针对β-淀粉样蛋白肽的抗体的制作方法

针对β-淀粉样蛋白肽的抗体的制作方法
【专利摘要】结合人类β-淀粉样蛋白肽的抗体，使用所述抗体治疗特征在于提高的β淀粉样蛋白水平或β淀粉样沉淀的疾病或失调的方法，包含所述抗体的药物组合物和制造方法。
【专利说明】针对β-淀粉样蛋白肽的抗体
[0001]本申请为申请号为200780012436.0的分案申请，要求2006年3月30日的优先权。发明领域
[0002]本发明涉及结合β -淀粉样蛋白肽、特别是人类β -淀粉样蛋白肽的抗体。本发明还涉及用所述抗体治疗特征是提高的β淀粉样蛋白水平或β_淀粉样沉淀，特别是阿尔茨海默氏病的疾病或失调的方法，包含所述抗体的药物组合物以及制造的方法。根据以下的描述，本发明的其他方面将变得明显。
[0003]发明背景
[0004]阿尔茨海默氏病(AD)是年龄相关的认知下降的最常见原因，在世界范围内影响超过 I 千 2 百万人(Citron M(2002)Nat.Neurosci5, Suppll055_1057)。疾病的最早的阶段特征在于伴有相关的认知下降和语言及行为缺陷的渐进性的记忆丧失。在疾病的较晚阶段，患者发生全局的健忘症，并具有大大地降低的运动机能。死亡一般在诊断后9年发生，通常与其他状况，一般是肺炎相关(Davis K.L.and Samules S.C.(1998) in PharmacologicalManagement of Neurological and Psychiatric Disorders eds Enna S.J.and CoyleJ.T.(McGraw-Hill, New York pp267_316))。当前的治疗代表了症状性的方法，集中于减轻认知损伤和改善与进展的疾病病因相关的行为症状。实际上，这些治疗仅提供了短暂的认知益处，报道的认知损伤的水平仅维持达2年。减缓并可能停止病发展的疾病修饰治疗的潜力是巨大的。这种方法将提供对患者、特别是他们的护理者的生活质量的巨大的和持续的改善，以及降低这种疾病的巨大的总体护理成本。
[0005]阿尔茨海默氏病的临床诊断是基于生理和心理测试的组合，其将产生可能的或大概的阿尔茨海默氏病的诊断结论。在死后，通过良好地表征脑中的神经病学标志来确认疾病，其包括实质斑块和脑血管中Aβ的沉积，神经纤丝缠结的神经内形成，突触损失和特定脑区域中的神经兀亚群的损失。(Terry, RD (1991) J Neural Trans Suppl53:141-145)。
[0006]大量的遗传学的、组织学和功能证据表明β -淀粉样蛋白肽(Αβ )是阿尔茨海默氏病发展的关键(Selkoe, D.J.(2001) Physiological Reviews81:741-766)。
[0007]Αβ已知通过β淀粉样蛋白前体蛋白(也称为APP)被称为BACEl的天冬氨酰蛋白酶(也称为 β -分泌酶、Asp2 或 Memapsin-2)裂解产生(De Strooper, B.and Konig, G.(1999)Nature402:471-472)。除了实质和血管的沉积之外，Αβ的可溶的寡聚形式已经被假定促进了 AD的发作,它们可以通过损害突触功能初步地影响神经元功能(Lambert et.al.(1998proceedings of the National Academy of Science, U.S.A.95:6448-6453)。虽然早期在AD中和在MCI中发现了不溶的淀粉样蛋白斑块，可溶的Αβ聚集物(称为寡聚体或Αβ衍生的可扩散配体(ADDL)的水平也在这些个体中增加，与淀粉样蛋白斑块相比，可溶Αβ水平与神经纤丝退化、突触标记物的损失更好地相关。(Naslund et.al.(2000) J AmMed Assoc283:1571-1577, Younkin, S.(2001)Nat.Med.1:8-19)。高度淀粉样变性的 Αβ 42和氨基末端截短形式A β χ-42是在弥散和老年斑中存在的A β的优势种类(Iwatsubo, T(1994)Neuron.13: 45 - 53, Gravina, SA(1995)J.Biol.Chem.270:7013 - 7016)。Αβ 42 的相对水平似乎是Αβ聚集成淀粉样蛋白斑块的关键调节物，实际上Αβ 42显示了离体时比其他 Αβ 更容易聚集(Jarrett, JT (1993)Biochemistry.32:4693 - 4697)，因而暗示了 Αβ 42作为 AD 的发病机理的启动分子(Younkin SG, (1998)J.Physiol.(Paris).92:289 - 292)。虽然Αβ 42是APP新陈代谢的副产物，在它的产生中的小的偏差与对Αβ沉积的大的影响相关，因而假定的是，单独的A β 42的降低可能是治疗AD的有效途径(Younkin SG, (1998)J.Physiol.(Paris).92:289 - 292)。为了支持这一点，淀粉样蛋白前体蛋白质(APP)和presenilin基因中的突变已经被报道主要地提高Αβ42的相对水平，并因而缩短阿尔茨海默氏病(AD)的发作时间(Selkoe D.J., Podlisny Μ.B.(2002) Annu.Rev.Genomics Hum.Gemet.3:67-99)。然而要注意的是沉积速率也取决于分解代谢和Aβ清除。
