土鳖虫提取物的两种三肽、其制备、镇痛作用及在制定质量标准中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了土鳖虫提取物的两种三肽、其制备、镇痛作用及在制定质量标准中的应用。本发明从土鳖虫干粉酶解物或水提取物发现的含量最高的Pro-Ala-Arg和Val-Ala-Arg两种三肽，公开了它们的制备方法，公开了它们的镇痛作用，进一步公开了它们在制定土鳖虫干粉酶解物或水提取物质量标准中的应用。
【专利说明】土鳖虫提取物的两种三肽、其制备、镇痛作用及在制定质量 标准中的应用
【技术领域】
[0001] 土鳖虫是2010版中国药典二部收载的中药，以鳖蠊科昆虫地鳖或冀地鳖的雌 虫干燥体入药。本发明涉及从土鳖虫干粉酶解物或者水提取物中发现的含量最高的 Pro-Ala-Arg和Val-Ala-Arg两种三肽，涉及它们的制备方法,涉及它们的镇痛作用，进一 步涉及它们在制定土鳖虫干粉提取物质量标准中的应用。本发明属于生物医药领域。
【背景技术】
[0002] 疼痛不仅是许多疾病的并合症，而且自身已经被看作是一类疾病。从疾病层面上 讲，由各种各样的疼痛造成的生活质量下降波及了最大量的人群。由于有效的镇痛剂往往 与依赖性相联系，所以发明新的无依赖性的镇痛剂具有重要价值。
[0003] 土鳖及土鳖干粉在我国传统医学中有广泛的应用。土鳖及土鳖干粉在我国传统医 学中应用时一方面都是经口服给药，土鳖及土鳖干粉经口服给药的一次剂量在log左右。 这样大的剂量，以及土鳖及土鳖干粉自身的腥臭使病人服用非常不便。依据土鳖及土鳖干 粉的蛋白质性质、蛋白质经口服进入胃可被胃蛋白酶降解为多肽的性质，以及多肽的良好 水溶性，发明人推测土鳖及土鳖干粉的直接水提物和酶解物有可能在不减弱治疗效果的前 提下减少服药量。发明人的这两种认识经过实验验证之后，分别获得国家发明专利授权 (1.彭师奇，赵明，魏蕾，曹连甲，邵丹，耿承芳，叶发舜，廖银根，土鳖干粉酶解物的制备及在 医学中的应用，ZL200610140160. 1 ;2.彭师奇，赵明，魏蕾，李春波，毛伟，叶伟东，土鳖干粉 水提取物的制备及应用，ZL200910246926. 8)。
[0004] 与本发明相关的上述两项国家发明专利，分别披露了土鳖干粉酶解物的制备及具 有镇痛活性的冻干粉的Maldi-TOF指纹图谱，和土鳖干粉水提取物的制备及具有镇痛活性 的冻干粉的Maldi-TOF指纹图谱。虽然根据Maldi-TOF指纹图谱，上述两项国家发明专利 从土鳖干粉酶解物或水提取物的镇痛部位分析了一些多肽序列，但既未能给出土鳖干粉酶 解物或水提取物的镇痛部位的分离的多肽谱峰，也未能给出土鳖干粉酶解物或水提取物的 镇痛部位丰度最大的多肽谱峰，还未能给出土鳖干粉酶解物或水提取物的镇痛部位定义的 多肽的镇痛作用。针对上述两项国家发明专利没有解决的两个问题，本发明披露了从土鳖 干粉酶解物或水提取物的镇痛部位发现的丰度最大的两种三肽，披露了这两种三肽的镇痛 作用，进一步披露了这两种三肽在制定土鳖干粉酶解物或水提取物的质量标准中的应用。
【发明内容】
[0005] 本发明的第一项内容是寻找最佳的HPLC-MS条件，定义土鳖干粉酶解物或水提取 物中两个最强峰的Pro-Ala-Arg和Val-Ala-Arg两种三肤。
[0006] 本发明的第二项内容是按照标准的液相合成方法制备Pro-Ala-Arg和 Val-Ala-Arg两种三肽，具体可描述为：
[0007] 1)采用液相合成方法，通过逐步接肽合成Ala-Arg的保护中间体；
[0008] 2)脱去Arg-Gly的保护中间体的N端保护基；
[0009] 3)把Boc-Pro和Boc-Val分别与N端游离的Arg-Gly的保护中间体偶联，制备 Pr〇-Ala_Arg 和 Val-Ala-Arg 的保护中间体；
