拮抗cd40之抗体多肽的制作方法
【专利摘要】本发明提供特异性结合人类CD40之新颖抗原决定基的抗体多肽。该等抗体多肽不展现CD40促效剂活性。该等抗体多肽适用于治疗涉及CD40活化之疾病，诸如自体免疫疾病。该等抗体多肽可为包含单一VL或VH域之域抗体(domain?antibody，dAb)。该等抗体多肽之半衰期可藉由将该等抗体多肽修饰成亦可结合人类血清白蛋白(human?serum?albumin，HSA)之双特异性试剂而增加。
【专利说明】拮抗CD40之抗体多肽
发明领域
[0001]本发明提供靶向CD40且不展现CD40促效剂活性之抗体及其片段、包含前述者之组合物及使用前述者治疗涉及CD40活性之疾病的方法。
相关申请的交叉引用
本发明要求2011年4月21日提交的美国临时申请61/477，904的权益，在此将其全部内容援引并入本申请。 [0002]序列表
[0003]本申请案含有ASCII格式之序列表且其据此以全文引用的方式并入本文中。2012年4月17日创建之该ASCII复本被命名为200896W0.txt且大小为1，188，530字节。
现有技术
[0004]0)40为属于存在于抗原呈现细胞(antigen presenting cell,APC)(包括树突状细胞、B细胞及巨卩遼细胞)上之肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)受体超家族之协同刺激分子。APC在⑶40结合TH细胞上之其配位体⑶154 (⑶40L)时活化。⑶40介导之APC活化涉及多种免疫反应，包括细胞激素产生、协同刺激分子(诸如⑶86)之上调及抗原呈现及B细胞增殖增强。CD40亦可由内皮细胞、平滑肌细胞、纤维母细胞及上皮细胞表现。
[0005]CD40活化亦涉及多种与例如自体免疫性、移植排斥反应或过敏反应相关之不当T细胞反应。控制不合乎需要之T细胞反应的一个策略为以拮抗性抗体靶向CD40。举例而言，先前称为Chironl212之单株抗体HCD122(鲁卡木单抗(Lucatumumab))有关治疗某些CD40介导之发炎性疾病目前处于临床试验阶段。参见因特网之超文本传送协议:clinicaltrialsfeeds.0rg/clinical-trials/show/NCTO1275209 (2011 ^ I 月 11 日最后更新)上之 “Study of HCD122 (Lucatumumab) and Bendamustine Combination Therapyin CD40+Rituximab-Refractory Follicular Lymphoma，，，Clinical Trials Feeds。然而，单株抗体可显示促效剂活性。举例而言，抗⑶40抗体Chi220之适用性受限于其弱刺激潜能。参见 Adams 等人，“Development of a chimeric ant1-CD40monoclonalantibody that synergizes with LEA29Y to prolong islet allograft survival，，，J.1mmunol.174:542-50(2005)。
【发明内容】
[0006]在临床环境中仍需要不具有部分促效剂活性之抗CD40抗体拮抗剂。本发明提供特异性结合人类CD40之新颖抗原决定基之新颖抗体多肽。如由竞争分析及由自抗体多肽与CD40共结晶得到之结构所示，CD40抗原决定基不与Chi220抗原决定基重迭。该等抗体多肽有利的是不展现CD40促效剂活性。该等抗体多肽适用于治疗涉及CD40活化之疾病，包括自体免疫疾病、移植排斥反应及过敏反应。该等抗体多肽包含可变域。在一个实施例中，抗体多肽呈含有单一可变域之域抗体(dAb)形式。在另一个实施例中，dAb为包含可结合例如人类血清白蛋白(HSA)之第二可变域之双特异性试剂。
[0007]本发明提供一种包含第一可变域之抗体多肽，其中该抗体多肽特异性结合人类CD40之抗原决定基，其中该抗原决定基包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列，其中该抗体多肽与域抗体(dAb)BMS3h-56-269(SEQ ID NO: 417)竞争结合，且其中该抗原决定基包含至少一个选自由 Trpl09、Leul21、Hisl22、Serl24、Serl56、Alal57、Phel58、Glul59 及 Hisl62 组成之群的CD40氨基酸残基。
[0008]进一步提供一种抗体多肽，其中第一可变域包含选自由BMS3h_37、BMS3h_38、BMS3h-56及BMS 3h-198组成之谱系群的抗体多肽之一之氨基酸序列，且其中第一可变域之表观结合常数为IpM至ΙΟΟηΜ。进一步提供一种抗体多肽，其中第一可变域之表观结合常数为 IpM 至 IOnM0
[0009]亦提供一种抗体多肽，其中第一可变域之氨基酸序列包含(a)与BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417)之CDRl区有至多两个氨基酸不同的CDRl区、(b)与BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417)之CDR2区有至多两个氨基酸不同的CDR2区、(c)与BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417)之CDR3区有至多两个氨基酸不同的CDR3区、(d)与BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417)之FRl区有至多两个氨基酸不同的FRl区、(e)与BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417)之FR2区有至多两个氨基酸不同的FR2区、(f)与BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417)之FR3区有至多两个氨基酸不同的FR3区及(g)与BMS3h-56-269 (SEQ ID N0:417)之FR4区有至多两个氨基酸不同的FR4区。
