多价免疫球蛋白的浓缩物的制造方法

多价免疫球蛋白的浓缩物的制造方法
【专利摘要】本发明涉及一种由富含免疫球蛋白的血浆或血浆成分的初始溶液制造多价免疫球蛋白浓缩物的方法及其治疗应用，包括以辛酸沉淀移除蛋白质污染物以获得不含蛋白酶的溶液，且经流体化床层析分离所述不含蛋白酶的溶液，该方法可获得每公升血浆超过4.5g免疫球蛋白的人类多价免疫球蛋白浓缩物。
【专利说明】多价免疫球蛋白的浓缩物的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于治疗使用的多价免疫球蛋白浓缩物的制造方法。
【背景技术】
[0002]免疫球蛋白(Ig)由B淋巴细胞和衆细胞(plasmocytes)合成,其分布于血衆、血管外液及分泌物中。根据其蛋白质结构，可被分为5个种类:IgG、IgA、IgM、IgE和IgD。其在人体内的自然分布为:75%的IgG，20%的IgA，5%的IgM，以及〈1%的IgE和IgD。一般来说，每公升的血浆中含有8至15g的IgG。在血浆中，循环性IgG免疫球蛋白的半衰期为约21 天，IgA、IgM、IgD 和 IgE 则小于 7 天。
[0003]相对于针对各种传染性病原的抗体具有高度多样性，人源多价免疫球蛋白和所使用的药学组成有97%为IgG。
[0004]富含多价免疫球蛋白的人类血浆成分已知可用于治疗各种先天性感染或缺陷。可通过施用多价或一般免疫球蛋白以改善原发性免疫缺陷和继发性缺陷(白血病、骨髓瘤或复发性感染)。其可从特定抗体(抗-恒河猴(Rhesus)或抗-D毒性抗体)中分离。其可以非常高的剂量，高达2g/kg/day，以缓和病情的发展，目前对病理生理所知甚少，但其中包含免疫形式的部分。施用多价免疫球已显示至少可暂时治疗免疫性的血小板减少，也称为免疫性血小板缺乏紫斑症。多价免疫球蛋白也可用于治疗Guillain-Barr6’s症候群、脱髓鞘多发性神经炎、多发性硬化症、肌无力Lambert-Eaton’ s症候群、皮肌炎。
[0005]多价免疫球蛋白含有多种分子，因此其作用机制复杂:作用发生于多个层次，其改变病患免疫系统的平衡，且因此达到治疗效果。
`[0006]目前已知许多多价免疫球蛋白的制造方法。最佳的制造方法包含多个乙醇沉淀步骤(Cohn et al.1946, J.Am.Chem.Soc.68, 459)。
[0007]特别是专利EP0703922 (Laboratoire Fran^ais du Fractionnement et des Biotechnologies, uConcentrediimmunoglobulines Gausage therapeutique et procededeproduction dudit concentre，， (Immunoglobulin G concentrate for therapeutic useand method for producing said concentrate))揭不一种由人类血衆或冷冻沉淀血衆上清液制造免疫球蛋白G的方法。该方法不包含乙醇沉淀，且包括一系列的层析步骤和利用溶剂/界面活性剂的病毒去活化步骤。由于一系列的层析步骤，使得该方法的产率比较低，该方法实质上包括2个阴离子及阳离子交换串联循环，以及2个超过滤步骤。
[0008]专利EP1385886 (Laboratoire FraH^aiS du Fractionnement et desBiotechnologies, uProcedede preparation de concentres d’ immunoglobulineshumainesausage therapeutique，， (Method for preparing human immunoglobulinconcentrates for therapeutic use))揭示一种人类免疫球蛋白的制造方法,包括脂质及蛋白质沉淀污染物的前纯化，以及阴离子交换树脂和碱性PH环境的层析步骤。该方法可获得每公升起始处理血浆4g以上的免疫球蛋白。[0009]Tanaka K.等人 2000(“High quality human immunoglobulin G purified fromCohn fractions by liquid chromatography,?Braz J Med Bio Res2000, 33(1):27-30)揭示一种由Cohn’ s方法获得的“I+II+II”和“II+III”部分来纯化免疫球蛋白G的方法，其利用3种胶体的层析分离,2种离子交换胶体(Q-Sepharose FF和CM-Sepharose FF)以及I种过滤胶体(S^hacryl S-300HR)。该方法可获得每公升血浆4.3±0.2g以上的免疫球蛋白G。
[0010]然而，可用免疫球蛋白治疗的适应症大量增加，免疫球蛋白的需求量也显著提升，且须确保最终产物具有高纯度且无病毒无染。
[0011]因此，本发明的目的为提供一种人类多价免疫球蛋白浓缩物的制造方法，相比较于已知的方法，其具有更高的产率。

【发明内容】

[0012]本发明因此涉及一种由一血衆或富含免疫球蛋白的血衆成分(plasma fraction)的初始溶液来制造多价免疫球蛋白浓缩物的方法，其特征在于:
[0013](a)利用辛酸移除污染蛋白以获得不含蛋白酶的溶液的步骤，
[0014](b)对所述不含蛋白酶的溶液进行流体化床层析步骤(f luidized bedchromatography step),
[0015]该方法可获得人类多价免疫球蛋白的浓缩物，其产率大于4.5g(免疫球蛋白)/L (血浆或富含免疫球蛋白的血浆成分)。
[0016]本发明方法中利用辛酸移除污染蛋白的步骤(a)最后所获得的溶液，其中蛋白酶的浓度符合欧洲药典7.5版01/2012:0918的2.6.15标准，相比较于含有30g/L免疫球蛋白的稀释液，最多为35IU/mL。
[0017]发明发现根据结合利用辛酸移除污染蛋白的步骤和流体化床层析步骤可大幅增加免疫球蛋白的产量。
【具体实施方式】
[0018]在一实施例中，本发明包括结合在酸性pH值下利用辛酸移除污染蛋白的步骤，接着将经辛酸处理结束所获得的上清液于酸性pH值下进行澄清(clarification),使免疫球蛋白可在流体化管柱(一种阴离子交换型及/或亲和性型及/或“伪亲和性(pseudo-affinity) ”型树酯,优选的为“混合(mixed-mode) ”型)中结合至层析胶体上,其可增加多价免疫球蛋白的产量。优选的，若将多价免疫球蛋白由层析胶体冲提下来的条件可直接进行后续程序，不需经过任何透析或超过滤(ultrafiltration)技术的步骤,则可增加产率。特别是，本发明的方法可提升每公升血浆0.25%的多价免疫球蛋白产率及高纯度(99%)的终产物。
[0019]在一具体实施例中，本发明的方法包括`在利用辛酸移除污染蛋白(a)和流体化床层析步骤(b)之间有一于酸性pH值下的澄清步骤，优选的地使用深层过滤。
[0020]冲提步骤优选的是指选择性萃取G型免疫球蛋白(IgG)。
[0021]本发明还有关于一种由一血浆或富含免疫球蛋白的血浆成分的初始溶液来制造多价免疫球蛋白浓缩物的方法，其特征在于:[0022](a)于酸性pH值下利用辛酸移除污染蛋白以获得不含蛋白酶的溶液的步骤，
[0023](b)于酸性pH值下的澄清步骤，
[0024](c)对所述不含蛋白酶的溶液进行的流体化床层析步骤，
[0025](d)于免疫球蛋白的冲提缓冲液中的冲提步骤。
[0026]特别是，利用尽可能高孔隙(porosity)的深层过滤来进行步骤(b)的酸性pH值澄清，但所述经澄清的上清液可通过一流体化床管柱。
[0027]本发明方法中利用辛酸移除污染蛋白的步骤(a)中最后所获得的溶液，其蛋白酶的浓度符合欧洲药典7.5版01/2012:0918的2.6.15标准，相对于含30g/L免疫球蛋白的稀释液，最多为35IU/mL。
[0028]本发明有关于上述方法，且在酸性pH值后的澄清步骤(b)后，合并一提高pH值的步骤，使其可对应于多价免疫球蛋白在流体化床模式中结合至层析树酯的条件。
[0029]令人惊讶的是，由本发明方法最终所获得的人类多价免疫球蛋白浓缩物具有小于30%的抗-补体活性(ant1-complementary activity),其以欧洲药典7.5版01/2012:0918，第2.6.17段所述的方法测定。[0030]本发明中所述的“多价免疫球蛋白”是指所有的免疫球蛋白，或免疫球蛋白的片段，例如，F(ab，)2或F(ab),和任何在生产过程中所获得的中间产物(intermediatefraction)。
[0031]“血浆成分”是指任何经处理的血液溶液，其可为天然人类血浆的分离或分馏，尤其是任何在制备多价免疫球蛋白浓缩物的方法中所获得的中间产物。
[0032]“富含免疫球蛋白的血浆成分”是指一含有免疫球蛋白的血浆成分，其免疫球蛋白的程度高于天然人类血浆。
[0033]“I+II+III” 或“II+III” 沉淀物(precipitate)是指由根据 Cohn，s 方法(Cohnet al.1946, J.Am.Chem.Soc.68, 459)或Kistler 和 Nitschmann (1962, Vox Sang.7, 414)方法经乙醇分离的血浆所获得的沉淀物。
[0034]“污染蛋白”是指除了 G型免疫球蛋白之外所有的蛋白质，例如，但不限于，A、E或M型免疫球蛋白以及其他血浆蛋白，例如，但不限于:
[0035]-白蛋白、转铁蛋白、α2-巨球蛋白、血纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白原等，
[0036]-凝血因子，例如，但不限于，FX、FXI或FXII，
[0037]-蛋白酶,例如,但不限于,激肽释放酶(kallikrein)、前激肽释放酶或激肽释放酶的活化剂，以及
[0038]-抗-A和抗-B血凝素。
[0039]“流体化床层析”是指一种技术，其在高密度层析磁珠中利用一种和重力反方向的流体，造成与后者之间产生一空间，使澄清溶液可通过层析管柱而不造成任何溶液流体的阻塞。流体化床层析可为离子交换型、亲和型、“伪亲和型”、“混合型”(例如，同时具有离子交换和伪亲和性)层析。
[0040]特别是，流体化床层析为“混合型”的UpFront IVIG胶体，其包括结合静电荷的化学配体和疏水基团，以对免疫球蛋白提供特定的伪-亲和性。