[0010] 4)把N端游离的Asp-Val的保护中间体和C端游离的Arg-Gly保护中间体偶联得 到Arg-Gly-Asp-Val的保护中间体；
[0011] 5)脱去Arg-Gly-Asp-Val和Arg-Gly-Asp-Val的保护中间体的保护基，得到 Pr〇-Ala_Arg 和 Val-Ala-Arg 两种三肤。
[0012] 本发明的第三项内容是描述Pro-Ala-Arg和Val-Ala-Arg两种三肽在制定鳘虫干 粉酶解物或水提取物质量标准中的应用。
[0013] 本发明的第四项内容是描述Pro-Ala-Arg和Val-Ala-Arg两种三肽作为镇痛剂的 应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 图1. 土鳖虫干粉酶解物或水提取物的υν-HPLC谱。
[0015] 图2. 土鳖虫干粉酶解物或水提取物的离子流谱。
[0016] 图3.离子流谱中保留时间为12. 07min的峰的质谱图。
[0017] 图4.离子流谱中保留时间为13. 825min的峰的质谱图。
[0018] 图5. 1053的峰应当是1分子Pro-Ala-Arg肽和2分子Val-Ala-Arg肽形成的杂 三聚体，因为 1035 = 342+344+344+Na。
[0019] 图 6. Pro-Ala-Arg 和 Val-Ala-Arg 的液相合成。i)二环己基羰二亚胺（DCC)，N_ 轻 基苯并三氮唑（Η0ΒΤ)和N-甲基吗啉（NMM) ;ii)HCl/乙酸乙酯（6M) ;iii)三氟甲磺酸和三 氟乙酸。
[0020] 图 7.合成的 Pro-Ala-Arg 的 UV-HPLC 谱。
[0021] 图8.合成的Pro-Ala-Arg的离子流谱。
[0022] 图9.合成的Pro-Ala-Arg的质谱。
[0023] 图 10.合成的 Val-Ala-Arg 的 UV-HPLC 谱。
[0024] 图11.合成的Val-Ala-Arg的离子流谱。
[0025] 图12.合成的Val-Ala-Arg的质谱图。
[0026] 图13.比较土鳖虫酶解物或水提取物的UV-HPLC谱（上）与实施例2得到的合成 的 Pro-Ala-Arg 的 UV-HPLC 谱（中），及合成的 Val-Ala-Arg 的 UV-HPLC 谱（下）。
[0027] 图14.合成的Pro-Ala-Arg与土鳖虫酶解物或水提取物的混合物的UV-HPLC谱。
[0028] 图15.合成的Val-Ala-Arg与土鳖虫酶解物或水提取物的混合物的UV-HPLC谱。
[0029] 图16.图1，图7,图14和图15图五个UV-HPLC谱叠加。
[0030] 图17.合成的Pro-Ala-Arg的镇痛活性。
[0031] 图18.合成的Val-Ala-Arg的镇痛活性。
【具体实施方式】
[0032] 为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它 们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
[0033] 实施例1. 土鳖虫干粉酶解物或水提取物的多肽组份的HPLC-MS谱 [0034] a)仪器与方法
[0035] HPLC :Waters (自动进样器），紫外串联质谱检测器。色谱柱为Harmony C18柱 (5ym)，250X4. 6_。流动相为甲醇：水=5 : 95。流速为0. 25ml/min。UV检测波长为 210nm;质谱：Micromass Quattro micro TM API (Waters Co·)。ES+模式。Source Temp 为 12CTC，Desolvent Temp 为 20CTC，Mass(m/z) :2_2000,Cone Voltage 为 30V。