[0010]亦提供一种抗体多肽，其中第一可变域之氨基酸序列包含(a)与BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417)之CDRl区有至多两个氨基酸不同的CDRl区、(b)与BMS3h-56-269 (SEQ ID NO:417)之CDR2区有至多两个氨基酸不同的CDR2区、(c)与BMS3h-56-269 (SEQ ID N0:417)之CDR3区有至多两个氨基酸不同的CDR3区。
[0011]进一步提供一种抗体多肽，其中第一可变域之氨基酸序列与BMS3h-56-258(SEQID NO: 10)或BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417)之氨基酸序列有至多10个氨基酸不同。
[0012]进一步提供一种抗体多肽，其中第一可变域之氨基酸序列与BMS3h-56_258(SEQID NO: 10)或BMS3h-56-269 (SEQ ID N0:417)之氨基酸序列有至多5个氨基酸不同。
[0013]进一步提供一种抗体多肽，其中第一可变域之氨基酸序列与BMS3h-56_258(SEQID NO: 10)或BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417)之氨基酸序列有两个氨基酸不同。
[0014]进一步提供一种抗体多肽，其中第一可变域之氨基酸序列与BMS3h-56_258(SEQID NO: 10)或BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417)之氨基酸序列有一个氨基酸不同。
[0015]进一步提供一种抗体多肽，其中该抗体多肽选自BMS3h_56之谱系群，且其中第一可变域之氨基酸序列进一步包含:(a)具有序列X1-Tyr-Glu-Y1-Trp (SEQ ID NO: 1274)之CDRl 区，其中 X1 SAsp 或 Gly，且 Y1 SMet 或 Leu ； (b)具有序列 Ala-1Ie-Asn-Pro-X2-Gly-Y2-Z2-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-A2-Gly (SEQ ID NO: 1275)之 CDR2 区，其中 X2 为 Gin、Tyr> Pro、Trp 或 Ala, Y2 为 Thr> Ser、Asn、Gly、Met 或 Gin, Z2 为 Arg、Leu、Tyr> His 或 Phe,且 A2 SLys 或 Met ;及(c)具有序列 X3-Pro-Y3-Z3-Phe-A3-B3 (SEQ ID NO: 1276)之 CDR3 区，其中 X3 为 Leu 或 Pro, Y3 为 Phe、Gin、Thr 或 Met, Z3 为 Tyr>Pro> Leu> Thr> lie、Phe 或 Met,A3 为 Gin、His、Asp、Ser> Lys> Glu 或 Gly,且 B3 为 Glu、Asp 或 Tyr。
[0016]进一步提供一种抗体多肽，其中第一可变域之氨基酸序列包含:(a)具有序列Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly—Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Gly-Ser-X1-Ar g_Leu_Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-Thr-Phe-Y1 (SEQ ID NO: 1277)之 FRl 区，其中 X1 为 Leu 或Arg,且 Y1 为 Arg 或 Ala ； (b)具有序列 Trp-Val-Arg-X2-Ala-Pro-Gly-Y2-Z2-Leu-Glu-Arg-Val-Ser (SEQ ID NO: 1278)之 FR2 区，其中 X2 为 Gln 或 Arg, Y2 为 Lys 或 Arg,且 Z2 为 Gly 或Val ; (c)具有序列 Arg-Phe-Thr-1le-Ser-Arg-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-X3-Lys-Tyr-Leu-GlI1-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Y3-Asp-Thr-Z3-Val-Tyr-A3-Cys-B3-Lys (SEQ ID NO: 1279)之FR3 区，其中 X3 SThr 或 Met，Y3 SGlu 或 Asp，Z3 SAla 或 Ser，A3 STyr 或 His，且 B3 SAla或Thr ;及(d)具有序列 X4-Gly-Y4-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Z4 (SEQ ID NO: 1280)之FR4 区，其中 X4 为 Trp 或 Arg，Y4 为 Gln 或 Ρι?，且 Z4 为 Ser 或 Asn。
[0017]进一步提供一种抗体多肽，其中第一可变域包含BMS3h-56-258(SEQ ID N0:10)或BMS3h-56-269 (SEQ ID N0:417)之氨基酸序列。
