可调控启动子的制作方法
【专利摘要】一种通过培养包含表达构建体的重组真核细胞系来产生感兴趣蛋白质(POI)的方法，所述表达载体包含可调控的启动子和在所述启动子的转录调控下的编码POI的核酸分子，所述方法包括以下步骤：a)用阻遏所述启动子的基础碳源培养所述细胞系，b)用使所述启动子去阻遏的有限量的补充碳源培养所述细胞系，从而诱导POI以相比于天然pGAP启动子至少15％的转录速率产生，和c)产生并回收所述POI；以及另外地，分离的可调控的启动子和相应的表达系统。
【专利说明】可调fe启动子
发明领域
[0001]本发明涉及可调控启动子和在真核细胞培养中在可调控启动子的控制下产生感兴趣蛋白质的方法。
[0002]发明背景
[0003]已使用真核宿主实现重组蛋白质的成功产生。最突出的例子是酵母如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)或多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、丝状真菌如泡盛曲霉(Aspergillus awamori)或里氏木霉(Trichoderma reesei)、或哺乳动物细胞如例如CHO细胞。尽管容易以高比率实现一些蛋白质的产生，但还有许多其他蛋白质仅在相当低的水平获得。
[0004]基因在宿主生物体中的异源表达通常需要允许稳定转化宿主生物体的载体。载体会提供基因和临近编码序列5’端的功能性启动子。由此，转录由该启动子序列调控和启动。迄今使用的大多数启动子源自编码通常以高浓度存在于细胞中的蛋白质的基因。
[0005]EP0103409A2披露了使用与糖酵解途径中特定酶的表达有关的酵母启动子，即牵涉丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸甘油酸变位酶、己糖激酶I和2、葡糖激酶、磷酸果糖激酶、醛缩酶和糖酵解调控基因的表达的启动子。
[0006]W097/44470描述了来自解脂西洋蓍霉(Yarrowia Iipolytica)的用于翻译延长因子I(TEFl)蛋白和用于核糖体蛋白S7的酵母启动子，其适于在酵母中异源表达蛋白质，而EP1951877A1描述了将巴斯德毕赤酵母TEFl启动子用于产生异源蛋白质。
[0007]W02005003310提供用于在酵母中表达感兴趣编码序列的方法，其使用来自产油酵母解脂西洋蓍霉的甘油醛-3-磷酸脱氢酶或磷酸甘油酸变位酶的启动子。
[0008]源自牵涉巴斯德毕赤酵母的甲醇代谢途径的基因的启动子序列披露在US4808537 和 US4855231(醇氧化酶 A0X1、A0X2)和 US6730499B1 (甲醛脱氢酶 FLD1)中。US20080153126A1包括基于AOXl启动子的突变体启动子序列。
[0009]AOXl启动子仅应答甲醇而受到诱导并受其他碳源如葡萄糖或乙醇阻遏。甲醇的缺点在于其不适用于产生某些产物，因为其因毒性和易燃性而有潜在危险。因此，寻求AOXl启动子的备选物。
[0010]US2008299616A1引入苹果酸合酶(MLSl)基因的调控序列用于在巴斯德毕赤酵母中的异源基因表达，其在含有葡萄糖的培养基中受到阻遏，而在葡萄糖饥饿条件下或在存在乙酸盐时去阻遏。然而，不将该系统视为适用于有效的产生方法，因为MLSl启动子在去阻遏条件下较弱且活性较低。
[0011]ScholerIP Schuller (Mo1.Cell Biol.199414(6):3613-22)描述了异柠檬酸裂合
酶基因ICLl的调控区，其在将细胞从发酵生长条件转移至非发酵生长条件后去阻遏。
[0012]W02008063302A2描述了将源自巴斯德毕赤酵母的ADHl (醇脱氢酶)、ENOl (烯醇化酶)和GUTl基因的新的可诱导启动子用于异源蛋白质的表达，CN1966688A中为巴斯德毕赤酵母omega3-脂肪酸脱氢酶启动子序列，而W0002007117062A1中为巴斯德毕赤酵母来源的自动诱导(auto-1nducible)的NPS启动子,其通过磷限制诱导。[0013]W02008128701A2描述了新的启动子的使用，其中源自巴斯德毕赤酵母的THI3 (硫胺代谢)基因的启动子在含有硫胺的培养基中受到阻遏，并在硫胺耗尽时去阻遏。