[0036] b)测定土鳖虫干粉酶解物或水提取物的多肽组分的色谱
[0037] 将土鳖虫干粉酶解物或水提取物用双蒸水稀释160倍。按照上面的参数开启仪 器，进样20 μ L。得到图1的UV-HPLC谱和图2的离子流谱。
[0038] c)测定土鳖虫干粉酶解物或水提取物的多肽组分的质谱
[0039] 针对离子流谱中保留时间为12. 07min和的13. 825min的峰测得的质谱图分别为 图3和图4。对图3进行解析，发现了 343和365以及345和367显示M+H和M+Na两种关 系的两组峰。因为343 = 342+H和365 = 342+Na，所以342应当是Pro-Ala-Arg肽的分子 量。因为345 = 344+H和367 = 344+Na，所以344应当是Val-Ala-Arg肽的分子量。
[0040] 对图4进行解析，发现了 687的峰。因为687 = 342+344+H，所以687应当是1分 子Pro-Ala-Arg肽和1分子Val-Ala-Arg肽形成的杂二聚体。
[0041] 对图5进行解析，发现了 1053的峰。因为1035 = 342+344+344+Na，所以1035应 当是1分子Pro-Ala-Arg肽和2分子Val-Ala-Arg肽的杂三聚体。
[0042] 实施例 2.制备 Pro-Ala-Arg
[0043] a)将586mg(3. lmmol)Boc-L-Ala用10ml无水四氢呋喃溶解，冰浴冷却，向得到 的溶液中加入430mg(3. lmmol)N_轻基苯并三氣唑（Η0ΒΤ)和640mg(3. lmmol)二环己基 羰二亚胺（DCC)，将此反应液冰浴下搅拌10min。加入958mg(3. lmmoDW-NOfL-Arg-OBzl 和350mg(3. lmmol)N_甲基吗啉（NMM),室温搅拌24h。反应混合物过滤，滤除二环己基脲 (D⑶)。滤液减压浓缩，残留物用50ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用5% NaHCOyK 溶液洗，饱和NaCl水溶液洗，5 % KHS04水溶液洗和饱和NaCl水溶液洗。有机相用无水 Na2S04干燥，过滤、滤液减压浓缩至干，残留物经柱层析纯化（氯仿/甲醇，30 : 1)得到 1414mg(95%)Boc-Ala-NG-N02-L-Arg-0Bzl。ESI-MS(m/e) :481[M+H] +。[a]D25 = -48 (c = 0· 1，CH30H)。
[0044] b)将 960mg(2mmol)Boc-Ala-NG-N02-L-Arg_0Bzl 溶解在 10ml 氣化氧-乙酸乙酉旨 溶液^M)中，冰浴下搅拌反应2h，TLC(氯仿/甲醇，5 : 1)监测反应。减压浓缩，残留物 加20ml乙酸乙酯溶解，水泵抽干以除去游离HC1，重复3次。加20ml乙醚将残留物研磨得 目标化合物，直接投下步反应。ESI-MS(m/e) :381[M+H] +。
[0045] c)将430mg(2mmol)Boc-L-Pro用10ml无水四氢呋喃溶解，冰浴冷却，向得到的 溶液中加入277mg(2mmol)N-轻基苯并三氮唑（Η0ΒΤ)和413mg(2mmol)二环己基羰二亚 胺（DCC)，将此反应液冰浴下搅拌10min。加入TeZmgOmmoDAla-N^NOfL-Arg-OBzl和 226mg(3. lmmol)N_甲基吗啉（NMM),室温搅拌24h。反应混合物过滤，滤除二环己基脲 (D⑶)。滤液减压浓缩，残留物用50ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用5 % NaHCOyK 溶液洗，饱和NaCl水溶液洗，5 % KHS04水溶液洗和饱和NaCl水溶液洗。有机相用无水 Na2S04干燥，过滤、滤液减压浓缩至干，残留物经柱层析纯化（氯仿/甲醇，30 : 1)得到 1062mg(92% )Boc-Pr〇-Ala-NG-N02-L-Arg-0Bzl〇 ESI-MS(m/e) ：578[M+H] + 〇 [ a ]D25 = -63 (c =0· 1，CH3OH)。