[0041]本发明中所用的辛酸浓度须小心控制，例如，须以够低最终浓度的辛酸以达成污染物的沉淀，在溶液其他成分的沉淀过程中不会捕捉多价免疫球蛋白。辛酸的浓度优选的为0.5至1.5%，优选的为0.8至1.2%，更优选的为0.9至1.1%，且最优选的等于1%(辛酸百分比为每单位溶液体积的辛酸克重)。
[0042]在一实施例中，利用辛酸移除蛋白污染物的步骤是在pH值为4.3至4.9，优选的为4.6至4.8下进行。
[0043] 申请人:惊人地发现，当之后包括一后续的澄清步骤时，本发明的多价免疫球蛋白浓缩物的制造方法中所使用的辛酸浓度会对该方法的产量造成直接的影响。若辛酸的浓度过低，会导致沉淀情况不佳(特别是大部分的脂质会残留于溶液中)，且选择性的澄清步骤将难以进行。另一方面，若辛酸浓度过高，在经过选择性澄清后，多价免疫球蛋白会形成沉淀，且不存在于上清液中。
[0044]在一实施例中，酸性pH值的澄清步骤可为移除污染蛋白的步骤和流体化层析步骤之间。所述酸性PH值澄清步骤是在pH4.3至4.9下进行，优选的为pH4.4至4.8，优选的为 ρΗ4.6 至 4.8。
[0045]在一具体实施例中，所述酸性pH的澄清步骤为利用深层过滤(depthfiltration)的澄清步骤。所述澄清步骤仅挡住可能会影响流体化床运作的比较大颗粒。优选的使用滞留率为15至100 μ m,优选的为25至70 μ m或15至40 μ m的滤膜。在一实施例中，在该步骤中使用SEITZ T5500的澄清滤膜，其滞留率为25-70 μ m，且更优选的为T2600滤膜，其滞留率为15-40μπι。任何种类的滤膜，不论带电或不带电，只要具有相同的澄清效果都可使用。澄清优选的在滤土(filtration earths)的存在下进行，由此可降低滤膜的表面。为了增加溶液过滤时的流动性，澄清优选的在4至30°C，更优选的是10至25°C，例如为20至25°C下进行。本发明澄清步骤中所使用滤膜的特性优选的为至少40L/m2，即8kg沉淀物/m2,更优选的是55L/m2,即Ilkg沉淀物/m2。
[0046]在深层过滤结束后，根据该方法接续步骤的需要，优选的将滤液的pH值和渗透压调整至不需透析或超过滤步骤。
[0047]在一具体实施例中，流体化床层析步骤可为一 “混合型”层析，其包括:
[0048]-添加至一层析管柱,其已利用pH值为4.5至8 ;优选的为4.5至7.5 ;4.5至7.0 ;
4.5至6.8 ;4.5至6.5 ；5.0至7.0 ;5.0至6.5 ;5.5至6.3 ;或为5.7至6.3的缓冲液进行事先平衡，事先将深层过滤中澄清步骤的溶液调整至相同的PH值，即pH值为4.5至8，更优选的为 4.5 至 7.5 ;4.5 至 7.0 ；4.5 至 6.8 ;4.5 至 6.5 ;5.0 至 7.0 ；5.0 至 6.5 ;5.5 至 6.3 ;或为5.7至6.3，
[0049]-以缓冲溶液清洗上述管柱直到移除管柱中所有的非吸附蛋白，
[0050]-利用pH 值为 8 至 10，优选的为 8 至 9.8 ;8.3 至 9.8 ;8.5 至 9.8 ；8.8 至 9.8 ;9.0至9.8 ;9.5至9.8的冲提缓冲液冲提吸附于管柱上的多价免疫球蛋白，以及
[0051]-回收所述富含人类多价免疫球蛋白的溶液。
[0052]本发明流体化床所的“混合型”层析使用具有不同尺寸的磁珠(beads)，其可保持流体化床的稳定。本发明流体化床的“混合型”层析中所使用的磁珠具有2.5至3.5kg/L的平均密度，直径为20至400 μ m，以及在本发明条件下具和多价免疫球蛋白结合的能力，其较佳的大于70g/L。
[0053]为了在简单地调整pH和导电度后，即可直接进行下个步骤，流体化床层析所使用的冲提例如为一碱性PH值和低离子强度的冲提。本发明中所使用的冲提缓冲液例如可为含有:5至500mM的甘胺酸，优选的是20mM，以及5至500mM的NaCl，优选的是20mM，pH值为7至10，优选的是为9至10，优选的是为9.5至10，且更优选的是为pH9.5至9.8。
[0054]当接续流体化床层析的步骤无法接受高离子强度的条件，且流体化床层析步骤所获得的冲提液需要事先大量稀释或透析时，可使用具高PH值但低离子强度的冲提缓冲液。本发明所使用的冲提缓冲液可例如为含有:5to20mM的甘胺酸，优选的是10mM，pH值为9.5至10.5，优选的为9.8至10.5，且更优选的为pH9.8至10.2。
[0055]在一具体实施例中，本发明的方法在流体化床层析步骤后还包括，一个或多个下列步骤:
[0056](i)病毒去活化步骤；
[0057](ii)对先前步骤所获得的溶液进行阴离子交换的层析步骤，以移除病毒去活化步骤中化学物质并降低IgA和IgM的污染；
[0058](iii)移除先前步骤所获得的溶液中抗-A和抗-B抗体的步骤；
[0059](iv)通过减小孔径由100至15nm的纳米滤膜进行的过滤步骤；
[0060](V)将先前步骤所获得的溶液经超过滤的浓缩步骤和配制步骤；
[0061](vi)常规的消毒过滤步骤。
