过给予有需要的对象治疗有效量的上述组合物，从而治疗铁稳态紊乱并改善贫血。
[0017]本公开还提供组合物，其包含融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物，其中所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物包含N-末端多肽和C-末端多肽，其中所述N-末端多肽包含与SEQ ID NO:3的序列95%相同的序列，并且其中所述C-末端多肽包含与选自SEQ ID N0:4、5、6、7和8的序列95%相同的序列。一种实施方式中，所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物的经尺寸排阻色谱确定的纯度至少为98%。
[0018]另一种实施方式中，所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物是糖基化的。在该实施方式的一个方面，糖基化模式是哺乳动物糖基化模式。具体而言，糖基化模式来自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。[0019]另一种实施方式中，所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物的N-末端氨基酸是谷氨酰胺。在该实施方式的一个方面，所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物的N-末端是QCKILRCNAE (SEQ ID NO:10)。
[0020]另一种实施方式中，所述组合物是基本无热原的。另一种实施方式中，所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物或肽模拟物的血清半衰期是至少10小时。另一种实施方式中，所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物或肽模拟物以Kd至少为10_7M结合骨形态发生蛋白-6( “BMP-6”)，并抑制BMP-6信号转导。另一种实施方式中，将组合物给予对象时组合物增加对象的血细胞比容。另一种实施方式中，将组合物给予贫血对象一个月或更长时间时,组合物增加贫血对象的血细胞比容至至少正常水平。
[0021]本公开还提供编码所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物的核酸分子。一种实施方式中，所述核酸序列包含SEQ ID NO:llo
[0022]本公开还提供哺乳动物细胞，所述细胞包含编码所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物的核酸序列。一种实施方式中，所述细胞是CHO细胞。
[0023]本公开还提供治疗有需要的对象的铁稳态紊乱和/或改善贫血的方法，该方法通过给予所述对象治疗有效量的上述组合物，从而治疗铁稳态紊乱和/或改善贫血。
[0024]本公开还提供治疗有需要的对象的癌症的方法，该方法通过给予所述对象治疗有效量的上述组合物，从而治疗癌症。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1表示SEQ ID Ν03-7的氨基酸序列的比对。
[0026]图2表示HJV.Fe 二聚体的结构示意。
[0027]图3是线型图，表示与对照大鼠比较，给予了 20mg/kg HJV.Fe的贫血大鼠中血清血红蛋白的水平。
[0028]图4是线型图，表示与对照大鼠比较，给予了 2或20mg/kg HJV.Fe的贫血大鼠中血清血红蛋白的水平。
[0029]图5是柱状图，表示与对照大鼠比较，给予了 20mg/kg HJV.Fe的贫血大鼠中血细胞比容的水平。
[0030]图6是柱状图，表示与对照大鼠比较，给予了 20mg/kg HJV.Fe的贫血大鼠中的血清铁。
[0031]图7A的图用来自Biacore结合试验的数据表示HJV.His (同型二聚体)对BMP6的亲和力。
[0032]图7B的图用来自Biacore结合试验的数据表示HJV.His (同型二聚体)对BMP6的亲和力。
[0033]图8显示在基于细胞的生物抑制试验中HJV.Fe有效抑制BMP6活性。
[0034]图9显示通过HPLC分析，纯度> 95%的同型二聚体HJV.Fe的单体的制备物。
【具体实施方式】
[0035]发明人发现了用于治疗贫血的新的治疗组合物。这些组合物是包含血幼素(“HJV”)和IgG Fe区的融合蛋白及由其衍生的变体、衍生物、片段和肽模拟物。本公开提供融合蛋白，该融合蛋白包含肽，所述肽包含融合于IgG Fe区或其衍生物的至少一部分HJV氨基酸序列。某些实施方式中，融合蛋白的HJV部分是融合蛋白的N-末端部分，融合蛋白的IgG Fe部分是C-末端部分。其它实施方式中，融合蛋白的HJV部分是融合蛋白的C-末端部分,融合蛋白的IgG Fe部分是N-末端部分。
[0036]某些实施方式中，融合蛋白的N-末端和C-末端部分以连接子连接。【具体实施方式】中，连接子是长度为I至50个氨基酸的多肽。更具体的实施方式中，连接子的长度为2至25个氨基酸。更具体的实施方式中，连接子的长度为3至15个氨基酸。更具体的实施方式中，连接子的长度是4、5、6、7、8或9个氨基酸。一种优选的实施方式中，连接子的长度是5个氨基酸。某些实施方式中，连接子可富含甘氨酸和脯氨酸残基，并可例如含有苏氨酸/丝氨酸和甘氨酸的单一序列或苏氨酸/丝氨酸和甘氨酸(例如TG)的重复序列。某些实施方式中，可在连接子(如果有)和或Fe蛋白中产生突变以改变蛋白的半衰期。
[0037]给予本公开的融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段和肽模拟物导致铁调素表达下降。本文描述的组合物可用于治疗铁代谢紊乱和增加血清血红蛋白和血细胞比容。
[0038]HJV 部分
[0039]本文描述的融合蛋白的人血幼素(“HJV”)部分含有HJV的可溶性部分，该可溶性部分能够增加铁的动员(mobilization)和/或治疗或改善与铁代谢疾病相关的至少一种症状。某些实施方式中，本公开融合蛋白的HJV部分与SEQ ID NO:1的一部分至少75%(例如，至少80%、 至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99 % )相同。