[0008]通过在小鼠中过量表达突变的人类转基因已经产生了淀粉样蛋白沉积的动物模型。过量表达单独的人类APP转基因的小鼠一般从12月龄发展出脑部斑块样β-淀粉样沉淀(Games D.et al., (1995) Nature373:523-527;Hsiao K.et al., (1996)Science274:99-102))，而携带突变的人类APP和presenilin-1 (PS-1)转基因的小鼠一般早在2月龄发展出脑部斑块样β-淀粉样沉淀(Kurt Μ.A.et al.，(2001) Exp.Neurol.171:59-71;McGowan E.et al., (1999) NeuroIbio1.Dis.6:231-244)0
[0009]变得越来越明显的是，在中枢神经系统(CNS)和血浆之间外源A β的转运在脑淀粉样蛋白水平的调节方面起到作用(Shibata, et al (2000) J ClinInvestl06:1489-1499), CSF Αβ被快速地从CSF转运到原生质。因而，使用Αβ肽的主动疫苗接种或特异性Aβ抗体的被动施用快速地结合了外周的Αβ，改变血浆、CSF之间和最终的CNS的动力平衡。实际上现在有很多的研究展现了这些方法都可以在淀粉样变性的各种转基因模型中降低Αβ水平，降低Αβ病理并提供认知的益处。还在高等动物中进行了有限的研究。Caribbean vervet猴(16-10岁)用Aβ肽免疫10个月。在血衆中Αβ 40水平提高2-5倍，峰值在251d，而Αβ 40和Αβ 42的水平到IOOd显著地降低，此后向基线返回。在CSF中的这种 降低伴随着斑块负荷的显著降低(Lemere, CA (2004) Am JPathologyl65:283-297)。血浆Αβ水平的类似提高也在年老的(15-20岁)恒河猴的免疫之后检测到(Gandy, S (2004) Alzheimer Dis Assoc Disordl8:44:46.[0010]针对脑淀粉样蛋白的第一个免疫治疗是Elan/AN-1792，一种活性疫苗。这种治疗在与脑膜脑炎相符的临床征象的出现之后被终止。亚群分析表明，治疗减慢了认知功能的下降(Nature Clin Pract Neurol (2005)1:84_85)。患者的事后的分析也显示了斑块清除的证据(Gilman S.et al, (2005)Neurology64 (9)1553-1562)。Bapineuzumab (AAB-OOI,Elan/Wyeth),—种被动的MAb治疗已经在小的I期安全性研究中显示了显著地改善认知分值。
[0011]特征在于提高的β -淀粉样蛋白水平或β -淀粉样沉淀的其他疾病或失调包括轻微的认知损伤(MCI, Blasko 1(2006)Neurobiology of aging^Conversion from cognitivehealth to mild cognitive impairment and Alzheimer’s disease:Predictionby plasma amyloid β 42, medial temporal lobe atrophy and homocysteine，，inpress, e_publishedl90ct2006)、伴有荷兰型β -淀粉样变性的遗传性脑出血、脑β _淀粉样蛋白血管病和各种类型的退化性痴呆，例如与帕金森氏病相关的那些，渐进性的核上的麻痹、皮层基底退化和阿尔茨海默氏病的弥散Lewis体型(Mollenhauer B(2007)J NeuralTransm e-published23Feb2007, van Oi jen, M Lancet Neurol.20065:655-60)和Down综合征(Mehta, PD (2007)J Neurol Sc1.254:22-7)。
[0012]发明概沭