[0018]进一步提供一种抗体多肽，其中该抗体多肽选自BMS3h_37之谱系群，其中第一可变域包含序列 Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-XfPro-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-Thr-Phe-Glu-Trp-Tyr-Glu-Met-Gln-Trp-Val-Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Lys-Gly-Leu-Glu-Trp-Val-Ser-Ala-1le-Ser-Gly-Asp-Gly-Tyr-Arg-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-1le-Ser-Arg-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-Thr-Leu-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-Tyr-Cys-Ala-Lys-Y1-Leu-Z1-A1-Phe-Asp-Tyr-B1-Gly-Arg-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser(SEQ ID NO: 1281);且其中 X1 为 Gln 或 Arg J1 为 Glu 或 Gly J1 为 Ala、Leu 或 Glu 为 Phe
[0019]或Tyr ;且 B1 为 Trp 或 Arg。
[0020]亦提供一种抗体多肽，其中该抗体多肽选自BMS3h_38之谱系群，其中第一可变域包含序列 Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cy S-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-X1-Phe-Glu-Glu-Glu-Glu-Met-1 Ie-TrP-Val-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Gly-Leu-Glu-Trp-Val-Ser-Y1-1le-Ser-Z1-A1-Gly-B^c1-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-1le-Ser-Arg-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-Thr-Leu-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-TyT-Tyr-Cys-Gly-Lys-Glu-Pro-Phe-D1-Tyr-Asp-Tyr-Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser (SEQ ID NO: 1282);且其中 X1 为 Thr 或 Pro -J1 为 Ala 或 Ser ；Z,为 Arg 或Gly 为 Arg、Ser、Asn、Gin、Gly、His 或 Leu 为 TyrΛ Phe、Trp 或 Gly ；
[0021]C1 为 Ser 或 Gly ;且0丨为 Arg、Met 或 Pro。
[0022]亦提供一种抗体多肽，其中该抗体多肽选自BMS3h_198之谱系群，其中第一可变域包含序列 Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-Thr-Phe-Ala-Gly-Try-Glu-X1-Trp-Trp-Y^Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Gly-Leu-Glu-Arg-Val-Ser-Ala-1le-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-1le-Ser-Arg-Asp-Z1-A1-Lys-Asn-Thr-Leu-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-B1-CYs-Ala-C1-D1-Pro-Tyr-Ser-E1-Asp-Tyr-F1-G1-H1-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser (SEQID NO: 1283);且其中 X1 为 Met 或 Leu -J1 为 Val 或 Phe ；Z,为 Asp 或 Asn ；A,为 Ser 或 Thr ；B1 为 Tyr 或 His 为 Lys 或 Arg 为 Asp 或 Glu 为 Tyr 或 Phe 为 Trp
[0023]或Arg 为 Gly 或 Arg ;且 H1 为 Gln 或 His。
[0024]进一步提供一种抗体多肽，其中该抗体多肽为域抗体(dAb)。
[0025]进一步提供一种抗体多肽，其中可变域融合至Fe域。
[0026]进一步提供一种抗体多肽，其中该抗体多肽进一步包含特异性结合第二抗原之第二可变域，其中该第二抗原为除人类CD40以外之抗原。
[0027]亦提供一种抗体多肽，其中第二抗原为分化簇(cluster of differentiation,CD)分子或主要组织兼容性复合体(Major Histocompatibility Complex,MHC) II类分子。
[0028]亦提供一种抗体多肽，其中第二抗原为血清白蛋白(SA)。
[0029]本发明提供一种编码本文所揭示之抗体多肽的核酸。
[0030]本发明亦提供一种包含本文所揭示之核酸的载体。
[0031]本发明亦提供一种包含本文所揭示之载体的宿主细胞。