[0062]本发明方法所获得的多价免疫球蛋白浓度物通常至少经过一移除或去活化至少一致病因子(infectious agent)的步骤。本发明的多价免疫球浓缩物一般具有至少经过一移除或去活化至少一致病因子的步骤。在致病因子之中，可为病毒和非传统的传染性因子(NCTAs)，例如，朊病毒(prions)。病毒去活性通常包括一化学处理，例如，一溶剂及/或界面活性剂及/或热，例如UVC、伽玛射线、及/或巴氏杀菌。纳米过滤也有助于移除致病因子，特别是病毒。此优选的包括至少一溶剂和界面活性剂的处理，以及纳米过滤。溶剂及/或界面活性剂(一般称为溶剂/界面活性剂处理)的处理特别包括磷酸三丁酯(TnBP)及/或界面活性剂的处理，其择自于Triton X-100、Tween (优选的为TweenSO)、胆酸钠及2-[4-(2，4，4_三甲基戊-2-基)苯氧]乙醇(辛苯昔醇)。纳米过滤一般是指多价免疫球蛋白浓缩物透过一孔径小于80nm的滤膜的过滤。可使用的滤膜包括，例如 BioEx, Planova?75nm> Planova?35nm> Planova?20nm 或 Planova?15nm(Asahicorporation)、Ultipor DV50 或 DV20 (Pall corporation)、Virosart CPV (Sartorius)、Viresolve NFR或NFP(Millipore)滤膜。优选的纳米过滤在步骤(V)的浓缩多价免疫球蛋白的超过滤和配制步骤之前完成。在一具体实施例中，经纯化的多价免疫球蛋白浓缩物经过一序列孔径为15至50nm,例如20或35nm的滤膜的过滤。
[0063]本发明方法中所使用的阴离子交换层析在一碱性pH和低离子强度下进行以结合多价免疫球蛋白。该步骤可参照例如专利EP1385886 (Laboratoire Fran^aiS duFractionnement et des Biotechnologies, “Procedede preparation de concentresd’ immunoglobulines humainesausage therapeutique，， (Method for preparing humanimmunoglobulin concentrates for therapeutic use))所述的方法。树脂以任何低浓度、具缓冲特性、PH8.5至9.5的缓冲液进行平衡，例如Tris缓冲液或特别是甘氨酸缓冲液。甘氨酸浓度可包括为5至50mM，例如为5至20mM，且优选的为8至10mM。pH值可调整为8.5至9.5，且优选的为8.9至9.1。
[0064]优选的流体化床层析的冲提液经稀释且调整pH值使多价免疫球可结合至阳离子交换层析的载体上。稀释以水进行使导电率为l，500yS/cm，且优选的为l，100yS/cm。以平衡缓冲液清洗管柱，接着以20mM Na/Na2P04缓冲液(pH6.2)冲提多价免疫球蛋白。最后，以150mM NaCl溶液清洗管柱。
[0065]由阴离子层析所获得溶液中的抗-A和抗-B抗体的移除可参照专利申请 W02007/077365 (Laboratoire Fran^aiS du Fractionnement et desBiotechnologies, "Immunoglobulin G(IgG) concentrate depleted of ant1-A andant1-B antibodies and of polyreactive IgGs")中所述的方法。先前步骤所获得的溶液经过一移除抗-A和抗-B抗体的步骤,该步骤通过过滤载体混合物上多价免疫球蛋白浓缩物的免疫亲和性层析，且其基质上具有和A及B血型抗原类似的寡糖。
[0066]在本发明的具体实施例中，初始溶液为血浆或以现有方法所制备的富含免疫球蛋白的血浆成分，且特别以乙醇及/或层析分离的部分。
[0067]在一具体实施例中，初始溶液为一参照Cohn或Kistler和Nitschmann方法(1962, Vox Sang.7,414)由血浆乙醇分馏所获得的“I+II+III”沉淀物或“II+III”沉淀物，并回溶成溶液。在本发明的范围中，优选的所述“I+II+III”沉淀物或“II+III”沉淀物回溶至经纯化的注射用水(wfi)或含离子溶液中。本发明中的离子溶液可为浓度少于或等于20mM，优选的为5至15mM，优选的为10mM，的NaCl溶液。
[0068]在另一实施例中，将“I+II+III”沉淀物或“II+III”沉淀物回溶至溶液是在可使污染性纤维蛋白原沉淀的条件下进行。将“I+II+III”沉淀物或“II+III”沉淀物以专一性针对纤维蛋白原的沉淀溶液处理后，可获得污染性纤维蛋白原的沉淀，沉淀溶液例如为CaCl2溶液，其浓度少于或等于20mM，优选的为5至15mM，优选的为含IOmM盐类的溶液。在该实施例中，纤维蛋白原保持沉淀形式，但多价免疫球蛋白为溶解状态。
[0069]本发明一特定实施`例涉及一种多价免疫球蛋白浓缩物的制造方法，包括:
[0070](i)利用辛酸移除污染蛋白的步骤；
[0071](ii)利用深层过滤的澄清步骤；
[0072](iii) “混合型”的流体化床层析步骤；
[0073](iv)经溶剂/界面活性剂处理的病毒去活化步骤；
[0074](V)离子交换层析步骤；
[0075](vi)移除抗-A和抗-B抗体的步骤；
[0076](vii)经孔径为100至15nm的纳米滤膜的过滤步骤；
[0077](viii)将先前步骤所获得的溶液经超过滤的浓缩步骤和配制步骤，以及接着传统消毒过滤步骤。
[0078]在另一具体实施例中，本发明涉及一种多价免疫球蛋白浓缩物的制造方法，包括:
[0079]⑴将血浆或富含免疫球蛋白的血浆成分的初绐溶液经乙醇处理，以获得“I+II+III”or “II+III”沉淀物，该方法可参照Cohn’ s方法(已揭示)或Kistler和Nitschmann 方法(1962, Vox Sang.7, 414)；
[0080](ii)将“I+II+III”或“II+III”沉淀物回溶至注射用中，于20°C (优选的为4至15°C)下搅拌。可添加各种离子以促使沉淀的多价免疫球蛋白回溶至溶液中，例如，阳离子，如Na+，阴离子，如Cl-，例如NaCl。盐类的浓度小于或等于20mM，优选的为5至15mM，且优选的等于IOmM,例如，IOmM的NaCl ；
[0081](iii)以辛酸使“I+II+III”或“II+III”沉淀物回溶至溶液中的蛋白质污染物沉淀，辛酸的浓度为0.5至1.5%，优选的是0.8至1.2%，优选的是0.9至1.1%，以获得不含蛋白酶的血浆溶液，且接着将PH值调整至4.3至4.9，优选的为4.4至4.8，且优选的为4.6至4.8。在一实施例中，以HCl进行pH的调整；
[0082](iv)将由步骤(iii)所获得的不含蛋白酶的血浆溶液于酸性pH值以深层滤膜进行过滤，深层滤膜具有最大的孔径，可容许滤液注入使用于流体化床模式的层析管柱中；
[0083](V)调整由步骤(iv)获得的溶液的渗透压和pH值；
[0084](vi)将上述步骤所获得的溶液进行流体化床层析，以获得富含人类多价免疫球蛋白的血液溶液。优选的所述层析容许多价免疫球蛋白冲提液于一近似于后续步骤所需缓冲液的缓冲液中，以限制因透析、超过滤、或任何重新配制溶液所需步骤中造成多价免疫球蛋白的流失；
[0085](vii)以溶剂/界面活性剂处理，特别包括以三-η-丁基磷酸盐(TnBP)及/或一界面活性剂的处理，其择自于Triton X-100、Tween(优选的为Tween80)、胆酸钠及2-[4-(2，4，4-三甲基戊-2-基)苯氧]乙醇(辛苯昔醇)，以去活化上述步骤中所获得的溶液中的病毒；
[0086](viii)利用交联多醣或乙烯聚合物胶体、TMAE基团骨架对上述步骤中所获得的溶液进行阴离子交换层析，以移除上述步骤中所使用的溶剂及界面活性剂，并移除IgA和IgM污染物；
[0087](ix)如专利申请W02007/077365 (Laboratoire FranfaiS du Fractionnement etdes Biotechnologies, "Immunoglobulin G (IgG) concentrate depleted of ant1-A andant1-B antibodies and of polyreactive IgGs〃.)所不的亲和性层析，以移除上述步骤中所获得溶液中的抗-A和抗-B抗体；`
[0088](x)对上述步骤中所获得溶液进行纳米过滤，利用孔径50nm (例如PALL DV20滤膜)或35nm(例如PLAN0VA35N滤膜)的前滤膜(pre-filter)，接着利用孔径20nm(例如PLAN0VA20N滤膜)或15nm(例如PLAN0VA20N或BIOEX滤膜)的滤膜，以移除可抵抗步骤
(ix)处理的朊病毒(prion)或病毒；
[0089](xi)对上述步骤中所获得溶液进行浓缩或渗滤(diafiltration)，以获得含至少50g/L多价免疫球蛋白的溶液。
[0090]本发明方法中步骤(iii)利用辛酸移除污染物所获得溶液，其符合欧洲药典6.7版01/2012:0918的2.6.15标准，含30g/L免疫球蛋白的沉淀稀释液，最多为35IU/mL。
[0091]本发明的目的还包括本发明方法所获得的人类多价免疫球浓缩物，其特征在于所述浓缩物具有小于30%的抗补体活性。
[0092]本发明的目的还包括制备一种液体、冷冻或冻干的人类多价免疫球蛋白药学组合物，其特征在于:
[0093]a.添加一个或多个种药学上可接受的稳定剂至本发明方法所获得的人类多价免疫球浓缩物中，以及
[0094]b.选择性地，冷冻或冻干上述步骤所获得的药剂；
[0095]因此，所述药剂为液体、冷冻或冻干形式。[0096]本发明中所使用的药学上可接受的稳定剂为，例如，专利申请FR2853551、FR2961107和FR2962650中所述。专利申请FR2853551揭示一种包含醇糖(al coho I sugar)，例如甘露醇、甘氨酸和非离子性界面活性剂的稳定配方。优选的甘露醇的浓度为30g/L至50g/L,甘氨酸的浓度为7g/L至10g/L，且非离子性界面活性剂的浓度为20至50ppm。专利申请FR2961107揭示一种包含甘氨酸和非离子界面活性剂，且pH值小于或等于4.8的稳定配方。甘氨酸的浓度为至少200mM，优选的为250mM±50mM，且非离子性界面活性剂的浓度为20至100mg/L，优选的为35mg/L土 15mg/L，优选的为50mg/L。专利申请FR2962650揭示人类免疫球蛋白G制剂的赋形剂，其择自于氨基酸、糖类、糖类衍生物、盐类和界面活性剂(surfactants),其界面活性剂添加的浓度须小于该界面活性剂的临界微胞浓度。