[0046] d)0°C将 577mg(lmmol)Boc-Pr〇-Ala-NG-N02-L-Arg-0Bzl 用 10ml 三氟甲磺酸 / 三 氟乙酸（1 : l，v/v)溶解，冰浴搅拌4h。反应混合物减压浓缩，残留物用无水乙醚反复洗， 除去剩余的三氟甲磺酸/三氟乙酸。残留物用0. 5ml蒸馏水溶解，用G5凝胶色谱柱纯化， 冷冻干燥得到 54711^(80% )Pr〇-Ala_Arg。ESI_MS(m/e) :343[M+H]+。[a]D25 = -64 (c = 0· 1，CH30H)。
[0047] 实施例 3.制备 Val-Ala-Arg
[0048] a)将434mg (2mmol) Boc-L-Val用10ml无水四氢呋喃溶解，冰浴冷却，向得到 的溶液中加入277mg(2mmol)N-轻基苯并三氮唑（Η0ΒΤ)和413mg(2mmol)二环己基羰二 亚胺（DCC)，将此反应液冰浴下搅拌 lOmin。加入 762mg(2mmol)Ala-NG-N02-L-Arg-0Bzl 和226mg(3. lmmol)N_甲基吗啉（NMM),室温搅拌24h。反应混合物过滤，滤除二环己基 脲（D⑶）。滤液减压浓缩，残留物用50ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用5% NaHC03 水溶液洗，饱和NaCl水溶液洗，5 % KHS04水溶液洗和饱和NaCl水溶液洗。有机相用无 水Na2S04干燥，过滤、滤液减压浓缩至干，残留物经柱层析纯化（氯仿/甲醇，30 : 1)得 至lj 1077mg(93 % ) Boc-Val_Ala-NG-N02-L-Arg-〇Bzl。ESI-MS (m/e) :580 [M+H]+。[ a ]D25 =-33. 00(c = 0· 1，CH30H)。
[0049] b)0°C将 579mg(lmmol)Boc-Val-Ala-NG-N02-L-Arg-0Bzl 用 10ml 三氟甲磺酸 / 三 氟乙酸（1 : l，v/v)溶解，冰浴搅拌4h。反应混合物减压浓缩，残留物用无水乙醚反复洗， 除去剩余的三氟甲磺酸/三氟乙酸。残留物用0. 5ml蒸馏水溶解，用G5凝胶色谱柱纯化，冷 冻干燥得到 578mg(84% )Pr〇-Ala-Arg。ESI-MS(m/e) :345[M+H] +。[a ]D25 = 16(c = 0· 1， CH30H) 〇
[0050] 实施例4.合成的Pr〇-Ala_Arg和Val-Ala-Arg两种三肤的HPLC-MS谱
[0051] a) Pr〇-Ala_Arg 和 Val-Ala-Arg 的液相合成
[0052] 采用标准的液相合成方法，按图6的路线制得纯的Pro-Ala-Arg和 Val-Ala-Arg。可具体描述为1)将Boc-Ala与N-胍基-N02-Arg-0Bzl偶联为保护 中间体Boc-Ala-W-NOfArg-OBzl (收率96 % ) ;2)用浓度为6M的氯化氢的乙酸乙 酯溶液脱去Boc-Ala-W-NC^-Arg-OBzl的N端保护基Boc (收率98 % ) ;3)将得到的 Ala-NG-N02_Arg-〇Bzl 与 Boc-Pro 和 Boc-Val 分别偶联为 Boc_Pr〇-Ala-NG-N02-Arg-0Bzl 和B〇C-Val-Ala-NG-N02-Arg-0Bzl(收率95%) ;4)用三氟甲磺酸的三氟乙酸溶液脱去 Boc-Pr〇-Ala_NG-N02-Arg-0Bzl 和 Boc-Val-Ala_NG-N02-Arg-0Bzl 的保护基（收率 90% ); 5)得到的Pro-Ala-Arg和Val-Ala-Arg粗品用凝胶色谱柱纯化，用高纯水洗脱得到 Pro-Ala-Arg和Val-Ala-Arg两种三肽的纯品（收率80%，HPLC纯度为98% )。总收率为 72%。