[0032]本发明提供一种包含治疗有效量之本文所揭示之抗体多肽及医药学上可接受之载剂的医药组合物 。本发明亦提供一种进一步包含免疫抑制/免疫调节剂及/或消炎剂之医药组合物。
[0033]本发明提供一种治疗需要该治疗之患者的免疫疾病之方法，其包含向该患者投与治疗有效量之本文所揭示之医药组合物。本发明亦提供一种方法，其中该医药组合物与免疫抑制/免疫调节剂及/或消炎剂组合投与。
[0034]本发明提供一种治疗免疫疾病之方法，其中该免疫疾病为自体免疫疾病或移植相关疾病。本发明进一步提供一种治疗免疫疾病之方法，其中该免疫疾病选自由以下组成之群:艾迪森氏病(Addison’s disease)、过敏症、僵直性脊椎炎、哮喘、动脉粥样硬化、自体免疫性耳病、自体免疫性眼病、自体免疫肝炎、自体免疫腮腺炎、结肠炎、冠心病、克罗恩氏病(Crohn’s disease)、糖尿病(包括I型及/或2型糖尿病)、附睪炎、丝球体肾炎、葛瑞夫兹氏病(Graves’ disease)、格-巴二氏征候群(Guillain-Barre syndrome)、桥本氏病(Hashimoto’ s disease)、溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、发炎性肠病、对重组药品之免疫反应、全身性红斑狼疮、男性不育症、多发性硬化症、重症肌无力、天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、类肉瘤病、硬皮病、休格连氏症候群(Sjogren’s syndrome)、脊椎关节病、甲状腺炎、移植排斥反应、血管炎、AIDS、异位性过敏症、支气管哮喘、湿疹、麻风病、精神分裂症、遗传性抑郁症、组织及器官之移植、慢性疲劳症候群、阿兹海默氏病(Alzheimer’s disease)、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、心肌梗塞、中风、自闭症、癫痫症、阿瑟氏现象(Arthus’s phenomenon)、全身性过敏反应、酒精成瘾及药物成瘾。
[0035]本发明亦提供一种使用特异性结合包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列的人类CD40之抗原决定基的第一可变域靶向CD40之方法，其中抗体多肽与域抗体(dAb)BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417)竞争结合。
[0036]本发明提供抗体多肽或其医药学上可接受之盐的医学用途，该抗体多肽包含特异性结合包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列的人类CD40之抗原决定基的第一可变域，其中该抗体多肽与域抗体(dAb)BMS3h-56-201(SEQ ID NO:9)竞争结合。
[0037]本发明提供抗体多肽或其医药学上可接受之盐的用途，该抗体多肽包含特异性结合包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列的人类CD40之抗原决定基的第一可变域，其中该抗体多肽与域抗体(dAb)BMS3h-56-201(SEQ ID N0:9)竞争结合，该用途系用于制备用以治疗免疫疾病之药剂。在一些实施例中，医药组合物与免疫抑制/免疫调节剂及/或消炎剂组合投与。在其他实施例中，免疫疾病为自体免疫疾病或移植相关疾病。在其他实施例中，该免疫疾病选自由以下组成之群:艾迪森氏病、过敏症、僵直性脊椎炎、哮喘、动脉粥样硬化、自体免疫性耳病、自体免疫性眼病、自体免疫肝炎、自体免疫腮腺炎、结肠炎、冠心病、克罗恩氏病、糖尿病(包括I型及/或2型糖尿病)、附睪炎、丝球体肾炎、葛瑞夫兹氏病、格-巴二氏征候群、桥本氏病、溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、发炎性肠病、对重组药品之免疫反应、全身性红斑狼疮、男性不育症、多发性硬化症、重症肌无力、天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、类肉瘤病、硬皮病、休格连氏症候群、脊椎关节病、甲状腺炎、移植排斥反应、血管炎、AIDS、异位性过敏症、支气管哮喘、湿疹、麻风病、精神分裂症、遗传性抑郁症、组织及器官之移植、慢性疲劳症候群、阿兹海默氏病、帕金森氏病、心肌梗塞、中风、自闭症、癫痫症、阿瑟氏现象、全身性过敏反应、酒精成瘾及药物成瘾。[0038]本发明提供一种抗体多肽或其医药学上可接受之盐，该抗体多肽包含特异性结合包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列的人类CD40之抗原决定基的第一可变域，其中该抗体多肽与域抗体(dAb)BMS3h-56-201(SEQ ID N0:9)竞争结合，该抗体多肽或其医药学上可接受之盐系用于制备用以治疗免疫疾病之药剂。该药剂可例如与免疫抑制/免疫调节剂及/或消炎剂组合投与。免疫疾病可为例如自体免疫疾病或移植相关疾病。免疫疾病亦可选自由以下组成之群:艾迪森氏病、过敏症、僵直性脊椎炎、哮喘、动脉粥样硬化、自体免疫性耳病、自体免疫性眼病、自体免疫肝炎、自体免疫腮腺炎、结肠炎、冠心病、克罗恩氏病、糖尿病(包括I型及/或2型糖尿病)、附睪炎、丝球体肾炎、葛瑞夫兹氏病、格-巴二氏征候群、桥本氏病、溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、发炎性肠病、对重组药品之免疫反应、全身性红斑狼疮、男性不育症、多发性硬化症、重症肌无力、天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、类肉瘤病、硬皮病、休格连氏症候群、脊椎关节病、甲状腺炎、移植排斥反应、血管炎、AIDS、异位性过敏症、支气管哮喘、湿疹、麻风病、精神分裂症、遗传性抑郁症、组织及器官之移植、慢性疲劳症候群、阿兹海默氏病、帕金森氏病、心肌梗塞、中风、自闭症、癫痫症、阿瑟氏现象、全身性过敏反应、酒精成瘾及药物成瘾。
