一种人凝血因子Ⅷ的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种人凝血因子Ⅷ的制备方法，包括冷沉淀溶解、聚乙二醇沉淀、离心分离、灭活、第二次聚乙二醇沉淀、第二次离心分离、沉淀溶解、冻干及第二次病毒灭活等步骤。本发明所用全部试剂均为常规试剂，价格便宜，用肝素钠作为溶解液，提高了活性的回收率，且不使用氢氧化铝作为沉淀剂，避免了最终产品中残留铝。本发明操作简便、整个过程时间短、适合大规模工业生产。
【专利说明】-种人凝血因子WI的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物制品领域，具体涉及一种人凝血因子W的制备方法。
【背景技术】
[0002] 甲型血友病又称为抗血友病球蛋白缺乏症或第W因子缺乏症，是一种由于基因缺 陷引起的凝血功能障碍性遗传病。患者多为男性，病人因体内缺乏凝血因子w而经常发生 内出血，仅靠自身机能难以止血。
[0003] 凝血因子W是一种血浆高分子糖蛋白，由2332个氨基酸残基组成，在内源性凝血 体系中起了十分重要的作用，是激活凝血因子IX的辅助因子。凝血因子W替代疗法是治疗 甲型血友病及预防急性出血发作最有效的措施，常用的替代品包括血浆、浓缩凝血因子W 及重组凝血因子W等。
[0004] 按我国现有甲型血友病患者5-10万计算，每年维持国内患者治疗至少需要人凝 血因子W制品约80万瓶（200IU/瓶)，每年缺口约40万瓶（200IU/瓶)。尽管目前市场上有 进口基因重组凝血因子W产品，但其价格是国内血浆类产品的4倍。
[0005] 国内大多数厂家在制备人凝血因子W的过程中，使用柱层析，成本高。此外，使用 氢氧化铝进行沉淀，容易导致最终产品中残留铝。
[0006] 因此，本领域需要开发出一种低成本、高收率的人凝血因子W制备方法，简单可 行，且能规模生产。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种人凝血因子W的制备方法。
[0008] 本发明的第一方面，提供一种人凝血因子W的制备方法，所述方法包括以下步 骤：
[0009] (a)将冷沉淀用40-80IU/ml肝素钠溶解液溶解，调节pH至6. 1-6. 5,溶液温度维 持在 20-35 °C ;
[0010] (b)将聚乙二醇溶液加入到步骤a)获得的溶液中混合均匀，得到聚乙二醇浓度为 2. 5%-4. 5%(wt/v〇l)的混合溶液，所述混合溶液的温度维持在20-30°C ;
[0011] (c)对步骤b)获得的混合溶液进行离心，取上清液；
[0012] (d)将磷酸三丁酯及聚山梨酯-80加入到步骤c)获得的上清液中混合均匀得到混 合溶液，并对所述混合溶液进行灭活；
[0013] (e)将聚乙二醇溶液加入到步骤d)获得的溶液中混合均匀，得到聚乙二醇浓度为 10%-14%(wt/v 〇l)的混合溶液，所述混合溶液的温度维持在10-20°C ;
[0014] (f)对步骤e)获得的混合溶液进行离心，收集沉淀；
[0015] (g)对步骤f)获得的沉淀进行洗涤，所述洗涤是指将所述沉淀溶解于1. 5-2. 5M甘 氨酸洗涤液中，搅拌后进行离心；
[0016] (h)将步骤g)获得的沉淀溶解于溶解液后冷冻干燥得到所述人凝血因子W，其 中，每10千克所述溶解液内含枸橼酸三钠4. 5-8. 5克及甘氨酸70-110克。
[0017] 在另一优选例中，所述肝素钠溶解液的重量是所述冷沉淀的重量的1-4倍。
[0018] 在另一优选例中，所述步骤a)中所述冷沉淀的溶解过程中，溶液的温度控制在 25-32。。。
[0019] 在另一优选例中，所述步骤a)中，采用0· 1-0. 5mol/L盐酸调节pH值至6. 1-6. 5。
[0020] 在另一优选例中，所述步骤b)中加入20_40%(wt/vol)的聚乙二醇溶液，较佳地， 加入25-35%(wt/v 〇l)的聚乙二醇溶液，更佳地，加入28-32%(wt/v〇l)的聚乙二醇溶液，最 佳地，加入30%(wt/vol)的聚乙二醇溶液。
[0021] 在另一优选例中，所述步骤c)中离心分离流量为20_50L/hr，离心出液温度为 12-17。。。
[0022] 在另一优选例中，所述步骤d)获得的混合溶液中磷酸三丁酯的浓度为0. 3vol%， 聚山梨酯-80的浓度为1. Ovol%。
[0023] 在另一优选例中，所述步骤d)中将所述混合溶液置于24_26°C持续6hr，对所述混 合溶液进行灭活。