[0014]US2009325241A1描述了一种采用木糖可诱导的启动子(FAS2启动子)在酵母细胞中产生乙醇的方法。
[0015]期望提供改进的重组真核细胞系来产生能以高产率分离的发酵产物。因此，本发明的目标是提供适用于重组生产方法的备选的调控元件，其为简单且有效的。
[0016]发明概述
[0017]所述目标由所要求保护的主题解决。
[0018]依照本发明，提供一种通过培养包含表达构建体的重组真核细胞系来产生感兴趣蛋白质(POI)的方法，所述表达载体包含可调控的启动子和在所述启动子的转录调控下的编码POI的核酸分子，所述方法包括以下步骤:
[0019]a)用阻遏所述启动子的基础碳源基础碳源培养所述细胞系，
[0020]b)用使所述启动子去阻遏的无或有限量的补充碳源培养所述细胞系，从而以相比于所述细胞的天然PGAP启动子至少15%的转录速率诱导所述POI的产生，和
[0021]c)产生并回收所述Ρ0Ι。
[0022]所述培养步骤具体地包括在所述碳源的存在下，由此在包含所述碳源的培养基中，或在步骤b)中还在不存 在补充碳源的情况下培养所述细胞系。
[0023]对所述POI产生的诱导具体指对转录的诱导，具体包括所述POI的进一步的翻译和任选地表达。
[0024]所述转录速率具体指在完全诱导所述启动子时获得的转录本的量。如果培养条件提供大概最大的诱导，例如以低于0.4g/L，优选低于0.04g/L，特定地低于0.02g/L的葡萄糖浓度，那么所述启动子视为去阻遏且完全诱导的。优选地，完全诱导的启动子显示相比于天然PGAP启动子至少15 %，优选至少20 %，更优选至少30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90%和至少100%或甚至更高为至少150%或至少200%的转录速率。所述转录速率可以例如通过报告基因如eGFP的转录本的量测定，如记载于下文实施例部分的，其显示在溶液中培养克隆时PGl启动子相比于天然pGAP启动子至少50%的相对高的转录速率。或者，所述转录速率可通过在微阵列上的转录强度测定，其中微阵列数据显示受阻遏和去阻遏状态之间表达水平的差异和在完全诱导状态中相比于天然PGAP启动子的高信号强度。这类微阵列数据具体地对于PGl显示超过200%的转录速率，对于pG3和pG4超过30%，对于pG6超过60 %，对于pG7超过30 %，对于pG8超过20 %的转录速率(每个值均与天然pGAP相比)。发现现有技术中的启动子太弱而不适用于本发明的目的。
[0025]具体地，所述天然pGAP启动子在所述重组真核细胞中以类似于在同一物种或菌株的天然真核细胞中的方式而具有活性(包括未经修饰(非重组)或重组真核细胞)。这类天然PGAP启动子通常理解为内源启动子，如此，是真核细胞同源性的，且充当标准或参照启动子用于比较目的。
[0026]例如，巴斯德毕赤酵母的天然pGAP启动子是巴斯德毕赤酵母中的未经修饰的内源性启动子序列，如用于控制中巴斯德毕赤酵母中GAPDH表达的，例如具有图13中显示的序列:巴斯德毕赤酵母(GS115)的天然pGAP启动子序列(SEQ ID13)。如果将巴斯德毕赤酵母用作产生依照本发明的POI的宿主，那么将依照本发明的启动子的转录强度或速率与巴斯德毕赤酵母的这类天然PGAP启动子相比较。
[0027]再举一个例子，酿酒酵母的天然pGAP启动子是酿酒酵母中未经修饰的内源性启动子序列，如用于控制酿酒酵母中GAPDH表达的。如果将酿酒酵母用作用于产生依照本发明的POI的宿主，那么将依照本发明的启动子的转录强度或速率与酿酒酵母的这类天然PGAP启动子相比较。
[0028]因此，通常将依照本发明的启动子的相对转录强度或速率与用作产生POI的宿主的同一物种或菌株的细胞的天然PGAP启动子相比较。
[0029]依照一个具体的实施方案，所述基础碳源不同于补充碳源，例如定量和/或定性上不同的。定量上的不同可以提供不同的条件来阻遏或去阻遏启动子活性。
[0030]依照一个进一步的具体的实施方案，所述基础和补充碳源包含相同类型的分子或糖类，优选以不同的浓度。依照再一个具体的实施方案，所述碳源是两种或更多种不同碳源的混合物。