[0039]附图简要说明
[0040]图1展示人类⑶40(SEQ ID NO:1)之两种不同共晶体结构之结合模式，一者具有 dAb BMS3h-56-5 (SEQ ID NO: 321)及一者具有 Chi220 抗体之 Fab’。BMS3h_56_5 及Chi220Fab’分子显示为包含β -股(在dAb中以箭头表示)及非重复二级结构(在dAb中以环表示)之草图。亦显示互补决定区(⑶R)，⑶40亦显示为包含人类⑶40之BMS3h-56-5抗原决定基残基之早图。亦显不Chi220抗原决定基残基。亦显不双硫键。标记⑶40之N端(N)及C端(C)。
[0041]图 2 展示接触人类 CD40(SEQ ID NO:1)之 BMS3h_56_5 (SEQ ID N0:321)之空间填充模型，其以草图显示。显示接触⑶40之dAb BMS3h-56-5之表面残基。标记BMS3h-56-5CDR3 区及 FR-2 残基 Leu45、Arg47、Arg56 及 Phe99。在此图中使用 Kabat 编号(Kabat等人，Sequences of Immunological Interest,第5版,美国健康与人类服务部(U.S.Dept.Health&Human Services), Washington, D.C.(1991))，且与顺序编号之不同之处在于使用插入残基来保持β-股之残基编号相同。因此，对于BMS3h_56_5,顺序残基53变为残基52A，顺序残基84、85及86分别变为82A、82B、82C，且Kabat残基编号100缺失(其将介于顺序残基103与104之间)KD40亦以包含非重复二级结构及BMS3h-56-5抗原决定基之草图表示。在人类与长尾称猴(Macaca fascicularis)(食蟹称猴(cynomolgusmonkey))之间不同的 CD40 残基 Alall5、Phe99、Serl26、Hisl62、Leul21 及 Trp 109 以棒图标法显示。作为BMS3h-56-5抗原决定基之一部分的在人类与食蟹猕猴之间不同的CD40残基为 Trpl09、Leul21 及 Hisl62。CD40 残基 Trpl09 及 Leul21 处于 BMS3h_56_5CDR3 与 FR-2之间的间隙中。Trp 109之突变大大降低或消除BMS3h-56-5活性。
[0042]图3展示来自人类及灵长类动物物种之血液样品上聚乙二醇化抗人类⑶40dAbBMS3h38-2C-P40Br之结合。图3A显示BMS3h38_2C_P4(Br结合至人类及猕猴B细胞；图3B显示BMS3h38-2C-P40Br结合至人类、恒河猴及黑猩猩B细胞。
[0043]图4、图5、图6及图7显示分别来自谱系BMS3h_56、BMS3h_37、BMS3h_38及BMS3h-198之代表性域抗体多肽之ClustalW2比对。
[0044]实施方式
[0045]本发明提供特异性结合至人类CD40之抗体多肽。该等抗体多肽不展现CD40促效剂活性，且该等抗体多肽适用于治疗涉及CD40活化之疾病，诸如自体免疫疾病。该等抗体多肽可使用利用细胞结合分析之初步筛检，随后进行一或多轮易错或简并寡核苷酸定向亲和力成熟来选择。结果，提供一类特异性结合单一 CD40抗原决定基之抗体多肽。
[0046]“谱系”为如以下实例中所揭示由常见前驱体藉由易错或简并寡核苷酸定向亲和力成熟而制备且预期结合相同CD40抗原决定基之一组相关抗体多肽。使用抗体多肽之命名表示各种谱系。举例而言，命名“BMS3h-56”系指针对人类CD40所产生之谱系56之抗体多肽。“谱系 BMS3h-56” 抗体多肽包括 BMS3h-56-l 直至 BMS3h_56_33 及 BMS3h-56_202直至 BMS3h-56-288。
[0047]因此，在一个实施方式中，抗体多肽包含特异性结合人类CD40之可变域，其中该抗体多肽与表3中所列之任一域抗体(dAb)竞争结合。举例而言，dAb可能属于选自由以下组成之群的谱系:例如 BMS3h-37、BMS3h-38、BMS3h_41、BMS3h_43、BMS3h_56、BMS3h-131、BMS3h-198 及 BMS3h_202，诸如 dAb BMS3h_56_5、BMS3h-56_201 或 BMS3h_56_258。在另一个实施方式中，抗体多肽特异性结合与表3中所列之任一 dAb相同之人类CD40抗原决定基。举例而言，抗体多肽可包含特异性结合与例如dAb BMS3h-56-5、BMS3h-56-201或BMS3h-56-258相同之人类⑶40抗原决定基的可变域。如下文所揭示，人类⑶40抗原决定基可包含例如SEQ ID NO:1之氨基酸残基Trp 109。
[0048]抗体多肽可为含有单一可变域之域抗体。抗体多肽亦可包含其他结构域，诸如Fe域。举例而言，抗体多肽可包含特异性结合人类血清白蛋白(HSA)之第二可变域。举例而言，该等双特异性抗体多肽可具有增加之半衰期。
[0049]在序列表中，SEQ ID NO:1为人类CD40之氨基酸序列；SEQ ID N0:2为长尾猕猴CD40之氨基酸序列。域抗体BMS3h-56-5之氨基酸序列为SEQ ID NO:321。
[0050]如本文所用，“特异性结合”系指抗体多肽结合抗原之解离常数(Kd)如例如藉由表面电浆子共振所量测，为约`I μ M或I μ M以下。适当分析系统包括BIAcore?表面电浆子共振系统及BIAcore?动力学评估软件(例如2.1版)。特异性结合相互作用之亲和力或Kd可为约500nM或500nM以下或约300nM或300nM以下。[0051]术语“约”将为一般熟习此项技术者所了解且在使用其之情形下将有一定程度之变化。一般而言，约涵盖加上/减去提及值之10%的数值范围。
