一种杆菌肽抗原制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种杆菌肽人工抗原，相应的单克隆抗体，同时本发明也公开了所述杆菌肽人工抗原，相应的单克隆抗体的制备方法及其应用。本发明所述杆菌肽抗原可应用于制备杆菌肽特异性抗体。本发明的杆菌肽人工抗原，通过免疫动物可产生针对杆菌肽的特异性抗体，可用于制备检测杆菌肽残留的酶联免疫检测试剂盒，具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度高、特异性强等诸多优点。
【专利说明】一种杆菌肽抗原制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品安全检测【技术领域】，具体涉及一种杆菌肽抗原、单克隆抗体制备 方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 杆菌肽，又称枯草菌肽，是由地衣芽孢杆菌或枯草杆菌变种的培养液分离而得。杆 菌肽对革兰氏阳性菌有较强的抑制作用，抗菌谱与青霉素 G相似，主要用于治疗耐青霉素 的葡萄球菌感染，还可用作饲料添加剂，是目前国内外广泛用于饲料中的一种新型抗生素。 它由多种氨基酸结合而成，有杆菌肽A、B、C、D、E等多种异构体，其中含量最高且最有效的 是杆菌肽A，溶于乙醇、乙酸、吡啶，微溶于丙酮，不溶于水、乙醚，具有很好的抗菌作用。
[0003] 多肽类抗生素对革兰氏阴性菌、阳性菌有较强的抗菌作用，被广泛用于治疗家禽、 猪、牛等肠道、呼吸道、泌尿系统感染，作为兽药和饲料添加剂，具有抑菌、杀菌和明显的促 生长作用。多肽类抗生素毒性较大，具有肾和神经毒性，其在动物组织中的残留会通过食物 链传递给人类，其产生的毒副作用会对人体产生直接的危害，为此其安全问题已经日益引 起人们的关注。
[0004] 国际上对畜禽类产品中的杆菌肽产品进行了限定。其中，日本规定畜禽类中杆菌 肽类限量0. 2~0. 5mg/kg。农业部235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中对粘菌 素和杆菌肽药物在牛奶中的最高残留限量（MRL)作出了规定：牛奶中杆菌肽最高残留限量 为500 μ g/kg，在牛、猪、禽的可食用组织中为500 μ g/kg，
[0005] 目前，国外对于动物性食品中粘菌素和杆菌肽药物残留检测方法的报道为微生物 法、薄层色谱法、免疫学法、毛细管电游泳法、高效液相色谱法等，国内报道的方法主要是微 生物法，但其操作繁琐、灵敏度低、重现性差。
[0006] 基于抗原抗体免疫反应的免疫学检测技术为小分子残留物的分析检测提供了一 个新的途径。因为杆菌肽是小分子化合物，本身没有免疫原性，必须将其与大分子载体蛋白 偶联得到具有免疫原性的人工抗原。在此基础上建立起来的酶联免疫检测试剂盒可快速、 方便、准确的检测动物组织、牛奶、尿液中的杆菌肽残留，可为建立监控动物源性食品中杆 菌肽残留提供技术支持。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种杆菌肽抗原、特异性抗体制备方法及其应用。
[0008] 本发明提供的杆菌肽抗原，是将杆菌肽和载体蛋白偶联得到的偶联物。
[0009] 本发明还公开了所述杆菌肽抗原的制备方法，包括如下步骤：
[0010] (1)取杆菌肽45mg用1. 5mL水溶解；
[0011] (2)取50%的1，5-戊二醛10 μ L加入杆菌肽溶解液中，室温下搅拌反应18h ;
[0012] (3)取载体蛋白6(Tl00mg，用1. 5mL水稀释后加入杆菌肽溶解液中，反应24小时；
[0013] (4)加入 24mgNaBH4 反应 3h;
[0014] (5)用三蒸水透析48小时，即得杆菌肽抗原。
[0015] 常用载体蛋白均可采用，如牛血清白蛋白（BSA)，卵清蛋白（0VA)，人血清白蛋白 (HSA)，鼠血清白蛋白（MSA)，甲状腺蛋白（TG)或血蓝蛋白（KLH)等。
[0016] 所述杆菌肽抗原可以作为免疫原制备杆菌肽特异性抗体，也可以作为包被原制备 酶标板。
[0017] 所述抗体具体可为单克隆抗体。
[0018] 所述杆菌肽抗原、所述抗体均可应用于检测杆菌肽。
[0019] 本发明还公开了应用杆菌肽抗原和杆菌肽单克隆抗体制备得到的酶联免疫检测 试剂盒。
