天山雪莲sikPIP1基因在培育抗寒和抗旱植物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种天山雪莲sikPIP1基因在培育抗寒植物中的应用。本发明从天山雪莲中克隆sikPIP1基因，并在转基因植物中得到表达，提高转基因植物的抗寒和抗旱性，通过该基因的过量表达，使植物的抗低温和耐干旱胁迫性能得到提高，最终获得抗低温和耐旱能力明显增强的植物。从天山雪莲中筛选、克隆出与抗寒直接相关的基因，将其用于农作物品种改良，具有巨大的经济价值。
【专利说明】天山雪莲sikPIPl基因在培育抗寒和抗旱植物中的应用
【技术领域】:
[0001]本发明涉及一种从菊科凤毛菊属植物天山雪莲(Saussurea involucrata Kar.etKir)中克隆得到sikPIPl基因，构建组成型植物表达载体，转化植物，并对抗寒和抗旱效果进行评价，以增加植物的抗寒和抗旱性能。
【背景技术】:
[0002]低温和干旱是常见的非生物胁迫，是影响农作物产量和品质的重要因素。低温和干旱胁迫可使植物光合作用降低，使细胞脱水，造成膜系统破坏，透性加大，积累活性氧，使位于膜上的酶活性紊乱，呼吸作用增强，能量产生和物质合成受阻，消耗增强，植物处于饥饿状态，严重影响了植物的正常生长发育，甚至导致死亡(郭子武，李宪利等，植物低温胁迫响应的生化与分子生物学机制研究进展，中国生态农业学报，2004，12(2):54-57)。
[0003]水孔蛋白(AQP)又称水通道蛋白，是水专一性通道蛋白，属于膜内在主体蛋白，普遍存在于动、植物及微生物中(Hofte G M, Hubbard L, Reizer J, et al.Vegetative andseed-specific isoforms of a putative solute transporter in the tonoplast ofArabidopsis thaliana[J].Plant Physiol, 1992,99:561-570.)。其种类繁多、分布广泛，与植物体内水分的快速、高效运输密切相关。水孔蛋白是一种小而高度疏水的跨膜蛋白，具有MIP家族结构的典型特征，晶体学和拓扑学研究表明，水孔蛋白具有由5个环(loop，A-E)相连的6个跨膜α螺旋及N端与C端组成，在膜上形成类似“水漏”状的构象。在拟南芥基因组中含有至少23个基因编码这一水孔蛋白家族成员，部分水孔蛋白已证明存在于质膜或液泡膜。AQP的调节机制可以大致分为两种:通过调节AQP的活性来调节其功能(如磷酸化)和通过改变膜上AQP的含量来调节跨膜水流动(如改变合成速率)。植物水孔蛋白基因可分为四类:质膜内在蛋白(PIPs)、液泡膜内在蛋白(TIPs)、NLM蛋白(NLMs)和小分子喊性内在蛋白(SIPs) (Chaumont F, Barrieu F, Jung R, et al.Plasmamembrane intrinsic proteins from maize cluster in two sequence subgroups withdifferential aquaporin activity.[J].Plant Physiol,2000, (122): 1025-1034.)。相关研究表明，AQP的表达受发育、干旱、低温、ABA等的调节(Tyeman SD, et al.Plantaquaporins !multifunctional water and solute channels with expanding roles[J].Plant Cell Environ,2002, (25):173-194.and QUINRTERO J M,FOURNIER JM,BENLL0CHM,Water transport in sunflower root systems effects of ABA, Ca2+ status andHgCl2[J], J Exp Bot，1999,339:1607-1612.)。
[0004]作为新疆的特色植物，新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir),又名天山雪莲、雪莲花等。属菊科凤毛菊属，主要生长于海拔2400~4100m的高山草甸、高山冰碛石和流石滩石隙、悬崖峭壁石缝等处。那里气候多变，冷热无常，雨雪交替，最高月平均温3~5°C，最低月平均温-19~-21°C，年降水量约800毫米，无霜期仅有50天左右。
[0005]天山雪莲经过长期的自然选择，形成了稳定的特殊结构、功能和遗传基因，产生了适应极端环境条件下的生理和生化机制，这种与环境相适应的机制，与一般的耐冷、抗寒应答性的适应机制不同，主要表现在其低温条件下能够正常的生长发育，而一般的抗寒性植物在相应的低温条件下，生长发育受到抑制。近年来植物抗寒基因工程得到迅速发展，并研究出了多种转基因抗寒植物，为培育抗寒植物开辟了新途径。
【发明内容】
