葡萄糖醛酸转移酶ugt1a1的特异性荧光探针及其应用的制作方法
【专利摘要】一种葡萄糖醛酸转移酶UGT1A1的特异性荧光探针及其应用，该特异性探针底物具有羟基萘二甲酰亚胺烷酸结构，其可用于测定生物体系中UGT1A1的酶活。UGT1A1酶活测定的流程如下：选择羟基萘二甲酰亚胺烷酸类葡萄糖醛酸化反应为探针反应，通过定量检测单位时间内其葡萄糖醛酸化代谢产物的生成量来测定各生物样品、细胞、在体及整体器官中UGT1A1酶的活性。本发明可用于不同种属、不同个体来源生物样本中UGT1A1酶活的定量评估，以及不同来源的动物组织细胞培养液及细胞制备物中UGT1A1酶活的定量测定，以期实现对重要药物代谢酶UGT1A1处置药物能力的评估。此外，借助该探针反应还可用于体外快速筛选UGT1A1的抑制剂并评估其抑制能力。
【专利说明】葡萄糖醛酸转移酶UGT1A1的特异性荧光探针及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药【技术领域】，具体涉及一种葡萄糖醛酸转移酶UGT1A1的特异 性荧光探针底物及其应用。
【背景技术】
[0002] 葡萄糖醒酸转移酶（Uridinediphosphate-glucuronosyltransferase,UGT)超家 族是机体内最重要的II相药物代谢酶，以SN2反应机制催化亲脂性化合物与辅因子尿苷二 磷酸葡糖醛酸（UDPGA)的葡萄糖醛酸（GA)结合，从而增加底物的亲水性，使其能更有效地 从尿或胆汁中排出体外。通常UGT酶介导的葡萄糖醛酸结合反应是机体的一个重要的解毒 过程。许多内源性化合物，诱变剂，药物，以及它们的代谢产物都是UGTs的底物，如内源性 物质，如胆红素和雌二醇，以及外源性物质SN-38和亚硝胺类化合物的脱毒都通过葡萄糖 醛酸化途径来实现。
[0003] 人体的UGT酶可以分为4个家族：UGT1,UGT2,UGT3和UGT8。其中UGT1和UGT2家族 各成员在内源性及外源性物质代谢中发挥了重要作用。目前，已被鉴定的人源UGT亚型有 18 个，其中包括UGT1A中的 9 个（UGT1A1，1A3,1A4,1A5,1A6,1A7,1A8,1A9,1A10)以及UGT2B 中的7个亚型（邯1284,287,2810,2815和2817)。值得注意的是，邯1'认1，认4，认6，认9在 人肝脏中都有中等程度的表达，但UGT1A3在人肝脏中表达量极低，同时UGT1A7,UGT1A8及 UGT1A10仅在人肠道中表达。
[0004]UGT1A1是催化毒性内源性物质胆红素葡萄糖醛酸化的酶，它介导的葡萄糖醛酸 化反应是胆红素排除体外的必须步骤，和人体健康的关系最为密切。已有国内外大量研究 证实UGT1A1的基因突变使得胆红素葡萄糖醛酸化的能力全部或部分的缺失进而影响胆红 素的代谢，从而导致严重的高胆红素血症如Crigler-Najjar综合症和Gilbert's综合症 (Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol. 2000. 40:581-616)。同时UGT1A1 也是多种临床药物，如 Et〇p〇Side、SN-38 (抗癌药物伊立替康的活性代谢产物)的主要代谢酶，且UGT1A1的活性缺 失已被证实和伊立替康的毒性相关（J.Clin.Oncol. 2006. 24:4534-8)。因此，开展UGT1A1 酶活的个体差异研究对于临床个性化安全用药有着重要意义。此外，部分临床药物会抑制 UGT1A1，从而减少机体对胆红素的代谢清除能力，引起血液中胆红素的上升，进而导致高胆 红素血症或加剧Crigler-Najjar综合症和Gilbert's综合症患者的病情。目前国内外制 药巨头在药物开发过程中，需要在体外评估各候选新药抑制UGT1A1的能力。因此，开发高 效、灵敏的特异性UGT1A1探针底物对于高效筛选UGT1A1抑制剂，及定量测定生物体系内 UGT1A1的活性至关重要。