[0052]根据此实施方式，以下缩写及定义适用。须注意，除非本文另外明确规定，否则如本文所用，单数形式“一(a)”、“一(an)”及“该”包括复数个指示物。因此，举例而言，提及“抗体”包括复数个该等抗体，且提及“剂量”包括提及一或多个为熟习此项技术者所知之剂量及其等同量等。
[0053]1.CD40 及 CD40 活性
[0054]提供结合人类⑶40之抗体多肽。⑶40亦称为B细胞表面抗原⑶40、Bp50、⑶40L受体、CDw40、CDW40、MGC9013、p50、TNFRSF5及肿瘤坏死因子受体超家族成员5。人类CD40之相关结构信息可例如以UniProt寄存编号P25942、Q9BYU0及Q53GN5找到。“人类CD40”系指包含以下氨基酸序列之CD40:
[0055]
【权利要求】
1.一种包含第一可变域之抗体多肽，其中该抗体多肽特异性结合人类CD40之抗原决定基，其中该抗体多肽与域抗体(domain antibody, dAb)BMS3h-56-269 (SEQ ID N0:417)竞争结合于⑶40，其中⑶40包含SEQ ID NO:1之氨基酸序列，且其中该抗原决定基包含至少一个选自由 Trpl09、Leul21、Hisl22、Serl24、Serl56、Alal57、Phel58、Glul59 及 Hisl62 组成之群的CD40氨基酸残基。
2.如权利要求1之抗体多肽，其中该第一可变域包含选自由BMS3h-37、BMS3h_38、BMS3h-56及BMS3h-198组成之谱系群的抗体多肽之一的氨基酸序列，且其中该第一可变域之表观结合常数为IpM至100ηΜ。
3.如权利要求1至2中任一项之抗体多肽，其中该第一可变域包含选自由BMS3h-37、BMS3h-38及BMS3h-56组成之谱系群的抗体多肽之一的氨基酸序列，且其中该第一可变域之hIZCD40L驱动之人类B细胞增殖EC5tl为0.01nM至100.0nM。
4.如权利要求1之抗体多肽，其中该第一可变域之氨基酸序列包含: (a)与BMS3h-56-269(SEQ ID N0:417)之CDRl区有至多两个氨基酸不同的CDRl区， (b)与BMS3h-56-269(SEQ ID N0:417)之CDR2区有至多两个氨基酸不同的CDR2区， (c)与BMS3h-56-269(SEQ ID N0:417)之CDR3区有至多两个氨基酸不同的CDR3区， (d)与BMS3h-56-269(SEQ ID NO: 417)之FRl区有至多两个氨基酸不同的FRl区， (e)与BMS3h-56-269(SEQ ID N0:417)之FR2区有至多两个氨基酸不同的FR2区， (f)与BMS3h-56-269(SEQ ID N0:417)之FR3区有至多两个氨基酸不同的FR3区，及 (g)与BMS3h-56-269(SEQ ID NO: 417)之FR4区有至多两个氨基酸不同的FR4区。
5.如权利要求1之抗体多肽，其中该第一可变域之氨基酸序列包含: (a)与BMS3h-56-269(SEQ ID N0:417)之CDRl区有至多两个氨基酸不同的CDRl区， (b)与BMS3h-56-269(SEQ ID N0:417)之CDR2区有至多两个氨基酸不同的CDR2区， (c)与BMS3h-56-269(SEQ ID N0:417)之CDR3区有至多两个氨基酸不同的CDR3区。
6.如权利要求1之抗体多肽，其中该第一可变域之氨基酸序列与BMS3h-56-258(SEQID NO: 10)或BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417)之氨基酸序列有至多10个氨基酸不同。
7.如权利要求6之抗体多肽，其中该第一可变域之氨基酸序列与BMS3h-56-258(SEQID NO: 10)或BMS3h-56-269 (SEQ ID N0:417)之氨基酸序列有至多5个氨基酸不同。
8.如权利要求7之抗体多肽，其中该第一可变域之氨基酸序列与BMS3h-56-258(SEQID NO: 10)或BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417)之氨基酸序列有两个氨基酸不同。
9.如权利要求8之抗体多肽，其中该第一可变域之氨基酸序列与BMS3h-56-258(SEQID NO: 10)或BMS3h-56-269 (SEQ ID NO: 417)之氨基酸序列有一个氨基酸不同。
10.如权利要求2至3中任一项之抗体多肽，其中该抗体多肽选自BMS3h-56之谱系群，且其中该第一可变域之氨基酸序列进一步包含:
(a)具有序列X1-Tyr-Glu-Y1-Trp (SEQ ID NO: 1274)之 CDRl 区，其中 X1 为 Asp 或 Gly，且Y1为Met或Leu ；
(b)具有序列Ala-1le-Asn-Pro-X2-Gly-Y2-Z2-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-A2-Gly(SEQ ID NO: 1275)之 CDR2 区，其中 X2 为 Gin、Tyr、Pro、Trp 或 Ala，Y2 为 Thr、Ser, Asn,Gly、Met 或 Gin, Z2 为 Arg、Leu、Tyr> His 或 Phe,且 A2 为 Lys 或 Met ;及
(c)具有序列X3-Pro-Y3-Z3-Phe-A3-B3(SEQ ID NO: 1276)之 CDR3 区，其中 X3 为 Leu 或Pro, Y3 为 Pheλ Gin、Thr 或 Met，Z3 为 Tyr、Pro、Leu、Thr、lie、Phe 或 Met，A3 为 Gin、His、Asp、Serλ Lys、Glu 或 Gly,且 B3 为 Glu、Asp 或 Tyr0