[0024] 在另一优选例中，所述步骤e)中加入20_40%(wt/vol)的聚乙二醇溶液，较佳地， 所述步骤e)中加入25-35%(wt/vol)的聚乙二醇溶液，更佳地，加入28-32%(wt/vol)的聚 乙二醇溶液，最佳地，加入30%的聚乙二醇溶液。
[0025] 在另一优选例中，所述步骤f)中离心分离流量为40_70L/hr，离心出液温度为 7-12。。。
[0026] 在另一优选例中，步骤g)中，按1 :15-1 :20的比例（即1重量份沉淀加入15-20 重量份1. 5-2. 5M甘氨酸洗涤液）将所述沉淀充分溶解于1. 5-2. 5M甘氨酸洗涤液中，搅拌 30-60分钟使沉淀得到充分溶解，搅拌使洗涤充分，之后于6-11 °C以3000-5000转/分钟的 离心速度离心10-25分钟获得洗涤后的沉淀。本发明中所述甘氨酸洗涤液优选为甘氨酸的 水溶液。
[0027] 在另一优选例中，所述步骤h)中将沉淀溶解于10-20倍量(重量)的溶解液中。本 发明中，所述溶解液优选为枸橼酸三钠及甘氨酸的水溶液。
[0028] 在另一优选例中，所述冷冻干燥的条件如下：
[0029] 升温至-45?_40°C，保持15-20小时；
[0030] 升温至-15?-10°C，保持10-15小时；
[0031] 升温至0?5°C，保持10-15小时；
[0032] 升温至10?15°C，保持8-10小时；
[0033] 升温至30°C?33°C，保持6-8小时。
[0034] 在另一优选例中，所述方法还包括对步骤h)获得的所述人凝血因子W进行灭活 的步骤。在另一优选例中，所述灭活是指将所述人凝血因子W置于98-KKTC水浴中30min 进行干热病毒灭活处理。
[0035] 本发明的方法，保持了溶解时的活性，避免了常规方法中氢氧化铝沉淀造成的铝 残留，工艺简单，适合工业化大规模生产。
[0036] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【具体实施方式】
[0037] 本申请的发明人经过广泛而深入的研究，首次研发出一种人凝血因子W的制备方 法，采用肝素钠溶解液溶解冷沉淀，且采用聚乙二醇沉淀，避免了常规方法中氢氧化铝沉淀 造成的铝残留，工艺简单，适合工业化大规模生产。在此基础上，完成了本发明。
[0038] 术语
[0039] 本发明中，人凝血因子W和人凝血因子W制品具有相同的含义，均是指本发明方 法获得的制品。
[0040] 本发明中，冷沉淀（cryoprecipitation ;cryoprecipitate ;cryoprecitation)是 指血浆冷沉淀中含有W因子及纤维蛋白原。
[0041] 制备方法
[0042] 本发明的人凝血因子W的制备方法，包括冷沉淀溶解、聚乙二醇沉淀、离心分离、 灭活、第二次聚乙二醇沉淀、第二次离心分离、沉淀溶解、冻干及第二次病毒灭活等步骤。
[0043] 在本发明的一优选实施方式中，人凝血因子W的制备方法包括以下步骤：
[0044] (1)、冷沉淀的溶解：经粉碎的冷沉淀倒入1?4倍冷沉淀量的40?80IU/ml肝素 钠溶解液内，溶解过程中溶液的温度应控制在25?32°C，搅拌至沉淀完全溶解为止；
[0045] (2)、酸沉淀反应：用0· 1?0· 5mol/L盐酸将溶液的pH值矫正至6. 1?6. 5,搅拌 均匀，pH值矫正后，将温度控制在20?30°C，持续搅拌20?40分钟；
[0046] (3)、聚乙二醇沉淀：按最终聚乙二醇浓度为2. 5%?4. 5%(wt/v〇l)的比例加入 30%(wt/vol)聚乙二醇溶液，聚乙二醇溶液加入完毕，溶液温度应控制在20?30°C，并持 续搅拌反应20?40分钟；
[0047] (4)、离心分离：采用离心机(如AS-26离心机）进行离心分离，流量控制在20? 50L/小时，离心过程中出液温度应控制在12?17°C ;
[0048] (5)、S/D灭活处理：使溶液最终内含磷酸三丁酯0. 3%及聚山梨酯-801. 0%，搅拌均 匀，加温至24?26°C，并持续保温6小时；
[0049] (6)、二次聚乙二醇沉淀：按最终聚乙二醇浓度为10%?14%(wt/vol)的比例加入 30%(wt/vol)聚乙二醇溶液，聚乙二醇溶液加入完毕，溶液温度应控制在10?20°C，并持 续搅拌反应20?40分钟；
[0050] (7)、二次离心分离：采用离心机(如AS-26离心机）进行离心分离，流量控制在 40?70L/小时，离心过程中出液温度应控制在7?12°C ;
[0051] (8)、沉淀洗涤：将离心后收集的沉淀称重计量，按1 :15?1 :20的比例（即1份沉 淀加入15?20份1. 5?2. 5M甘氨酸洗涤液）充分溶解于1. 5?2. 5M甘氨酸洗涤液中， 搅拌30?60分钟使沉淀得到充分溶解，将溶解后得到的溶液进行粉碎搅拌，使洗涤充分， 尔后于6?11°C温度下以3000?5000转/分钟的离心速度离心10?25分钟；