[0040]HJV的氨基酸序列示于下表1:
表1.没有N-末端信号序列或C-末端GPI结构域的人HJV氨基酸 序列(364个氨基酸；SEQ ID NO:1)
102030405060
QCKILRCNAE YVSSTLSLRG GGSSGALRGG GGGGRGGGVG SGGLCRALRS YALCTRRTAR
708090100HO120
TCRGDLAFHS AVHGIEDLMI QHNCSRQGPT APPPPRGPAL PGAGSGLPAP DPCDYEGRFS
130140150160170180
[0041]RLHGRPPGFL HCASFGDPHV RSFHHHFHTC RVQGAWPLLD NDFLFVQATS SPMALGAI^AT
190200210220230240
ATRKLTIIFK NHQECIDQKV YQAEVDNLPV AFEDGSINGG DRPGGSSLSI QTANPGNHVE
250260270280290300
IQAAYIGTTI IIRQTAGQLS FSIKVAEDVA MAFSAEQDLQ LCVGGCPPSQ RLSRSERNRR
310320330340350360
LCKEGLPVED AYFHSCVFDV LISGDPNFTV AAQAALEDAR AFLPDLEKLH
364
LFPS
[0042]某些实施方式中，本文描述的融合蛋白的HJV部分是SEQ ID NO:1的任意片段，其可溶于水溶液并能够动员(mobilize)铁和/或治疗或改善与铁代谢疾病相关的至少一种症状。组成本公开融合蛋白的HJV部分的SEQ ID NO:1片段包含SEQ ID NO:1的10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350 或 360 个氨基酸的片段。这些片段可包含SEQ ID NO:1的任何范围的氨基酸。某些【具体实施方式】中，片段包含SEQ ID NO:1的氨基酸 1-150 的 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140 或 150 个氨基酸。某些实施方式中，本公开融合蛋白的HJV部分与SEQ ID勵:1片段的同一性大于80、85、90、95、97、98、或99%，其中所述片段包含SEQ ID NO:1 的 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350 或 360 个氨基酸。
[0043] 组成本公开融合蛋白的HJV部分的SEQ ID NO:1片段包含SEQ ID NO:1的10、20、
30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350 或 360 个连续氨基酸的片段。某些实施方式中，本公开融合蛋白的HJV部分与SEQ ID NO:1片段的同一性大于80、85、90、95、97、98、或99%，其中所述片段包含SEQ ID NO:1 的 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350 或 360 个连续氨基酸。
[0044]某些实施方式中，本公开融合蛋白的HJV部分是全长的或者是片段并且与SEQ IDNO:1的同一性大于75%。其它实施方式中，本公开融合蛋白的HJV部分是全长的或者是片段并且与SEQ ID NO:1的同一性大于80、85、90、95、97、98、或99%。某些【具体实施方式】中，SEQ ID NO:1和本公开融合蛋白的HJV部分的差异是保守氨基酸改变，如下所述。
[0045]IgG Fe 部分
[0046]本公开融合蛋白的IgG Fe部分包含免疫球蛋白Fe区的至少一部分或其衍生物，当与本公开融合蛋白的HJV部分融合时，能够动员铁和/或治疗或改善与铁代谢疾病相关的至少一种症状。当给予对象时，本公开融合蛋白的IgG Fe部分稳定融合蛋白。【具体实施方式】中，连接IgG Fe或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物使得血清蛋白的血清半衰期大于 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、15、17、18、19、20、21、22、23、24、36、48、60、72、84、或96小时。有几个序列与本公开的融合蛋白相容。
[0047]某些实施方式中，IgG Fe结构域包含CH2和CH3结构域以及铰链区。其它实施方式中，IgG Fe还包含CHl区的至少一部分。【具体实施方式】中，融合蛋白的HJV部分直接连接于铰链区。其它实施方式中，Fe结构域包含来自CHl结构域的在铰链区N-末端的序列，该序列连接于融合蛋白的HJV部分。其它实施方式中，连接子连接于Fe结构域的铰链区或CHl结构域。更具体的实施方式中，铰链区包含4个氨基酸，共有序列为X1-P-X2-XjSEQ IDNO:2)，其中X1为半胱氨酸或丝氨酸，X2为亮氨酸或脯氨酸，X3为半胱氨酸或丝氨酸。完整免疫球蛋白的铰链区为蛋白提供了充分的柔性以进行有效的抗原-抗体结合。本公开的某些实施方式中，将铰链区包括在本公开融合蛋白的IgG Fe部分中以维持其柔性，尤其是当融合蛋白为二聚体形式时。
[0048]某些实施方式中，本公开融合蛋白的IgG Fe部分与SEQ ID NO:3的一部分至少75% (例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99% )相同。
【权利要求】
1.组合物，该组合物包含与SEQID NO:9的序列95%相同的融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物。
2.权利要求1的组合物，其中所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物经尺寸排阻色谱确定纯度为至少98%。