11.如权利要求10之抗体多肽，其中该第一可变域之氨基酸序列包含:
(a)具有序列Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-GIy-Ser-X1-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-Thr-Phe-Y1 (SEQ ID NO: 1277)之 FRl区，其中X1为Leu或八作，且Y1为Arg或Ala ；
(b)具有序列Trp-Val-Arg-X2-Ala-Pro-Gly-Y2-Z2-Leu-Glu-Arg-Val-Ser (SEQ IDNO: 1278)之 FR2 区，其中 X2 为 Gln 或 Arg, Y2 为 Lys 或 Arg,且 Z2 为 Gly 或 Val ；
(c)具有序列Arg-Phe-Thr-1 Ie-Ser-Arg-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-X3-Lys-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Y3-Asp-Thr-Z3-Val-Tyr-A3-Cys-B3-Lys (SEQ ID NO: 1279)之FR3 区，其中 X3 为 Thr 或 Met，Y3 为 Glu 或 Asp，Z3 为 Ala 或 Ser，A3 为 Tyr 或 His，且 B3 为Ala 或 Thr ;及
(d)具有序列X4-Gly-Y4-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Z4(SEQ ID NO: 1280)之 FR4区，其中X4为Trp或Arg, Y4为Gln或Pro,且Z4为Ser或Asn0
12.如权利要求2至3中任一项之抗体多肽，其中该第一可变域包含BMS3h-56-258(SEQID NO: 10)或 BMS3h-56-269 (SEQ ID N0:417)之氨基酸序列。
13.如权利要求2至3中任一项之抗体多肽，其中该抗体多肽选自BMS3h-37之谱系群，其中该第一可变域包含序列 Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-XfPrO-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cys-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-Thr-Phe-Glu-Trp-Tyr-Glu-Met-Gln-Trp-Val-Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Lys-Gly-Leu-Glu-Trp-Val-Ser-Ala-1le-Ser-Gly-Asp-Gly-Tyr-Arg-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-1le-Ser-Arg-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-Thr-Leu-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Glu-Asp-ThT-Ala-Val-Tyr-Tyr-Cys-Ala-Lys-Y1-Leu-Z1-A1-Phe-Asp-Tyr-B1-Gly-Arg-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser(SEQ ID NO:1281);且
其中 X1 为 Gln 或 Arg ；YX 为 Glu 或 Gly ；ZX 为 Ala.Leu 或 Glu ；AX 为 Phe 或 Tyr ;且 B1 为Trp 或 Arg0
14.如权利要求2至3中任一项之抗体多肽，其中该抗体多肽选自BMS3h-38之谱系群，其中该第一可变域包含序列 Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-Cy S-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-X1-Phe-Glu-Glu-Glu-Glu-Met-1le-Trp-Val-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Gly-Leu-Glu-Trp-Val-Ser-Y1-1le-Ser-Z1-A1-Gly-B1-C1-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-1le-Ser-Arg-Asp-Asn-Ser-Lys-Asn-Thr-Leu-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-TYr-Cys-Gly-Lys-Glu-Pro-Phe-D1-Tyr-Asp-Tyr-Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser(SEQ ID NO:1282);且
其中 \ 为 Thr 或 Pro 为 Ala 或 Ser (L1 为 Arg 或 Gly 为 Arg、Ser、Asn、Gln、Gly、His 或 Leu 为 Tyrλ Phe、Trp 或 Gly 为 Ser 或 Gly ;且 D1 为 Arg、Met 或 Pro。