[0052] (9)、沉淀的溶解：最终沉淀充分溶解于10?20倍量的溶解液中，每10千克溶解 液内含枸橼酸三钠4. 5?8. 5克及甘氨酸70?110克；
[0053] (10)、冻干
[0054] 低温升华，设定值为_45°C，时间设定值为15小时；
[0055] 加热升华，设定值为-15°C，时间设定值为10小时；
[0056] 加热升华，设定值为0°C，时间设定值为10小时；
[0057] 加热升华，设定值为10°C，时间设定值为8小时；
[0058] 加热升华，设定值为31°C -33°C，时间设定值6小时；
[0059] (11)、干热病毒灭活处理：人凝血因子W的沸水浴灭活温度标准：98?KKTC，保 温时间：30分钟。
[0060] 本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示 的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、 均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特 征的一般性例子。
[0061] 本发明的有益之处在于：
[0062] (1)采用国际先进的二次病毒灭活工艺对人凝血因子W进行病毒灭活，操作简便、 整个过程时间短、能规模生产，生产工艺所用全部试剂均为常规试剂，价格便宜；
[0063] (2)不使用大多数厂家使用的氢氧化铝，避免了最终产品中残留铝；
[0064] (3)用肝素钠作为溶解液，提高了活性的回收率。
[0065] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆：实验室手册（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。wt/vol是指质量体积浓度，就 是每100ml溶液含的溶质的质量。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0066] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文 中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0067] 通用方法
[0068] 根据《中国药典》2010年版或本领域惯用的方法测定效价、蛋白质含、活性、活性收 率、比活性及澄明度。
[0069] 实施例1
[0070] 人凝血因子W的制备
[0071] (1)、冷沉淀的溶解：经粉碎的冷沉淀倒入2倍冷沉淀量的60IU/ml肝素钠溶解液 内，溶解过程中溶液的温度应控制在28±2°C，搅拌至沉淀完全溶解为止；
[0072] (2)、酸沉淀反应：用0. lmol/L盐酸将溶液的pH值矫正至6. 2,搅拌均匀，pH值矫 正后，将温度控制在25 土 1°C，持续搅拌30分钟；
[0073] (3)、聚乙二醇沉淀：按最终聚乙二醇浓度为3%(wt/vol)的比例加入30%(wt/vol) 聚乙二醇溶液，聚乙二醇溶液加入完毕，溶液温度应控制在25 ±1°C，持续搅拌30分钟；
[0074] (4)、离心分离：采用离心机(如AS-26离心机）进行离心分离，流量控制在35L/小 时，离心过程中出液温度应控制在14±1°C ;
[0075] (5)、S/D灭活处理：使溶液最终内含磷酸三丁酯0. 3%及聚山梨酯-801. 0%，搅拌均 匀，加温至24?26°C，并持续保温6小时；
[0076] (6)、第二次聚乙二醇沉淀：按最终聚乙二醇浓度为12%(wt/vol)的比例加入 30%(wt/v〇l)聚乙二醇溶液，聚乙二醇溶液加入完毕，溶液温度应控制在15土1°C，持续搅 拌30分钟；
[0077] (7)、二次离心分离：采用离心机(如AS-26离心机）进行离心分离，流量控制在 55L/小时，离心过程中出液温度应控制在9± 1°C ;
[0078] (8)、沉淀洗涤：将离心后收集的沉淀称重计量，按1 :18的比例（即1重量份沉淀 加入18重量份2. 0M甘氨酸洗涤液）充分溶解于2. 0M甘氨酸洗涤液中，搅拌40分钟使沉 淀得到充分溶解，将溶解后得到的溶液进行粉碎搅拌，使洗涤充分，尔后于8± 1°C温度下以 4000转/分钟的离心速度离心18分钟；
[0079] (9)、沉淀的溶解：最终沉淀充分溶解于15倍量的溶解液中，每10千克溶解液内含 枸橼酸三钠6. 5克及甘氨酸90克；