[0031]可使用任何适用于真核细胞培养的有机碳。依照一个具体的实施方案，所述碳源是己糖如葡萄糖、果糖、半乳糖或甘露糖，二糖如蔗糖，醇如甘油或乙醇，或其混合物。
[0032]依照一个具体的优选实施方案，所述基础碳源选自下组:葡萄糖、甘油、乙醇、或其混合物、和复合营养材料(complex nutrient material)。依照一个优选的实施方案,所述基础碳源是甘油。
[0033]依照又一个具 体的实施方案，所述补充碳源是己糖如葡萄糖、果糖、半乳糖和甘露糖，二糖如蔗糖，醇如甘油或乙醇，或其混合物。依照一个优选的实施方案，所述补充碳源是
葡萄糖。
[0034]具体地，所述方法可采用甘油作为基础碳源，葡萄糖作为补充碳源。
[0035]可通过具体手段适宜地实现去阻遏条件。任选地，步骤b)采用提供无或有限量的补充碳源的给料培养基。
[0036]具体地，所述给料培养基是化学性质确定的且无甲醇的。
[0037]所述给料培养基可以液体形式或以其他备选的形式如固体(例如片剂或其他持续释放手段)或气体(例如二氧化碳)添加到培养基中。然而，依照一个优选的实施方案，添加到细胞培养基的所述有限量的补充碳源可以甚至为O。优选地，补充碳源在培养基中的浓度为Ο-lg/L，优选低于0.6g/L，更优选低于0.3g/L，更优选低于0.lg/L，优选l_50mg/L，更优选l-10mg/L，具体地优选lmg/L或甚至更低，如低于如用适宜标准测定法测量的检测限，例如在由生长细胞培养物消耗时测定为培养基中的残余浓度。
[0038]在一个优选的方法中，所述有限量的补充碳源提供细胞培养物中低于检测限的残余量,如在生产阶段结束时或在发酵过程的输出中，优选在收获发酵产物时在发酵液中测定的。
[0039]优选地，所述有限量的补充碳源是生长限制性的以保持范围在0.02h-1至0.2h-1，优选0.02h-1至0.15h-1内的特定生长速率。
[0040]依照本发明的一个具体方面，所述启动子是巴斯德毕赤酵母启动子或其功能活性变体。
[0041]在本文中，依照本发明的启动子应总是指本文中描述的序列及其功能活性变体。如下文详细解释的，这类变体包括源自巴斯德毕赤酵母以外的物种的同源物和类似物。[0042]依照本发明的方法可采用为巴斯德毕赤酵母的野生型启动子或其功能活性变体的启动子，例如能控制野生型或重组真核细胞中特定基因转录的，例如选定基因的野生型启动子，所述基因选自下组:G1 (SEQ ID7)，如编码(高亲和力)葡萄糖运输器的，G3 (SEQID8)、G4(SEQ ID9)，如编码线粒体醛脱氢酶的，G6 (SEQ ID10)、G7(SEQ IDl I)，如编码主要易化物糖运输器家族(major facilitator sugar transporter family)的成员的，或 G8(SEQID12)，如编码Gtil_Pac2超家族成员的，或其功能活性变体。
[0043]依照本发明，具体地提供了启动子或其功能活性变体，其将与野生型酵母细胞中的这类基因之一天然关联。
[0044]依照一个具体的实施方案，所述细胞系选自下组:哺乳动物、昆虫、酵母、丝状真菌和植物细胞系，优选为酵母。
[0045]具体地，酵母选自下组:毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、球拟酵母属(Torulopsis)、Arxula、汉逊酵母属(Hensenula)、西洋蓍霉属(Yarrowia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、酵母属(Saccharomyces)、Komagataella,优选甲基营养型酵母。
[0046]一种具体优选的酵母是巴斯德毕赤酵母、Komagataella pastoris、K.phaffi1、或K.pseudopastoriso
[0047]依照又一个具体的实施方案，所述启动子不与编码POI的核苷酸序列天然关联。
[0048]具体地，POI是真核细胞蛋白质，优选为哺乳动物蛋白质。