[0097]本发明的目的还包括所述人类多价免疫球蛋白的液体、冷冻或冻干药学组合物的应用，特别是，用于治疗病征，例如，脱髓鞘性神经炎，多发性硬化症，兰伯特-伊顿(Lambert-Eaton)肌无力症候群，皮肌炎，用于原发性免疫缺陷的替代治疗，例如，先天性丙球蛋白缺乏症、先天性低丙球蛋白缺乏症、多样性免疫缺乏症、严重复合型免疫缺乏症、Wiskott Aldrich症候群、严重性二次免疫球蛋白低下和反复感染的多发性骨髓瘤或慢性淋巴白血病、HIV-感染病童的反复感染、或治疗免疫球蛋白低下或体液免疫功能障碍的原发性免疫缺陷。本发明还包括所述人类多价免疫球蛋白的液体、冷冻或冻干药学组合物的应用，用于治疗体液性免疫的二次性免疫缺陷，特别是，免疫球蛋白低下和反复感染相关的慢性淋巴细胞白血病或多发性骨髓瘤、感染相关的免疫球蛋白低下的干细胞移植、以及治疗重大出血风险或改正血小板数量的医疗或手术前的成人和儿童特发性血小板减少性紫癒(ITP)、鸟枪弹样网膜脉络膜病变(Birdshot retinochorioditis)、Guillain-Barr6 症候群、多源性运动神经病变(MMN)、慢性脱髓鞘性神经炎(CIDP)、以及川崎症(Kawasaki’ sdisease)。
[0098]以下详述本发明方法的实施例。下述的实施例仅用于说明本发明的目的及优选的实施例，但不可用于限制本发明的范围。
[0099]实施例1
[0100]1.1将“I+II+III”沉淀物回溶至溶液中
[0101]使用“I+II+III”沉淀物作为起始物，其可参照Cohn或Kistler和Nitschmann方法(1962，Vox Sang.7，414)由血浆成分经乙醇处理后获得。将56.7g的沉淀物回溶至228mL的软化水中，或使用其相同比例。将混合物于15°C ±5°C下搅拌20分钟。接着将温度提高至22°C ±2°C，且缓慢地将辛酸(1%重量/体积)加入回溶“I+II+III”沉淀物的溶液中。将加入辛酸后所获得的溶液的PH值调整至4.8，且持续搅拌该溶液60分钟。
[0102]1.2深层过滤
[0103]将所获得的溶液以SEITZ?T260滤膜(Pall Corporation)进行深层过滤。该过滤阻挡“I+II+III”沉淀物中的过滤佐剂，以及因加入辛酸所产生的蛋白质沉淀。
[0104]为了获得最佳的过滤产量，可调整样本的pH值。
[0105]过滤后，蛋白质溶液的pH值仅被调整为6.0。pH值由4.8调整至6.0会产生少量的沉淀(不可溶的多价免疫球蛋白)并被滤膜阻挡，因而降低多价免疫球蛋白的过滤产率。
[0106]滤膜的冲洗体积(apyrogenous purified water)和初始样本的体积相同，以获得
最佳的最终产量。[0107]1.3流体化床的“混合型”层析
[0108]操作条件如下所示:
[0109].平衡和清洗缓冲液:20mM Na/Na2P04, pH6。
[0110].冲提缓冲液:20mM 甘氨酸 /20mM NaCl，pH9.8。
[0111]利用甘氨酸/NaCl缓冲液的pH影响进行选择冲提，可通过简单地稀释(导电度及pH值的调整)，以获得可注入离子交换管柱(TMAE Fractogel)的样本。
[0112]1.4溶剂/界面活性剂的处理
[0113]将由实施例1.3的流体化床“混合型”层析所获得的冲提液以溶剂/界面活性剂进行病毒去活化处理，如Neurath和Horowitz (US4, 764, 369)所不。
[0114]10倍浓缩溶剂/界面活性剂混合物含有3%的TnBP (磷酸三丁酯)和10%的辛苯聚醇(Octoxinol)。冲提液中的最终浓度为0.3%的TnBP和1%的辛苯聚醇。
[0115]经I小时的去活化后，将冲提液的pH值调整至9.0，并以水稀释，使导电度小于I, 100 μ S/cm。
[0116] 1.5离子交换层析
[0117]所使用的离子交换树酯为TM A E-F rac toge I (M erc k)。
[0118].预平衡缓冲液:甘胺酸80mM/NaC180mM，pH9。
[0119].平衡缓冲液:甘胺酸9mM/NaC19mM，pH9。
[0120]在注入样本后，以平衡缓冲液清洗，并接着以pH6.2的20mM Na/Na2P04缓冲液进行冲提。
[0121]1.6亲和性层析
[0122]所使用的亲和性树酯为Iso A/Iso B Hypercel (Pall Corporation)
[0123]将TMAE层析的冲提液以亲和性层析处理，以移除抗-A和抗-B抗体。
[0124]所期望的多价免疫球蛋白会通过管柱，不会被阻挡下来。
[0125].于去离子水中平衡树酯
[0126].不清洗管柱，回收未吸附附的部分。
[0127]1.7 过滤
[0128]由亲和性层析所获得的蛋白质溶液以深层滤膜90LA CUNO(3M)过滤，接着以孔隙
0.2 μ m的滤膜过滤。以水冲洗滤膜,并合并冲洗液和滤液。
[0129]1.8纳米过滤
[0130]前述ρΗ4.5 的滤液先以孔径 0.1 μ m 的 Fluorodyne II 滤膜(Pall Corporation)进行预过滤，并以DV5滤膜(Pall Corporation)进行纳米过滤,接着以Planova20N滤膜(Asahi)进行过滤。
[0131]L 9 配制
[0132]以30kDa阀值进行超过滤，将产物前-浓缩至约80g/L，接着以相同体积进行滤析(diafiltered)直到导电度〈600 μ S/cm。接着，制备该产物并将蛋白质浓度调整至50g/L。