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[0006]前期我们利用GateWay技术构建的低温胁迫下天山雪莲叶片组织的cDNA文库，从天山雪莲文库中筛选克隆到天山雪莲水孔蛋白基因sikPIPl，为了研究该基因的功能，我们构建了该基因的植物表达载体，并将此基因导入烟草中，提高了植物的抗寒和抗旱性。
[0007]本发明的一个目的是为植物抗寒和抗旱育种提供有价值的水孔蛋白基因sikPIPl，其发明的目还在于构建植物表达载体:pBI121-sik PIP1，在转基因植物中得到表达，提高转基因植物的抗寒和抗旱性，通过该基因的过量表达，使植物的抗低温和干旱胁迫性能得到提高，最终获得抗(耐)低温和干旱能力明显增强的植物。
[0008]本发明的目的是通过以下过程和方法实现的:
[0009]本发明所述的从天山雪莲中克隆sik PIPl基因，其序列为〈210>1。
[0010]本发明的从天山雪莲中克隆sik PIPl基因的过程如下:
[0011]提取经低 温处理的天山雪莲RNA，并以RNA反转录成的cDNA为模板，利用Primer5.0设计分别带有Xba I和SacI的PCR引物Pl和P2进行扩增，得到目的基因；
[0012]构建sik PIPl基因植物表达载体pBI121_sik PIPl ；
[0013]利用上述基因构建植物表达载体，通过农杆菌介导法遗传转化获得转基因植物并对其抗寒性进行功能研究:
[0014]植物在受到低温和干旱胁迫处理后，细胞膜会受到损伤而导致细胞电解质会发生外渗，从而导致电导率的升高。野生型(CK)和转天山雪莲PIPl基因基因烟草在移栽3周后分别经低温和干旱处理后，测定烟草叶片电导率。结果表明，非低温胁迫条件下，转基因烟草与野生型烟草的相对电导率相差不大，但_4°C低温处理2h后野生型烟草的相对电导率显著高于转基因烟草；非干旱胁迫条件下，转基因烟草与野生型烟草的相对电导率相差不大，但在9d干旱处理后野生型烟草的相对电导率显著高于转基因烟草。
[0015]MDA是膜脂过氧化的产物之一，其含量可以用于表示脂质过氧化的程度。野生型(CK)和转天山雪莲PIPl基因烟草在移栽3周后经低温和干旱处理后，计算烟草叶片MDA含量。结果表明，随着低温胁迫时间的延长，野生型烟草比转基因烟草的MDA含量增加大，表明低温胁迫导致野生型烟草的细胞膜系统受损严重，而转基因烟草的膜系统受损程度较轻；同样在干旱胁迫下，烟草MDA含量呈上升趋势，但转基因烟草MDA含量低于野生型烟草，认为转基因烟草的生物膜系统由于天山雪莲PIPl基因的表达而对其产生了一定的保护作用。
[0016]本发明不仅得到天山雪莲抗寒和抗旱相关的水孔蛋白sikPIPl，而且将其构建成植物表达载体pBI121-sikPIPl，在转基因植物中研究了该基因在提高植物耐低温和干旱性能中的重要功能。这对于揭示雪莲的抗寒和抗旱机理，丰富植物抗寒和抗旱分子生物学理论，提高植物的耐低温和抗旱能力，具有重要的意义。
[0017]转天山雪莲水孔蛋白基因sikPIPl烟草的抗寒和抗旱功能分析表明，转基因烟草的抗寒和抗旱性得到显著提高。【专利附图】
【附图说明】:
[0018]图1 是天山雪莲 sikPIPl 基因 RT-PCR扩增图 Figl:sikPIPl gene PCR amplified
[0019]图 2 是 pGM-sikPIPl 酶切鉴定 Fig2 !Restriction enzyme digestionidentification of pGM-sikPIPl
[0020]图 3 是pBI121-sikPIPl PCR鉴定Fig3:PCR identification of pBI121_sikPIPl
[0021]图 4 是 pBI121_sikPIPl 酶切鉴定 Fig4 !Restriction enzyme digestionidentification of pBI121_sikPIPl
[0022]图 5 是转化 GV3101 PCR 鉴定 Fig5:PCR identification ofpBI121-sikPIPl-GV3101
[0023]图6 是转化烟草 PCR 检测 Fig6:PCR identification of transformed tobacco
[0024]图7 是转基因烟草 RT-PCR分析 Fig7:RT-PCR analysis on transgenic tobacco
[0025]图8低温胁迫下不同烟草电导率测定Fig8:The measurement of conductivityin different tobaccoes under cold stress
[0026]图9是干旱胁迫下烟草电导率测定Fig.9:The measurement of conductivityin different tobaccoesunder drought stress
[0027]图10低温胁迫下不同烟草MDA含量的测定Fig.10:The measurement of thecontent of MDA in different tobaccoes under cold stress