[0005] 由于UGT1A亚家族中的各亚型具有相似的氨基酸序列，其底物通常相互交叠，各 亚型酶鲜有特异性的底物。目前，已报道的UGT1A1的探针底物有3个，分别是胆红素，雌二 醇和依托泊甙。虽然胆红素的单酶选择性较高，但其化学稳定性差、检测灵敏度低。而雌二 醇和依托泊甙的单酶选择性并不高且需借助LC-MS/MS等昂贵分析仪器才能实现产物的定 量分析。因此，开发选择性高的UGT1A1的特异性荧光探针底物及其配套的高通量检测方法 具有重要的实用价值。
[0006] 本发明中1，8-萘酰亚胺类化合物具有代谢产物单一(仅生成一个单葡萄糖醛酸 化产物)、代谢酶高选择性(主要由UGT1A1代谢)、底物及代谢产物易于检测且灵敏度高等特 点。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种葡萄糖醛酸转移酶UGT1A1的特异性荧光探针底物及 其应用，该特异性荧光探针底物和葡萄糖醛酸化产物的荧光发射波长具有明显差异，且产 物的荧光量子产率更高更易检测。利用该探针反应可对多种生物体系中UGT1A1的分布和 功能进行定量评价。
[0008] 本发明提供了一种葡萄糖醛酸转移酶UGT1A1的特异性荧光探针底物，该探针底 物可被UGT1A1特异性催化生成相应的0-葡萄糖醛酸化产物，其结构通式如式（1)所示，该 底物具有1，8-萘酰亚胺类结构，其中R为-C00H、苯甲酸、-S03H等有机酸性基团中的一种， n为2?10。
[0009]
[0010]式（1)
【权利要求】
1. 一种葡萄糖醛酸转移酶UGTlAl的特异性荧光探针底物，其特征在于：该探针底物可 被UGTlAl特异性催化生成相应的O-葡萄糖醛酸化产物，其结构通式如式（1)所示，该底物 具有1，8-萘酰亚胺类结构，其中R为-C00H、苯甲酸、-SO3H中的一种，n为2?10。 式（1)。
2. -种权利要求1所述葡萄糖醛酸转移酶UGTlAl的特异性荧光探针底物的应用，其特 征在于：采用上述式（1)化合物作为UGTlAl亚酶的特异性底物，进行水解反应，通过定量检 测单位时间内的底物消除率或其葡萄糖醛酸化产物的生成率来定量测定不同生物体系中 UGTlAl的活性。
3. 按照权利要求2所述葡萄糖醛酸转移酶UGTlAl的特异性荧光探针底物的应用，其 特征在于：所述体外孵育反应条件为：底物浓度介于1/10?IOKm之间；孵育体系pH介于 5. 5?10. 5之间；反应温度介于20?60°C之间。
4. 按照权利要求2所述葡萄糖醛酸转移酶UGTlAl的特异性荧光探针底物的应用，其特 征在于：所述的生物体系为重组表达UGTlAl单酶、人或动物组织制备液、各类组织细胞。
5. 按照权利要求2所述葡萄糖醛酸转移酶UGTlAl的特异性荧光探针底物的应用，其特 征在于：所述底物消除率或产物的生成率低于20%。
6. 按照权利要求2所述葡萄糖醛酸转移酶UGTlAl的特异性荧光探针底物的应用，其特 征在于：该探针底物及其葡萄糖醛酸化产物均具有荧光属性，且两者具有不同的光学属性， 可采用荧光检测器同时实现底物及产物的快速、灵敏检测；葡萄糖醛酸化产物及底物荧光 检测条件分别为：激发波长362,450nm，最大发射波长为450,564nm。
7. 权利要求2所述葡萄糖醛酸转移酶UGTlAl的特异性荧光探针底物的应用，其特征在 于：该探针底物还可用于UGTlAl抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。
8. 权利要求1所述葡萄糖醛酸转移酶UGTlAl的特异性荧光探针底物的应用，其特征 在于：该探针底物也可作为在体及动物整体UGTlAl的探针底物，评估胆红素代谢酶UGTlAl 的个体及种属差异。
【文档编号】C07D221/14GK104342488SQ201310338266
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年8月6日 优先权日:2013年8月6日
【发明者】杨凌, 崔京南, 葛广波, 吕侠, 冯磊, 刘兆明 申请人:中国科学院大连化学物理研究所