[0020] 所述酶联免疫检测试剂盒，是由包被有杆菌肽抗原的酶标板、酶标二抗工作液、抗 体浓缩液、杆菌肽系列标准品、底物显色液、终止液、浓缩复溶液、浓缩洗涤液。
[0021] 本发明依靠免疫学、免疫化学基本原理和残留分析技术手段，将小分子目标分析 物与载体蛋白偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备针对小分子分析物的特异性抗体。利 用抗原抗体的特异性免疫学反应，定量的检测样本中微量小分子目标分析物，具有特异、灵 敏、准确、快速、方便、廉价等特点。本发明制备方法简便可行、成本较低，抗原产率较高。本 发明克服了现有检测技术中对杆菌肽样品预处理复杂、耗时、且需要大量有机溶剂萃取，以 及在检测过程中要用到精密昂贵的检测仪器而不适于推广使用等缺点。本发明的杆菌肽人 工抗原，通过免疫动物可产生了针对杆菌肽的特异性抗体，用于快速检测食品中的杆菌肽 残留，具有简单、快速、处理样品量大、灵敏度高、特异性强等诸多优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1为杆菌肽酶联免疫检测试剂盒标准曲线。
【具体实施方式】
[0023] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。
[0024] 实施例1、杆菌肽人工抗原的制备和鉴定
[0025] 一、杆菌肽免疫抗原的合成
[0026] (1)取杆菌肽45mg用1. 5mL水溶解。
[0027] (2)取50%的1，5_戊二醛（GA)10y L加入杆菌肽溶解液中，室温下搅拌反应18h。
[0028] (3)取牛血清白蛋白（BSA)lOOmg用L5mL水稀释后加入杆菌肽溶解液中，反应24 小时。
[0029] (4)加入 24mgNaBH4 反应 3h。
[0030] (5)用三蒸水透析48小时，即得免疫原。
[0031] 二、杆菌肽包被抗原的合成
[0032] (1)取杆菌肽45mg用1. 5mL水溶解。
[0033] (2)取50%的1，5_戊二醛（GA)10y L加入杆菌肽溶解液中，室温下搅拌反应18h。
[0034] (3)取卵清蛋白（0VA)60mg用1.5mL水稀释后加入杆菌肽溶解液中，反应24小时。
[0035] (4)加入 24mgNaBH4 反应 3h。
[0036] (5)用三蒸水透析48小时，即得免疫原。
[0037] 三、杆菌肽人工抗原的鉴定
[0038] 按合成杆菌肽免疫抗原和包被抗原反应所用的杆菌肽、载体蛋白与偶联产物的比 例，分别进行紫外（200nnT400nm)扫描鉴定，并通过比较三者在同一波长下的吸光值计算 其结合比。产物的紫外光谱图与载体蛋白相比发生了变化，说明杆菌肽已经与载体蛋白成 功偶联制得杆菌肽人工抗原。经计算，杆菌肽分子与BSA分子的结合比为11. 3:1，杆菌肽分 子与0VA分子的结合比为9. 2:1。
[0039] 实施例2、抗体的制备和特异性鉴定
[0040] 一、抗杆菌肽单抗的制备
[0041] (1)用上述制备出的免疫原按100 μ g/只，以生理盐水溶解免疫原与弗氏完全佐 剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6~8周龄Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免 疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以免疫复合物100 μ g/ 只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。
[0042] (2)按常规方法进行，取免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞 (SP2/0)混合，然后在45s内缓慢加入预热的融合剂（PEG4000)进行融合，用HAT培养基悬 浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37°C，5% C02培养箱中培养，5天 后用HT培养基半换液，9天时候进行全换液。