[0049]依照本发明产生的POI可以是多聚体蛋白，优选为二聚体或四聚体。 [0050]依照本发明的一个方面，所述POI是重组或异源蛋白质，优选选自治疗性蛋白质包括抗体或其片段、酶和肽、蛋白质抗生素、毒素融合蛋白、糖-蛋白质偶联物、结构蛋白、调节蛋白、疫苗和疫苗样蛋白或颗粒、加工酶、生长因子、激素和细胞因子、或POI的代谢物。
[0051]一种具体的POI是抗原结合分子如抗体或其片段。特异性的POI有抗体如单克隆抗体(mAb)、免疫球蛋白(Ig)或免疫球蛋白G类(IgG)、重链抗体(HcAb)、或其片段如片段-抗原结合(Fab)、Fd、单链可变片段(scFv)、或其工程化变体如例如Fv 二聚体(双抗体)、Fv三聚体(三抗体)、Fv四聚体或小型抗体(minibody)和单域抗体如VH或VHH或V-NAR0
[0052]依照一个具体的实施方案，发酵产物是使用Ρ0Ι、其代谢物或衍生物制备的。
[0053]依照本发明的另一个方面，提供一种用于调控重组真核细胞中在碳源可调控启动子的转录控制下的POI表达的方法，所述启动子相比于所述细胞的天然pGAP启动子具有至少15%的转录强度，其中所述表达在限制碳源的条件下诱导。碳源可调控启动子优选相比于参照PGAP启动子具有至少20%的转录强度，具体地相比于天然pGAP启动子有如上文就转录速率而言描述的转录强度。因此，完全诱导的启动子相比于细胞的天然PGAP启动子具有优选至少15%，优选至少20%，更优选至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和至少100%或至少150%或至少200%的甚至更高的转录强度，如在选择用于产生POI的真核细胞中测定的。
[0054]在一个优选的实施方案中，使用在去阻遏状态具有转录活性或转录强度的这类启动子，其在去阻遏状态中相比于阻遏状态为至少2倍，更优选至少5倍，甚至更优选至少10倍，更优选至少20倍，更优选至少30、40、50、或100倍。[0055]依照本发明的另一个方面，提供一种在重组真核细胞中在碳源可调控启动子的转录控制下产生POI的方法，其中所述启动子相比于所述细胞的天然pGAP启动子具有如上文所述的，即至少15%的转录强度。所述碳源可调控启动子相比于参照pGAP启动子优选具有至少20%，更优选至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和至少100%或至少150%或至少200%的甚至更高的转录强度。在一个优选的实施方案中，使用在去阻遏状态具有转录活性的这类启动子，其在去阻遏状态相比于阻遏状态为至少2倍，更优选至少5倍，甚至更优选至少10倍，更优选至少20倍，更优选至少30、40、50、或100倍。适宜地，将依照本发明的具体启动子用在这类方法中。
[0056]在依照本发明的一个具体的优选的方法中，所述启动子是包含选自下组的核酸序列的可调控启动子:
[0057]a) pGl(SEQ IDl)、pG3 (SEQ ID2)、pG4 (SEQ ID4)、pG6 (SEQ ID3)、pG7 (SEQ ID5)、或pG8 (SEQ ID6)；
[0058]b)与以下具有至少 60% 同源性的序列:pGl (SEQ IDl)、pG3(SEQ ID2)、pG4(SEQID4)、pG6 (SEQ ID3)、pG7 (SEQ ID5)、或 pG8 (SEQ ID6)；
[0059]c)在严格条件下与以下杂交的序列:pGl(SEQ IDl)、pG3(SEQ ID2)、pG4(SEQ ID4)、pG6 (SEQ ID3)、pG7 (SEQ ID5)、或 pG8 (SEQ ID6);和
[0060]d)源自a)、b)或c)的片段或变体，
[0061]其中所述启动子是功能活性的启动子，其为碳源可调控的启动子，所述启动子在重组真核细胞中能以相比于所述细胞的天然pGAP启动子至少15%的转录速率表达POI。