[0080] (10)、冻干
[0081] 低温升华，设定值为_45°C，时间设定值为15小时；
[0082] 加热升华，设定值为_15°C，时间设定值为10小时；
[0083] 加热升华，设定值为0°C，时间设定值为10小时；
[0084] 加热升华，设定值为10°C，时间设定值为8小时；
[0085] 加热升华，设定值为32°C，时间设定值6小时；
[0086] (11)、干热病毒灭活处理：人凝血因子W的沸水浴灭活温度标准：98?KKTC，保 温时间：30分钟。
[0087] 经检测，本实施例制得的人凝血因子W制品的各项性能指标均符合《中国药典》的 规定。
[0088] 实施例2
[0089] 冷沉淀溶解液的确定
[0090] 以现有冷沉淀为起始原料，一分为二，分别按相同比例加入60IU/ml肝素溶解液 和Tris-HCl溶解液，在30°C溶解搅拌lhr，采用0. lmol/L盐酸调节pH值至6. 5,然后进行 聚乙二醇(加入30%(wt/vol)的聚乙二醇溶液，加入后聚乙二醇的浓度为3. 5%(wt/vol))沉 淀，离心收集上清，并对上清中人凝血因子W的活性及比活性进行测定，结果如表1所示。
[0091] 表1活性、比活的比较（X n=8)
[0092]
【权利要求】
1. 一种人凝血因子w的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： (a) 将冷沉淀用40-80IU/ml肝素钠溶解液溶解，调节pH至6. 1-6. 5,溶液温度维持在 20-35。。； (b) 将聚乙二醇溶液加入到步骤a)获得的溶液中混合均匀，得到聚乙二醇浓度为 2. 5%-4. 5%(wt/v〇l)的混合溶液，所述混合溶液的温度维持在20-30°C ; (c) 对步骤b)获得的混合溶液进行离心，取上清液； (d) 将磷酸三丁酯及聚山梨酯-80加入到步骤c)获得的上清液中混合均匀得到混合溶 液，并对所述混合溶液进行灭活； (e) 将聚乙二醇溶液加入到步骤d)获得的溶液中混合均匀，得到聚乙二醇浓度为 10%-14%(wt/v〇l)的混合溶液，所述混合溶液的温度维持在10-20°C ; (f) 对步骤e)获得的混合溶液进行离心，收集沉淀； (g) 对步骤f)获得的沉淀进行洗涤，所述洗涤是指将所述沉淀溶解于1. 5-2. 5M甘氨酸 洗涤液中，搅拌后进行离心； (h) 将步骤g)获得的沉淀溶解于溶解液后冷冻干燥得到所述人凝血因子W，其中，每 10千克所述溶解液内含枸橼酸三钠4. 5-8. 5克及甘氨酸70-110克。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肝素钠溶解液的重量是所述冷沉淀的 重量的1-4倍。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤c)中离心分离流量为20-50L/hr， 离心出液温度为12-17°C。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤d)获得的混合溶液中磷酸三丁酯 的浓度为〇. 3vol%，聚山梨酯-80的浓度为1. Ovol%。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤f)中离心分离流量为40-70L/hr， 离心出液温度为7-12°C。
6. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述冷冻干燥的条件如下： 升温至-45?-40°C，保持15-20小时； 升温至-15?-10°C，保持10-15小时； 升温至0?5°C，保持10-15小时； 升温至10?15°C，保持8-10小时； 升温至30°C?33°C，保持6-8小时。
7. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对步骤h)获得的所述人凝 血因子W进行灭活的步骤。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述灭活是指将所述人凝血因子W置于 98-100°C水浴中30min进行干热病毒灭活处理。
【文档编号】C07K14/755GK104250299SQ201310257462
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2013年6月25日 优先权日:2013年6月25日
【发明者】郑炎, 何毅明, 陈红霞, 薛镭, 费梅芳 申请人:上海生物制品研究所有限责任公司