15.如权利要求2至3中任一项之抗体多肽，其中该抗体多肽选自BMS3h-198之谱系群，其中该第一可变域包含序列 Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Glu-Ser-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Gln-Pro-Gly-Gly-Ser-Leu-Arg-Leu-Ser-CyS-Ala-Ala-Ser-Gly-Phe-Thr-Phe-Ala-Gly-Try-Glu-X1-Trp-Trp-Y1-Arg-Gln-Ala-Pro-Gly-Lys-Gly-Leu-Glu-Arg-Val-Ser-Ala-1le-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly-Ser-Thr-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Ser-Val-Lys-Gly-Arg-Phe-Thr-1le-Ser-Arg-Asp-Z1-A1-Lys-Asn-Thr-Leu-Tyr-Leu-Gln-Met-Asn-Ser-Leu-Arg-Ala-Glu-Asp-Thr-Ala-Val-Tyr-B1-Cys-Ala-C1-D1-Pro-Tyr-Ser-E1-Asp-Tyr-F1-G1-H1-Gly-Thr-Leu-Val-Thr-Val-Ser-Ser(SEQ ID NO: 1283);且
其中 X1 为 Met 或 Leu !Y1 为 Val 或 Phe -,I1 为 Asp 或 Asn !A1 为 Ser 或 Thr !B1 为 Tyr 或His !C1 为 Lys 或 Arg !D1 为 Asp 或 Glu !E1 为 Tyr 或 Phe !F1 为 Trp 或 Arg !G1 为 Gly 或 Arg ；且H1为Gln或His。
16.如权利要求1至15中任一项之抗体多肽，其中该抗体多肽为域抗体(dAb)。
17.如权利要求1至16中任一项之抗体多肽，其中该抗体多肽为包含该第一可变域及Fe域之融合多肽。
18.如权利要求17之融合多肽，其中该融合多肽包含IgG4Fc域。
19.如权利要求18之融合多肽，其中该融合多肽包含IgGlFc域。
20.如权利要求17至19中任一项之融合多肽，其中该融合多肽包含选自由BMS3h-37、BMS3h-38及BMS3h-56组成之谱系群的抗体多肽之一的氨基酸序列，且其中该融合多肽之hIZCD40L驱动之人类B细胞增殖EC5tl为0.0OlnM至100.0nM。
21.如权利要求1至20中任一项之抗体多肽，其中该抗体多肽进一步包含特异性结合第二抗原之第二可 变域，其中该第二抗原为除人类CD40以外之抗原。
22.如权利要求21之抗体多肽，其中该第二抗原为分化簇(clusterofdifferentiation, CD)分子或主要组织兼容性复合体(Major HistocompatibilityComplex, MHC) II 类分子。
23.如权利要求21之抗体多肽，其中该第二抗原为血清白蛋白(SA)。
24.一种核酸，其编码如权利要求1至23中任一项之抗体多肽。
25.—种载体，其包含如权利要求24之核酸。
26.—种经分离之宿主细胞，其包含如权利要求25之载体。
27.一种医药组合物，其包含治疗有效量之如权利要求1之抗体多肽及医药学上可接受之载剂。
28.如权利要求27之医药组合物，其进一步包含免疫抑制/免疫调节剂及/或消炎剂。
29.—种治疗需要该治疗之患者的免疫疾病之方法,其包含向该患者投与治疗有效量之如权利要求27之医药组合物。
30.如权利要求29之方法，其中该医药组合物系与免疫抑制/免疫调节剂及/或消炎剂组合投与。
31.如权利要求29之方法，其中该免疫疾病为自体免疫疾病或移植相关疾病。
32.如权利要求29之方法，其中该免疫疾病选自由以下组成之群:艾迪森氏病(Addison’s disease)、过敏症、僵直性脊椎炎、哮喘、动脉粥样硬化、自体免疫性耳病、自体免疫性眼病、自体免疫肝炎、自体免疫腮腺炎、结肠炎、冠心病、克罗恩氏病(Crohn’sdisease)、糖尿病(包括I型及/或2型糖尿病)、附睪炎、丝球体肾炎、葛瑞夫兹氏病(Graves’ disease)、格-巴二氏征候群(Guillain-Barre syndrome)、桥本氏病(Hashimoto's disease)、溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、发炎性肠病、对重组药品之免疫反应、全身性红斑狼疮、男性不育症、多发性硬化症、重症肌无力、天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、类肉瘤病、硬皮病、休格连氏症候群(Sjogren’s syndrome)、脊椎关节病、甲状腺炎、移植排斥反应、血管炎、AIDS、异位性过敏症、支气管哮喘、湿疹、麻风病、精神分裂症、遗传性抑郁症、组织及器官之移植、慢性疲劳症候群、阿兹海默氏病(Alzheimer’s disease)、帕金森氏病(Parkinson’s disease)、心肌梗塞、中风、自闭症、癫痫症、阿瑟氏现 象(Arthus’s phenomenon)、全身性过敏反应、酒精成瘾及药物成瘾。
【文档编号】C07K16/28GK103842382SQ201280030683
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2012年4月20日 优先权日:2011年4月21日
【发明者】A.苏里, S.舍里夫, S.苏查德, A.亚姆纽克, S.克里斯特克, J.塔姆拉, J.布莱森, S.格兰特, P.德鲁 申请人:百时美施贵宝公司, 多曼蒂斯有限公司