[0062]具体地，pGl(SEQ IDl)、pG3 (SEQ ID2)、pG4 (SEQ ID4)、pG6 (SEQ ID3)、pG7 (SEQ ID5)或pG8(SEQ ID6)的变体是选自下组的功能活性变体:具有至少约60%核苷酸序列同一性的同源物，通过在序列内或序列远端之一或两端处一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代对亲本核苷酸序列进行修饰可获得的同源物(优选具有至少200bp的核苷酸序列，优选至少250bp,优选至少300bp,更优选至少400bp,至少500bp,至少600bp,至少700bp,至少800bp,至少900bp,或至少1000bp),以及源自巴斯德毕赤酵母以外的物种的类似物。
[0063]依照本发明的启动子的一些优选的功能活性变体是pGl、pG3、pG4、pG6、pG7或pG8启动子核苷酸序列中任一种的片段，优选包含启动子核苷酸序列3’端的片段，例如源自所述启动子核苷酸序列之一的核苷酸序列，其具有具体的长度和在5’末端区域的缺失，例如在5’端核苷酸序列的切割，从而获得范围从3’端到变化的5’端的具体长度，如核苷酸序列长度至少200bp,优选至少250bp,优选至少300bp,更优选至少400bp,至少500bp,至少600bp,至少 700bp,至少 800bp,至少 900bp、或至少 lOOObp。
[0064]已证实包含或组成为这类片段的例示性变体为功能活性的，所述片段例如具有范围为200至1000bp的具体长度，优选范围为250至lOOObp，更优选范围为300至lOOObp，例如包含3 ’末端序列的片段。例如，pGl的功能活性变体选自下组:pGla (SEQ ID41)，pGlb (SEQID42)，pGlc (SEQ ID43)，pGld (SEQ ID44)，pGle (SEQ ID45)和 pGlf (SEQ ID46)，如此，一种核苷酸序列范围为300-1000bp，其包含3’末端序列直至核苷酸1001。
[0065]依照本发明的另一个方面，提供分离的核酸，其包含选自下组的核酸序列:
[0066]a) pGl (SEQ IDl)、pG3 (SEQ ID2)、pG6 (SEQ ID3)、pG7 (SEQ ID5)或 pG8 (SEQ ID6)，
[0067]b)与以下具有至少 60% 同源性的序列:pGl (SEQ IDl)、pG3(SEQ ID2)、pG6 (SEQID3)、pG7 (SEQ ID5)或 pG8 (SEQ ID6)，
[0068]c)在严格条件下与以下杂交的序列:pGl(SEQ IDl)、pG3(SEQ ID2)、pG6(SEQ ID3)、pG7 (SEQ ID5)或 pG8 (SEQ ID6)，和
[0069]d)源自a)、b)或c)的片段或变体，
[0070]其中所述核酸包含功能活性的启动子，其为碳源可调控的启动子，所述启动子在重组真核细胞中能以相比于所述细胞的天然pGAP启动子至少15%的转录速率表达POI。
[0071]具体地，pGl(SEQ IDl)、pG3 (SEQ ID2)、pG6 (SEQ ID3)、pG7 (SEQ ID5)或 pG8 (SEQID6)的变体是选自下组的功能活性变体:具有至少约60%核苷酸序列同一性的同源物，通过在序列内或序列远端之一或两端处一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代对亲本核苷酸序列进行修饰可获得的同源物(优选具有至少200bp，优选至少250bp，优选至少300bp，更优选至少400bp,至少500bp,至少600bp,至少700bp,至少800bp,至少900bp,或至少1000bp的核苷酸序列)，以及源自巴斯德毕赤酵母以外的物种的类似物。
[0072]依照本发明启动子的一些优选的功能活性变体是pGl、pG3、pG6、pG7或pG8启动子核苷酸序列中任一种的片段，优选包含启动子核苷酸序列3’端的片段，例如源自所述启动子核苷酸序列之一的核苷酸序列，其具有具体的长度和在5’末端区域的缺失，例如在5’端核苷酸序列的切割，从而获得范围从3’端到变化的5’端的具体长度，如核苷酸序列长度至少200bp,优选至少250bp,优选至少300bp,更优选至少400bp,至少500bp,至少600bp,至少700bp,至少800bp,至少900bp,或至少lOOObp。