[0133]实施例2:以本发明方法获得试产规模的多价免疫球蛋白浓缩物
[0134]2.1将“I+II+III”沉淀物回溶至溶液中
[0135]使用“I+II+III”沉淀物作为起始物，其可参照Cohn或Kistler和Nitschmann方法(1962，Vox Sang.7，414)，由血浆成分经乙醇处理后获得。将3kg的沉淀物回溶至12L的软化水中。将该混合物于10°c ±3°C下搅拌20分钟。接着，将温度上升至22°C ±2°C，并将辛酸(1%重量/体积)缓慢地加至回溶“Ι+Π+ΙΙΙ”沉淀物的溶液中。将加入辛酸后所获得的溶液的PH值调整至4.8，且持续搅拌该溶液60分钟。
[0136]2.2深层过滤
[0137]将所获的溶液以SEITZ?T260滤膜(Pall Corporation)进行深层过滤。该过滤会阻挡“I+II+III”沉淀物中的过滤佐剂以及因加入辛酸所产生的蛋白质沉淀。对该测试，所使用的表面积为8.7kg沉淀物/m2过滤介质。
[0138]滤膜的冲洗体积(apyrogenous purified water)和初始样本的体积相同，即15L,以获得最佳的最终产率。
[0139]2.3流体化床的“混合型”层析
[0140]所使用的层析树酯为Rhobust IGIV gel (Upfront)。
[0141]直径IOcm的管柱中具有4.3L的树酯。
[0142]操作条件如下所示:
[0143].平衡和清洗缓冲液:20mM Na/Na2P04，pH6。
[0144].冲提缓冲液:20mM 甘氨酸 /20mM NaCl，pH9.8。
[0145]2.4溶剂/界面活性剂的处理
[0146]将由流体化床“混 合型”层析所获得的冲提液以溶剂/界面活性剂进行病毒去活化处理，如 Neurath 和 Horowitz (US4, 764, 369)所不。
[0147]10倍浓缩的溶剂/界面活性剂混合物含有3%的TnBP (磷酸三丁酯)和10%的辛苯聚醇(Octoxinol)。冲提液中的最终浓度为0.3%的TnBP和1%的辛苯聚醇。
[0148]经I小时的去活化后，将冲提液的pH值调整至9.0，并以水稀释，使导电度小于
I,100 μ S/cm。
[0149]2.5离子交换层析
[0150]所使用的离子交换树酯为BMD-TMAE Fractogel? (Merck)
[0151]直径12.7cm的管柱中具有4L的树酯。
[0152].预平衡缓冲液:甘氨酸80mM/NaC180mM，pH9。
[0153].平衡缓冲液:甘氨酸9mM/NaC19mM，pH9。
[0154]在注入样本后，以平衡缓冲液清洗。
[0155]接着，以pH6.2的20mM Na/Na2P04缓冲液进行冲提。
[0156]2.6亲和性层析
[0157]所使用的亲和性树酯为Iso A/Iso B Hypercel (Pall Corporation)。
[0158]直径7cm的的管柱中具有154mL的树酯。
[0159]将TMAE层析的冲提液以亲和性层析处理，以移除抗-A和抗-B抗体。所欲的多价免疫球蛋白会通过管柱，不会被阻挡下来。
[0160].于去离子水中平衡树酯。
[0161].不清洗管柱，将非吸附的部分回收。
[0162]2.7 过滤
[0163]将由Iso A/Iso B Hypercel亲和性层析所获得的蛋白质溶液以深层滤膜90LACUNO (3M)过滤，接着以孔隙0.2 μ m的滤膜过滤。以水冲洗滤膜,并合并冲洗液和滤液。[0164]2.8纳米过滤
[0165]前述ρΗ4.5 的滤液先以孔径 0.1 μ m 的 Fluorodyne II 滤膜(Pall Corporation)进行预过滤，并以DV50滤膜(Pall Corporation)进行纳米过滤,接着以Planova20N滤膜(Asahi)进行过滤。
[0166]2.9 配制
[0167]以30kDa阀值进行超过滤,将产物预浓缩(pre-concentrated)至约80g/L,接着以相同体积进行滤析(diafiltered)直到导电度〈600 μ S/cm。接着,制备所述产物并将蛋白质浓度调整至50g/L。
[0168]实施例3:产量的方法
[0169]依照本发明实施例1且特别是实施例3的方法，以三个不同的“I+II+III”沉淀物进行个3个生产批次。以1%的辛酸移除蛋白酶。利用SEITZ T2600板式压滤机进行过滤。
[0170]对照组批次依专利申请EP1385886所示的方法进行处理。
[0171]所述新方法的产量如下表所示:
[0172]在配制浓缩步骤阶段的累积产量(g)/蛋白质或血浆Ig(L)
[0173]
【权利要求】
1.一种制造人类多价免疫球蛋白浓缩物的方法，所述多价免疫球蛋白来自血浆初始溶液或富含免疫球蛋白的血浆成分，其特征在于包括: (a)利用辛酸移除污染蛋白以获得不含蛋白酶的溶液的步骤， (b)之后对所述不含蛋白酶的溶液进行流体化床层析步骤， 所述方法获得产率大于每公升血浆4.5g免疫球蛋白的人类多价免疫球蛋白浓缩物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述辛酸的使用浓度为0.5至1.5%，优选的为0.8至1.2%，更佳为0.9至1.1%。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述利用辛酸移除污染蛋白的步骤(a)于ρΗ4.3至4.9下进行，优选的为ρΗ4.6至4.8。