[0028]图11干旱胁迫下不同烟草MDA含量的测定Fig.11:The measurement of thecontent of MDA in different tobaccoes under drought stress
[0029]图12是植物表达载体是pBI121_sikPIPl的构建流程图
[0030]图1 中:
[0031]I =Marker ；2:sik PIPl ；3:阴性对照；
[0032]图2 中:
[0033]I =Marker ；2:pGM_sik PIPl 双酶切；3:质粒对照；
[0034]图3 中:
[0035]I =Marker ；2:pBI121_sik PIPl ；3:阴性对照；
[0036]图4 中:
[0037]I =Marker ；2:质粒对照；3:pBI121_sik PIPl 双酶切；
[0038]图5 中:
[0039]I =Marker ；2:pBI121_sik PIP1-GV3101 ；3:阴性对照
[0040]图6 中:
[0041]I =Marker ；2:pBI121_sik PIPl 对照;3_6:sik PIPl 转化烟草；7 阴性对照；
[0042]图7 中:
[0043]I =Marker ；2:pBI121_sik PIPl 对照;3_10:sik PIPl 转化烟草；11:阴性对照；【具体实施方式】:
[0044]实验所涉及的药品琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒为上海生工公司生产；LA PCRTM invitro Cloning Kit 购自 TaKaRa 公司；RNA 酶、Taq 酶、T4-DNA 连接酶(T4-DNA ligase)、Marker、TRNzol总RNA提取试剂购于TIANGEN公司；Xba 1、SacI等限制性内切酶为Fermentas公司原装；IPTG、Χ-gal及抗生素、植物激素购自上海Sangon公司；其他试剂及配制MS培养基的各种试剂均为国产分析纯。具体实验操作依据[美]J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔的《分子克隆实验指南》。
[0045]I)实施例1:从天山雪莲中克隆到sikPIPl基因
[0046]1.1天山雪莲总mRNA的提取
[0047]I)将研钵及所用的器具在180°C烘箱烘烤6hr以上，其余所使用的枪头、离心管均使用0.1 %的DEPC处理，高压灭菌；
[0048]2)取植物幼嫩叶片约0.1g于研钵中，加液氮充分研磨至粉末状；
[0049]3)将粉末分装至1.5mL的小离心管中，加入1ml的TRNzol提取试剂，充分快速混匀，室温放置3-5min。
[0050]4) 10000rpm,4°C离心5min,吸上清至一新的离心管,加入200 μ I氯仿,剧烈振荡混匀；
[0051]5) 1000Orpm, 4°C离心5min,吸取上层液体至另一新的离心管后,加入600 μ I预冷的异丙醇，于-2011C沉淀30min ；
[0052]6) 10000rpm，4°C离心10min后，倒掉液体，在离心管底部即可见到白色沉淀，即为总 RNA。
[0053]7)用70%的乙醇(DEPC处理)洗涤沉淀2次后，吸干液体，吹干后加入30 μ IddH20 (DEPC处理)溶解，保存于_20°C备用。
[0054]1.2cDNA第一链的合成
[0055]在DEPC 处理的 0.2ml 离心管中加入 RNA 5 μ 1，Oligo dT 2 μ 1，ddH20 5 μ I 后，在75°C水浴IOmin后迅速置于冰上2min。然后在离心管中加入dNTP(2.5mmol/L) 2ul,Rnase Inhibitor I μ 1，M-MLV-RT 反转录酶 I μ 1，DEPC ddH20 5ul,42°C lhr,70°C 15min后，-20°C保存。
[0056]1.3cDNA第二链的合成及扩增
[0057]以天山雪莲cDNA为模板，用Pl和P2为引物进行扩增，同时以去离子水为模板进行扩增作为阴性对照。
[0058]SP1Sd' TGCTCTAGAGCATGAGTTTTAGAGAGAGAAATGTCG 3'
[0059]Xba I
[0060]sP2 为:5' ' TGCGAGCTCATTAATTTGTAGCATTGCTTCTGA3/
[0061]Sac I
[0062]PCR 反应体系(20 μ I)为:
[0063]
【权利要求】
1.一种从天山雪莲中克隆的水孔蛋白基因sikPIPl，其序列为〈210>1，其特征在于该基因编码区全长840bp，编码279个氨基酸。
2.根据权利要求1所述的核苷酸序列构建的植物表达载体。
3.根据权利要求2所 述的植物表达载体，通过遗传转化获得的抗寒和抗旱转基因植物。
【文档编号】C07K14/415GK103923927SQ201310009715
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2013年1月11日 优先权日:2013年1月11日
【发明者】祝建波, 焦天奇, 刘瑞娜, 冯玉杰 申请人:石河子开发区石大元禾生物科技有限公司