[0073]已证实包含或组成为 这类片段的例示性变体为功能活性的，所述片段例如具有范围为200至1000bp的具体长度，优选范围为250至lOOObp，更优选范围为300至lOOObp，例如包含3’末端序列的片段。例如，pGl的功能活性变体选自下组:pGla(SEQ ID41)、pGlb(SEQID42)、pGlc(SEQ ID43)、pGld(SEQ ID44)、pGle(SEQ ID45)和 pGlf (SEQ ID46)，如此，一种核苷酸序列范围为300-1000bp，其包含3’末端序列直至核苷酸1001。
[0074]所述碳源可调控启动子优选具有如上文描述的转录强度，相比于参照pGAP启动子优选具有至少20%，更优选相比于天然pGAP启动子至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和至少100%或甚至更高的至少150%或至少200%的转录强度。在一个优选的实施方案中，使用在去阻遏状态具有转录活性的这类启动子，其在去阻遏状态相比于阻遏状态为至少2倍，更优选至少5倍，甚至更优选至少10倍，更优选至少20倍，更优选至少30、40、50、或100倍。适宜地，将依照本发明的具体启动子用在这类方法中。
[0075]依照本发明的再一个方面，提供一种表达构建体，其包含依照本发明的启动子可操作地连接于在所述启动子转录控制下的编码POI的核苷酸序列，所述启动子与POI的编码序列不天然关联。
[0076]本发明的又一个方面指包含依照本发明构建体的载体。
[0077]本发明的再一个方面指包含依照本发明的构建体或载体的重组真核细胞。
[0078]具体地，所述细胞选自下组:哺乳动物、昆虫、酵母、丝状真菌和植物细胞系，优选为酵母。
[0079]所述酵母可适宜地选自下组:毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)、球拟酵母属(Torulopsis)、Arxula、汉逊酵母属(Hensenula)、西洋蓍霉属(Yarrowia)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、酵母属(Saccharomyces)、Komagataella,优选甲基营养型酵母。[0080]优选地，所述酵母是巴斯德毕赤酵母、Komagataella pastoris、K.phaffi1、或K.pseudopastoriso
[0081]依照一个具体的实施方案，采用一种细胞，其在存在过剩碳源的情况下相对于有限碳源的条件具有更高的特定生长速率。
[0082]本发明的又一个方面指将本发明的重组真核细胞用于产生Ρ0Ι。
[0083]依照本发明的一个别的方面，提供一种方法来从真核细胞筛选或鉴定碳源可调控启动子，包括以下步骤:
[0084]a)在存在碳源时，在细胞生长条件下以分批培养来培养真核细胞，
[0085]b)进一步在存在有限量的补充碳源时，以补料分批培养来培养所述细胞， [0086]c)提供步骤a)和b)的细胞培养物的样品，并
[0087]d)在所述样品中实施转录分析以鉴定出在步骤b)的细胞中比在步骤a)的细胞中显示更高转录强度的可调控启动子。
[0088]所述更高的转录强度可通过完全诱导状态中的转录强度测定，其为例如在葡萄糖有限的恒化器(chemostat)培养条件下获得的，其在去阻遏状态相比于阻遏状态为至少2倍，更优选至少5倍，甚至更优选至少10倍，更优选至少20倍，更优选至少30、40、50、或100倍。
[0089]优选地，所述转录分析是定量或半定量的，优选采用DNA微阵列、RNA测序和转录组分析。
[0090]附图简述
[0091]图1:巴斯德毕赤酵母的启动子序列pGl (SEQ IDl)。
[0092]图2:巴斯德毕赤酵母的启动子序列pG3 (SEQ ID2)。
[0093]图3:巴斯德毕赤酵母的启动子序列pG4 (SEQ ID4)。
[0094]图4:巴斯德毕赤酵母的启动子序列pG6 (SEQ ID3)。
[0095]图5:巴斯德毕赤酵母的启动子序列pG7 (SEQ ID5)。
[0096]图6:巴斯德毕赤酵母的启动子序列pG8 (SEQ ID6)。
[0097]图7:巴斯德毕赤酵母GSl 15基因组Gl基因的编码序列(SEQ ID7)。