4.根据权利要求1至3任意一项所述的方法，其中，在所述利用辛酸移除污染蛋白的步骤(a)和流体化床层析步骤(b)之间，还包括在酸性pH值下的澄清步骤，优选的为深层过滤。
5.根据权利要求1至4任意一项所述的方法，其中所述不含蛋白酶的溶液的流体化床层析步骤(b)是以离子交换型、亲和型、“伪亲和型”或“混合型”的层析载体进行。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述“混合型”的流体化床层析步骤包括: -添加至已事先利用pH值为4.5至8的缓冲液预平衡的层析管柱，所述溶液经过深层过滤的澄清步骤，且事先调整至相同的pH值， -以缓冲溶液清洗所述管柱直到管柱中所有未吸附的蛋白都被移除， -以PH值为8至10的冲提缓冲液冲提吸附于所述管柱上的多价免疫球蛋白，以及 -回收富含人类多价免疫球蛋白的溶液。
7.根据权利要求1至6任意一项所述的方法，还包括在步骤(b)后有一个或多个下列步骤: (i)病毒去活化步骤， (?)对上述步骤所获得的溶液进行的阴离子交换层析步骤， (iii)移除上述步骤所获得的溶液中抗-A和抗-B抗体的步骤， (iv)通过孔径100至15nm的纳米滤膜进行的过滤步骤， (V)将上述步骤所获得的溶液经超过滤的浓缩步骤和配制步骤，以及 (vi)常规的消毒过滤步骤。
8.根据权利要求1至7任意一项所述的方法，其中所述起始溶液为经乙醇分离或层析分离的富含免疫球蛋白的血浆成分。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述起始溶液为由乙醇分离的血浆成分所获得的“ I+II+III ”沉淀物或“ II+III ”沉淀物，且回溶至溶液中。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述“I+II+III”沉淀物或“II+III”沉淀物回溶至经纯化的注射用水或一含离子的溶液中。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述含离子的溶液为包含NaCl浓度小于或等于20mM的溶液，优选的为5至15mM，优选的等于10mM。
12.根据权利要求8至11任意一项所述的方法，其中所述“I+II+III”沉淀物或“II+III”沉淀物以CaCl2溶液处理，所述CaCl2浓度小于或等于20mM，优选的为5至15mM，优选的为IOmM的CaCl2溶液。
13.根据权利要求1至12任意一项所述的方法，包括: (i)一利用辛酸移除污染蛋白的步骤， (?) 一深层过滤的澄清步骤， (iii)一“混合型”流体化床层析步骤， (iv)一经溶剂/界面活性剂处理的病毒去活化步骤， (v)一离子交换层析步骤， (vi)—移除抗-A和抗-B抗体的步骤， (vii)—通过孔径100至15nm的纳米滤膜的过滤， (viii)一将上述步骤所获得的溶液经超过滤的浓缩步骤和配制步骤，之后进行常规的消毒过滤步骤。
14.根据权利要求1至13任意一项所述的方法，还包括下列步骤: (a)将一个或多个药学上可接受的稳定剂添加至权利要求1至13任意一项所述的人类多价免疫球蛋白浓缩物中，以及 (b)可选择性地冷冻或冻干所述由上述步骤所获得的药学组合物； 使所述药学组合物为一液体、冷冻或冻干形式。
15.一种由权利要求1至13任意一项所述的方法所获得的人类多价免疫球蛋白浓缩物，其特征在于所述浓缩物的抗-补体活性小于30%。
16.一种液体、冷冻或冻干的人类多价免疫球蛋白组合物在制备治疗下列病理的药物中的应用，所述病理是从下列所组成的组中选择:脱髓鞘性神经炎、多发性硬化症、兰伯特-伊顿肌无力症候群、皮肌炎，用于原发性免疫缺陷的替代治疗，例如，先天性丙球蛋白缺乏症、先天性低丙球蛋白缺乏症、多样性免疫缺乏症、严重复合型免疫缺乏症、WiskottAldrich症候群、严重性二次免疫球蛋白低下和反复感染的多发性骨髓瘤或慢性淋巴白血病、HIV-感染病童的反复感染、或治疗免疫球蛋白低下或体液免疫功能障碍的原发性免疫缺陷、用于治疗体液性免疫的二次性免疫缺陷，特别是，免疫球蛋白低下和反复感染相关的慢性淋巴细胞白血病或多发性骨髓瘤、感染相关的免疫球蛋白低下的干细胞移植、以及治疗重大出血风险或改正血小板数量的医疗或手术前的成人和儿童特发性血小板减少性紫癒(ITP)、鸟弹样网膜脉络膜病变(Birdshot retinochorioditis) > Guillain-Barre症候群、多源性运动神经病变(MMN)、慢性脱髓鞘性神经炎(CIDP)及川崎症(Kawasaki’ sdisease)
17.根据权利要求16所述的应用，其中所述多价免疫球蛋白的药学组合物为以权利要求14所述的方法所获得的组合物。
【文档编号】C07K1/36GK103687874SQ201280034086
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年7月11日 优先权日:2011年7月11日
【发明者】阿布迪莎特·克托罗, 达米恩·巴塔耶, 乔治斯·米修 申请人:法国分裂与生物技术实验室