[0053] b)测定合成的 Pro-Ala-Arg 的 HPLC-MS 谱
[0054] 将Pro-Ala-Arg用双蒸水溶解为400 μ g/mL的溶液。按照实施例1的参数开启仪 器，进样20 μ L。得到图7的UV-HPLC谱，图8的离子流谱和图9的质谱图。图9与图3的 部分质谱图明显匹配。
[0055] c)测定合成的 Val-Ala-Arg 的 HPLC-MS 谱
[0056] 将Val-Ala-Arg用双蒸水溶解为400 μ g/mL的溶液。按照实施例1的参数开启仪 器，进样20 μ L。得到图10的UV-HPLC谱，图11的离子流谱和图12的质谱图。图12与图 3的部分质谱图明显匹配。
[0057] 实施例5.比较UV-HPLC谱
[0058] 将实施例1得到的土鳖虫酶解物或水提取物的UV-HPLC谱（图1)与实施例2得 到的合成的Pro-Ala-Arg的UV-HPLC谱（图7)，及合成的Val-Ala-Arg的UV-HPLC谱（图 10)进行比较，可以看到Pro-Ala-Arg的UV-HPLC谱（图7)与土鳖虫酶解物或水提取物的 UV-HPLC谱（图1)的前面的峰相匹配，Val-Ala-Arg的UV-HPLC谱（图10)也与土鳖虫酶 解物或水提取物的UV-HPLC谱（图1)的前面的峰相匹配。
[0059] 实施例6.合成的Pro-Ala-Arg与土鳖虫酶解物或水提取物混合的UV-HPLC谱
[0060] 将合成的Pro-Ala-Arg用双蒸水溶解为400 μ g/mL的溶液，取100 μ L该溶液与 100 μ L实施例1制备的土鳖虫酶解物或水提取物的水溶液混合。按照实施例1的参数开启 仪器，进样20 μ L。得到图14的UV-HPLC谱。该图与图13的上图相比，土鳖虫酶解物或水 提取物的前面的峰强度明显增高。
[0061] 实施例7.合成的Val-Ala-Arg与土鳖虫酶解物或水提取物混合的UV-HPLC谱
[0062] 将合成的Val-Ala-Arg用双蒸水溶解为400 μ g/mL的溶液，取100 μ L该溶液与 100 μ L实施例1制备的土鳖虫酶解物或水提取物的水溶液混合。按照实施例1的参数开启 仪器，进样20 μ L。得到图15的UV-HPLC谱。该图与图13的上图明显相似。
[0063] 将VAR用双蒸水溶解为400 μ g/mL的溶液，取100 μ L与100 μ L上面制备的土鳖 虫酶解物的水溶液混合。按照上面的参数开启仪器，进样20yL。得到图15的UV-HPLC谱。 该图与图13的上图相比，土鳖虫酶解物或水提取物的前面的峰强度也明显增高。
[0064] 实施例8.得到的五个UV-HPLC谱叠加
[0065] 将上面得到的土鳖虫干粉酶解物或水提取物的UV-HPLC谱图、合成的 Pro-Ala-Arg 的 UV-HPLC 谱图、合成的 Val-Ala-Arg 的 UV-HPLC 谱图（图 13)，合成的 Pro-Ala-Arg与土鳖虫酶解物或水提取物的混合物的UV-HPLC谱图（图14)，合成的 Val-Ala-Arg与土鳖虫酶解物或水提取物的混合物的UV-HPLC谱图（图15)五个色谱图叠 力口，得到图16。这五个图良好的匹配性既进一步说明了土鳖虫酶解物或水提取物的主要组 分是Pro-Ala-Arg和Val-Ala-Arg两种三肽，又说明了采用UV-HPLC可以稳定地控制土鳖 虫酶解物或水提取物的生产质量。
[0066] 实施例9.合成的Pro-Ala-Arg的镇痛活性