[0098]图8:巴斯德毕赤酵母GSl 15基因组G3基因的编码序列(SEQ ID8)。
[0099]图9:巴斯德毕赤酵母GSl 15基因组G4基因的编码序列(SEQ ID9)。
[0100]图10:巴斯德毕赤酵母GS115基因组G6基因的编码序列(SEQ ID10)。
[0101]图11:巴斯德毕赤酵母GS115基因组G7基因的编码序列(SEQID11)。
[0102]图12:巴斯德毕赤酵母GS115基因组G8基因的编码序列(SEQ ID12)。
[0103]图13:巴斯德毕赤酵母(GSl 15)的天然pGAP启动子序列(SEQ ID13)
[0104]
【权利要求】
1.一种通过培养包含表达构建体的重组真核细胞系来产生感兴趣蛋白质(POI)的方法，所述表达载体包含可调控的启动子和在所述启动子的转录调控下的编码POI的核酸分子，所述方法包括以下步骤: a)用阻遏所述启动子的基础碳源基础碳源培养所述细胞系， b)用使所述启动子去阻遏的无补充碳源的条件或有有限量补充碳源的条件培养所述细胞系，从而诱导以相比于所述细胞的天然PGAP启动子至少15%的转录速率产生所述POI，并 c)产生并回收所述POI。
2.依照权利要求1的方法，其中所述基础碳源基础碳源选自下组:葡萄糖、甘油、乙醇、其混合物、和复合营养材料。
3.依照权利要求1或2的方法，其中所述补充碳源是诸如葡萄糖、果糖、半乳糖或甘露糖等己糖，诸如蔗糖等二糖，诸如甘油或乙醇等醇，或其混合物。
4.依照权利要求1至3中任一项的方法，其中所述步骤b)采用不提供或提供有限量的所述补充碳源的补料培养基，优选所述有限量为所述培养基中0-lg/L。
5.依照权利要求1至4中任一项的方法，其中所述有限量的补充碳源为生长限制性的，以保持特定生长速率在0.021h-1至0.21h-1，优选0.021h-1至0.151h-1内。
6.依照权利要求1至5中任一项的方法，其中所述启动子能控制野生型真核细胞中基因的转录，该基因选自下组 :G1 (SEQ ID7)、G3(SEQ ID8)、G4(SEQ ID9)、G6(SEQ ID10)、G7(SEQID11)和G8 (SEQ ID12)、或其功能活性变体。
7.依照权利要求6的方法，其中所述功能活性变体选自下组:具有至少约60%核苷酸序列同一性的同源物，通过在亲本核苷酸序列内或序列远端之一或两端处插入、缺失或取代一个或多个核苷酸而修饰得到的同源物，优选具有至少200bp的核苷酸序列，以及源自除巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)以外的物种的类似物。
8.依照权利要求6或7的方法，其中所述pGl的功能活性变体选自下组:pGla(SEQID41)、pGlb(SEQ ID42)、pGlc(SEQ ID43)、pGld(SEQ ID44)、pGle(SEQ ID45)和 pGlf (SEQID46)。
9.依照权利要求1至8中任一项的方法，其中所述细胞系选自下组:哺乳动物、昆虫、酵母、丝状真菌和植物细胞系，优选为酵母。
10.依照权利要求1至9中任一项的方法，其中所述POI为异源蛋白质，优选选自治疗性蛋白质包括抗体或其片段、酶和肽、蛋白质抗生素、毒素融合蛋白、碳水化合物-蛋白质偶联物、结构蛋白、调节蛋白、疫苗和疫苗样蛋白或颗粒、加工酶、生长因子、激素和细胞因子、或POI的代谢物。
11.用于调控POI在重组真核细胞中在碳源可调控启动子的转录控制下表达的方法，所述启动子相比于所述细胞的天然PGAP启动子具有至少15%的转录强度，其中所述表达在限制所述碳源的条件下诱导。
12.在重组真核细胞中在碳源可调控启动子的转录控制下产生POI的方法，其中所述启动子相比于所述细胞的天然pGAP启动子具有至少15%的转录强度。