3.权利要求1的组合物，其中所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物是糖基化的。
4.权利要求3的组合物，其中所述糖基化模式是哺乳动物糖基化模式。
5.权利要求4的组合物，其中天冬酰胺83、天冬酰胺178和/或天冬酰胺337是糖基化的。
6.权利要求4的组合物，其中所述糖基化模式来自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
7.权利要求1的组合物，其中所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物的N-末端氨基酸是谷氨酰胺。
8.权利要求7的组合物，其中所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物的N-末端氨基酸的N-末端是QCKILRCNAE (SEQ ID NO: 10)。
9.权利要求1的组合物，其中SEQID NO:9的片段包含SEQ ID NO:9的N-末端的150个氨基酸。
10.权利要求1的组合物，其中所述组合物基本无热原。
11.权利要求1的组合物，其中所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物的血清半衰期是至少10小时。
12.权利要求1的组合物，其中所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物以Kd至少为10_7M结合骨形态发生蛋白-6 ( “BMP-6” )，并抑制BMP-6信号转导。
13.权利要求1的组合物，其中当给予所述组合物时，所述组合物增加对象的血红蛋白和/或血细胞比容。
14.权利要求1的组合物，其中当将所述组合物给予贫血对象达一个月或更长时间时，所述组合物增加所述贫血对象的血红蛋白和/或血细胞比容至至少正常水平。
15.权利要求1的组合物，其中所述融合蛋白形成同型二聚体。
16.权利要求15的组合物，其中所述同型二聚体通过SEQID NO:9的半胱氨酸373、380和/或383之间的化学相互作用而形成。
17.权利要求16的组合物，其中所述化学相互作用是二硫键。
18.编码权利要求1的融合多肽的核酸分子。
19.权利要求18的核酸分子,其中所述核酸分子包含与SEQID NO:2的序列95%相同的序列。
20.包含权利要求19的核酸序列的哺乳动物细胞。
21.权利要求20的哺乳动物细胞，其中所述细胞是CHO细胞。
22.治疗有需要的对象的铁稳态紊乱的方法，该方法通过给予所述对象治疗有效量的权利要求1的组合物，从而治疗铁稳态紊乱。
23.组合物，其包含融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物，其中所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物或肽模拟物包含N-末端多肽和C-末端多肽，其中所述N-末端多肽包含与SEQ ID NO:3的序列95%相同的序列，并且其中所述C-末端多肽包含与选自SEQ ID NO:4、5、6、7和8的序列95%相同的序列。
24.权利要求23的组合物，其中所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物经尺寸排阻色谱确定纯度为至少98%。
25.权利要求23的组合物，其中所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物是糖基化的。
26.权利要求25的组合物，其中所述糖基化模式是哺乳动物糖基化模式。
27.权利要求26的组合物，其中所述糖基化模式来自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
28.权利要求23的组合物，其中所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物的N-末端氨基酸是谷氨酰胺。
29.权利要求28的组合物，其中所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物的N-末端氨基酸的N-末端是QCKILRCNAE (SEQ ID NO: 10)。
30.权利要求23的组合物，其中所述组合物基本无热原。
31.权利要求23的组合物，其中所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物的血清半衰期是至少10小时。
32.权利要求23的组合物，其中所述融合蛋白或由其衍生的变体、衍生物、片段或肽模拟物以Kd至少为10_7M结合骨形态发生蛋白-6 ( “BMP-6” )，并抑制BMP-6信号转导。
33.权利要求23的组合 物，其中当给予所述组合物时，所述组合物增加对象的血细胞比容。
34.权利要求23的组合物，其中当将所述组合物给予贫血对象达一个月或更长时间时，所述组合物增加所述贫血对象的血细胞比容至至少正常水平。
35.权利要求23的组合物，其中所述融合蛋白形成同型二聚体。
36.编码权利要求23的融合多肽的核酸分子。
37.权利要求36的核酸，其中所述核酸包含SEQID NO:11的核酸序列。
38.包含权利要求36的核酸序列的哺乳动物细胞。
39.权利要求38的哺乳动物细胞，其中所述细胞是CHO细胞。
40.治疗有需要的对象的铁稳态紊乱和/或改善有需要的对象的贫血的方法，该方法通过给予所述对象治疗有效量的权利要求21的组合物，从而治疗铁稳态紊乱和/或改善贫血。
41.治疗有需要的对象的癌症的方法，该方法通过给予所述对象治疗有效量的权利要求I的组合物，从而治疗癌症疾病。
42.治疗有需要的对象的癌症的方法，该方法通过给予所述对象治疗有效量的权利要求23的组合物，从而治疗癌症疾病。
【文档编号】C07K1/16GK103649126SQ201280013021
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2012年1月19日 优先权日:2011年1月19日
【发明者】赫伯特·Y·林, 朱迪·L·巴比特, 特蕾西·曼哈尔, 帕特里克·吉尔林 申请人:菲卢马克斯制药公司, 通用医疗公司