[0067] 将雄性ICR小鼠（22±2g)分为阿司匹林对照组（灌胃剂量为167ymol/kg)，以 及Pro-Ala-Arg治疗组（灌胃剂量为10 μ mol/kg)分别用0. 3ml生理盐水溶解。将小鼠置 于特制塑料圆筒内，尾部暴露在筒外，室内温度保持在（20 ± 1 °C )，待动物稳定30min后，以 辐射热甩尾法测痛，采用一特制灯罩使其发出直径为2mm的光束照在距尾端部约2-3cm处， 调节光源电压使甩尾潜伏期在6. 5-8. 5s，两次测甩尾潜伏期的间隔为5min，共测4次，取 平均值作为基础阈值。给药后30min，60min，90min，120min，150min和180min各测一次阈 值。测得值与基础值比较，以变化率表示痛阈变化，即（给药后的痛阈-基础痛阈）/基础痛 阈X 100%，痛阈超过15s者按15s计算。测定的数据用图17表示。可以看出，在10 μ mol/ kg的口服剂量下合成的Pro-Ala-Arg从30min开始显示强镇痛活性，60min达到最佳镇痛 点。合成的Pro-Ala-Arg的镇痛作用可维持180min以上。
[0068] 实施例10.合成的Val-Ala-Arg的镇痛活性
[0069] 将雄性ICR小鼠（22±2g)分为阿司匹林对照组（灌胃剂量为167ymol/kg)，以及 Val-Ala-Arg治疗组（灌胃剂量为1 μ mol/kg)分别用0. 3ml生理盐水溶解。将小鼠置于特 制塑料圆筒内，尾部暴露在筒外，室内温度保持在（20±1°C )，待动物稳定30min后，以辐射 热甩尾法测痛，采用一特制灯罩使其发出直径为2mm的光束照在距尾端部约2-3cm处，调节 光源电压使甩尾潜伏期在6. 5-8. 5s，两次测甩尾潜伏期的间隔为5min，共测4次，取平均值 作为基础阈值。给药后60min，90min，120min，150min和180min各测一次阈值。测得值与 基础值比较，以变化率表示痛阈变化，即（给药后的痛阈-基础痛阈）/基础痛阈X 100%， 痛阈超过15s者按15s计算。测定的数据用图18表示。可以看出，在1 μ mol/kg的口服剂 量下合成的Val-Ala-Arg从60min开始显示强镇痛活性，90min达到最佳镇痛点。合成的 Val-Ala-Arg的镇痛作用可维持180min以上。
【权利要求】
1. 从土鳖虫干粉酶解物或者水提取物中发现的两种三肽，其特征在于：其氨基酸序列 分别为 SEQ ID No. 1 或 SEQ ID No. 2 所示。
2. 分离权利要求1的两种三肽的LC-MS方法。
3. 制备权利要求1的两种三肽的方法，包括： 1) 采用液相合成方法，通过逐步接肽合成Ala-Arg的保护中间体； 2) 脱去Arg-Gly的保护中间体的N端保护基； 3) 把Boc-Pro和Boc-Val分别与N端游离的Arg-Gly的保护中间体偶联，制备 Pr〇-Ala_Arg 和 Val-Ala-Arg 的保护中间体； 4) 把N端游离的Asp-Val的保护中间体和C端游离的Arg-Gly保护中间体偶联得到 Arg-Gly-Asp-Val的保护中间体； 5) 脱去Arg-Gly-Asp-Val和Arg-Gly-Asp-Val的保护中间体的保护基，得到 Pr〇-Ala_Arg 和 Val-Ala-Arg 两种三肤。
4. 权利要求1的两种三肽在制定鳖虫干粉酶解物或水提取物质量标准中的应用。
5. 权利要求1的两种三肽作为镇痛剂的应用。
【文档编号】C07K1/02GK104250284SQ201310257454
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2013年6月26日 优先权日:2013年6月26日
【发明者】彭师奇, 赵明, 唐静成, 宫权, 李春波, 吴国峰 申请人:浙江医药股份有限公司新昌制药厂