[0043] (3)细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，采用分步筛选法筛选杂交瘤 细胞。初选采用间接ELISA方法，以包被抗原（预先用方阵法常规滴定其最佳包被浓度和 阳性血清稀释度）包被酶标板，加入被测孔培养上清，孵育，清洗后加入羊抗鼠 IgG-HRP和 IgM-HRP，(PD进行显色反应。筛选出的阳性孔再用间接竞争ELISA方法筛选，先将细胞上清 与100 μ g/mL的杆菌肽等体积混合，37°C水浴作用30min，再加入到包被好的酶标板中。同 时用PBS取代杆菌肽作对照，其余步骤同上。若经杆菌肽阻断后的0D 45(lnm值下降到对照孔 的50%以下，则判为阳性，经2~3次检测都为阳性的孔，立即用有限稀释法进行亚克隆化。
[0044] (4)将2~3次亚克隆建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接ELISA测定 效价，冻存；并取8?10周龄Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0. 5mL/只，7?10日后腹腔注射 杂交瘤细胞广2 X 1〇7只，7~10日后抽取小鼠腹水，离心取上清，测定效价，并冻存备用。
[0045] 二、抗杆菌肽抗体效价的测定
[0046] 杆菌肽标准品购自Sigma公司。
[0047] 用方阵滴定法确定杆菌肽包被抗原和步骤一制备的单抗的工作浓度，杆菌肽包被 抗原的工作浓度为2. 5 μ g/mL，单克隆抗体的工作浓度为1:3200。
[0048] 用不同浓度的杆菌肽标准品溶液做实验溶液，其浓度如下：0、1、3、9、27、81 μ g/L。 采用8组平行试验（n=8)。间接竞争性ELISA方法：
[0049] (1)用上述工作浓度的杆菌肽抗原包被酶标板，将杆菌肽标准品实验溶液、酶标二 抗溶液和抗体工作液同时加入酶标板微孔中，同时设置空白孔（将添加的抗体溶液换成高 纯水，其它一致）和阴性对照孔（将标准品实验溶液用PBS溶液代替，其它一致），25°C避光 环境中反应30min ;
[0050] (2)倒出孔内液体，用洗涤液洗涤：Γ5次，将酶标板倒置在吸水纸上拍干；
[0051] (3)加入底物显色溶液到酶标板微孔中，25°C避光环境中反应15min ;
[0052] (4)加入终止液，轻轻振荡混匀，用酶标仪在波长450nm处测定0D值。
[0053] 以0D值为纵坐标，以杆菌肽实验溶液浓度的loglO值为横坐标，绘制半对数标准 曲线图。标准曲线具有完整的反S形状，并具有上平台和下平台，标准曲线的平行测定次数 8次，实验重复性良好，相对标准偏差（变异系数）均在10%以内。
[0054] 根据标准曲线得出半数抑制量（IC5(I)，确定检测灵敏度。
[0055] 抑制率用以下式计算：
[0056]
【权利要求】
1. 一种杆菌肽抗原，其特征在于，是将杆菌肽和载体蛋白偶联得到。
2. 权利要求1所述杆菌肽抗原的制备方法，包括如下步骤： (1) 取杆菌肽45mg用1. 5ml水溶解； (2) 取50%的1，5-戊二醛10 μ 1加入杆菌肽溶解液中，室温下搅拌反应18h ; (3) 取载体蛋白6(Tl00mg，用1. 5ml水稀释后加入杆菌肽溶解液中，反应24小时； (4) 加入 24mgNaBH4 反应 3h ; (5) 用三蒸水透析48小时，即得杆菌肽抗原。
3. 权利要求1所述杆菌肽抗原在制备杆菌肽特异性抗体中的应用。
4. 应用权利要求3所述杆菌肽抗原制备得到的特异性抗体。
5. 权利要求1所述杆菌肽抗原、权利要求4所述抗体在检测杆菌肽中的应用。
6. 应用权利要求1所述杆菌肽抗原、权利要求4所述特异性抗体制备得到的酶联免疫 检测试剂盒。
7. 权利要求6所述酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，它包括：包被有杆菌肽抗原的酶 标板、酶标二抗工作液、抗体浓缩液、杆菌肽系列标准品、底物显色液、终止液、浓缩复溶液、 浓缩洗涤液。
【文档编号】C07K14/32GK104250292SQ201310257783
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2013年6月26日 优先权日:2013年6月26日
【发明者】冯才伟, 罗晓琴, 陶光灿, 徐念琴, 韩京朋, 韩雪倩, 吴小胜, 余厚美 申请人:北京勤邦生物技术有限公司