13.依照权利要求1至12中任一项的方法，其中所述可调控启动子包含选自下组的核酸序列:a)pGl(SEQ IDl)、pG3 (SEQ ID2)、pG4(SEQ ID4)、pG6(SEQ ID3)、pG7(SEQ ID5)、或pG8 (SEQID6)； b)与以下具有至少60% 同源性的序列:pGl (SEQ IDl)、pG3(SEQ ID2)、pG4(SEQ ID4)、pG6 (SEQ ID3)、pG7 (SEQ ID5)、或 pG8 (SEQ ID6)； c)在严格条件下与以下杂交的序列:pGl(SEQ ID1)、pG3(SEQ ID2)、pG4(SEQ ID4)、pG6 (SEQ ID3)、pG7 (SEQ ID5)、或 pG8 (SEQ ID6);和 d)源自a)、b)或c)的片段或变体， 其中所述启动子是功能活性的启动子，其为碳源可调控的启动子，所述启动子在重组真核细胞中能以相比于所述细胞的天然pGAP启动子至少15%的转录速率表达所述POI。
14.依照权利要求13 的方法，其中所述 pGl (SEQ ID1)、pG3(SEQ ID2)、pG4(SEQ ID4)、pG6 (SEQ ID3)、pG7 (SEQ ID5)、或pG8 (SEQ ID6)的变体是选自下组的功能活性变体:具有至少约60%核苷酸序列同一性的同源物，通过在亲本核苷酸序列内或序列远端之一或两端处插入、缺失或取代一个或多个核苷酸而修饰得到的同源物，优选具有至少200bp的核苷酸序列，以及源自巴斯德毕赤酵母以外的物种的类似物。
15.依照权利要求13或14的方法，其中所述pGl的功能活性变体选自下组:pGla(SEQID41)、pGlb(SEQ ID42)、pGlc(SEQ ID43)、pGld(SEQ ID44)、pGle(SEQ ID45)和 pGlf (SEQID46)。
16.一种分离的核酸，其包含选自下组的核酸序列:
a)pGl(SEQ IDl)、pG3(SEQ ID2)、pG6 (SEQ ID3)、pG7 (SEQ ID5)、或 pG8 (SEQ ID6)； b)与以下具有至少60% 同源性的序列:pGl (SEQ ID1)、pG3(SEQ ID2)、pG6 (SEQ ID3)、pG7 (SEQ ID5)、或 pG8 (SEQ ID6)； c)在严格条件下与以下杂交的序列:pGl(SEQ ID1)、pG3(SEQ ID2)、pG6 (SEQ ID3)、pG7 (SEQ ID5)、或 pG8 (SEQ ID6);和 d)源自a)、b)或c)的片段或变体， 其中所述核酸包含功能活性的启动子，其为碳源可调控的启动子，所述启动子在重组真核细胞中能以相比于所述细胞的天然PGAP启动子至少15%的转录速率表达POI。
17.依照权利要求16 的核酸，其中所述 pGl (SEQ IDl)、pG3 (SEQ ID2)、pG6 (SEQ ID3)、pG7 (SEQ ID5)或pG8(SEQ ID6)的变体是选自下组的功能活性变体:具有至少约60%核苷酸序列同一性的同源物，通过在亲本核苷酸序列内或序列远端之一或两端处插入、缺失或取代一个或多个核苷酸而修饰得到的同源物，优选具有至少200bp的核苷酸序列，以及源自巴斯德毕赤酵母以外的物种的类似物。
18.依照权利要求16或17的核酸，其中所述pGl的功能活性变体选自下组:pGla(SEQID41)、pGlb(SEQ ID42)、pGlc(SEQ ID43)、pGld(SEQ ID44)、pGle(SEQ ID45)和 pGlf (SEQID46)。
19.一种表达构建体，其包含依照权利要求16至18的核酸可操作地连接于在所述启动子转录控制下的编码POI的核苷酸序列，所述核酸与编码所述POI的核苷酸序列不天然关联。
20.一种重组真核细胞，其包含权利要求19的构建体。
21.从真核细胞鉴定出碳源可调控启动子的方法，包括以下步骤:a)在存在碳源的情况下，在细胞生长条件下于分批培养中培养真核细胞， b)进一步在存在有限量的补充碳源的情况下，在补料分批培养中培养所述细胞， c)提供步骤a)和b)的细胞培养物的样品，并 d)在所述样品中实施转录分析以鉴定出在步骤b)的细胞中比在步骤a)的细胞中显示更高转录强度的可调 控启动子。
【文档编号】C07K14/39GK103998460SQ201280060753
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2012年10月5日 优先权日:2011年10月7日
【发明者】D.玛塔诺维克, B.加瑟, M.茂勒, R.普里尔霍佛, J.克雷恩, J.温格 申请人:隆扎有限公司