[0013]在本发明的一个实施方式中，提供了治疗性抗体，其是抗体或抗原结合片段和/或其衍生物，其以低于IOOpM的平衡常数KD结合β-淀粉样蛋白肽1_12(SEQ ID NO:15),但是不结合β-淀粉样蛋白肽2-13 (SEQ ID NO:44)，两种测定都在利用在链霉抗生物素蛋白芯片上捕获的肽的表面等离子共振分析中进行。 [0014]在本发明的另一个实施方式中，提供了治疗性抗体，其是抗体或抗原结合片段和/或其衍生物，其以低于IOOpM的平衡常数KD结合β-淀粉样蛋白肽1_12(SEQ ID NO:15),具有的与淀粉样蛋白肽2-13 (SEQ ID NO:44)的结合的平衡常数KD，1000倍大于与肽1-12 (SEQ ID NO:15)的结合的平衡常数，两种测定都在利用在链霉抗生物素蛋白芯片上捕获的肽的表面等离子共振分析中进行。
[0015]在本发明的另一个实施方式中，提供了治疗性抗体，其是抗体或抗原结合片段和/或其衍生物，其以低于IOOpM的平衡常数KD结合β-淀粉样蛋白肽1_12(SEQ ID NO:15),具有的与淀粉样蛋白肽2-13 (SEQ ID NO:44)的结合的平衡常数KD，10，000倍大于与肽1-12 (SEQ ID NO:15)的结合的平衡常数，两种测定都在利用在链霉抗生物素蛋白芯片上捕获的肽的表面等离子共振分析中进行。
[0016]在一个方面，利用在链霉抗生物素蛋白芯片上捕获的肽的表面等离子共振分析是在以下的实施例中描述的表面等离子共振分析。在另一个方面，利用在链霉抗生物素蛋白芯片上捕获的肽的表面等离子共振分析是以下的SPR Biacore?分析描述的方法A (i)。
[0017]在本发明的一个可选择的实施方式中，提供了治疗性抗体，其是抗体或抗原结合片段和/或其衍生物，其以低于IOnM的平衡常数结合β -淀粉样蛋白肽1-40，但是不结合β-淀粉样蛋白肽2-13(SEQ ID NO:44)，两种测定都在以下的实施例的方法B中描述的表面等离子共振分析中进行。
[0018]在本发明的另一个可选择的实施方式中，提供了治疗性抗体，其是抗体或抗原结合片段和/或其衍生物，其以低于IOnM的平衡常数结合β -淀粉样蛋白肽1-40，具有的与β-淀粉样蛋白肽2-13 (SEQ ID NO:44)的结合的平衡常数KD，1000倍大于与肽1-12 (SEQID NO:15)的结合的平衡常数，两种测定都在以下的实施例的方法B中描述的表面等离子共振分析中进行。
[0019]在本发明的另一个可选择的实施方式中，提供了治疗性抗体，其是抗体或抗原结合片段和/或其衍生物，其以低于IOnM的平衡常数结合β -淀粉样蛋白肽1-40，具有的与β-淀粉样蛋白肽2-13 (SEQ ID NO:44)的结合的平衡常数KD，10，000倍大于与肽1-12(SEQ ID NO:15)的结合的平衡常数，两种测定都在以下的实施例的方法B中描述的表面等离子共振分析中进行。
[0020]在本发明的实施方式中，提供了治疗性抗体，其是抗体或抗原结合片段和/或其衍生物，其结合β_淀粉样蛋白肽，并且其包含以下⑶R:
[0021]CDRHl:DNGMA (SEQ ID No:1)
[0022]CDRH2:FISNLAYSIDYADTVTG (SEQ ID No:2)
[0023]CDRH3:GTWFAY (SEQ ID No:3)[0024]处在来源于VH3基因家族的人类重链可变区之内，和:
[0025]CDRLl:RVSQSLLHSNGYTYLH (SEQ ID No:4)
[0026]CDRL2:KVSNRFS (SEQ ID No:5)
[0027]CDRL3:SQTRHVPYT (SEQ ID No:6)
[0028]处在来源于GenP印t条目CAA51135中公开的氨基酸序列的人类轻链可变区(SEQID NO:24)之内。
[0029]在整个说明书中，术语“CDR”、“ CDRLl ”、“ CDRL2 ”、“ CDRL3 ”、“ CDRHl ”、“ CDRH2 ”、“CDRH3，， 根据 Kabat et al;Sequences of proteins of Immunological InterestNIH, 1987中阐述的Kabat编号系统。因而，以下的定义了根据本发明的⑶R:
[0030]CDR 残基
[0031]CDRH1:31_35B
[0032]CDRH2:50-65
[0033]CDRH3:95-102
[0034]CDRLl:24-34 [0035]CDRL2:50-56
[0036]CDRL3:89-97
[0037]VH3基因家族和相关的免疫球蛋白基因命名在Matsuda et al (Journal ofExperimental Medicine, 188:2151-2162, 1998)和 Lefranc&Lefranc(The ImmunoglobulinFactsbook.2001.Academic Press: London)中描述。
[0038]在特定的实施方式中，人类重链可变区来源于:
[0039]?选自以下 VH3 家族成员的子集的 V基因:VH3-48、VH3-21、VH3-11、VH3-7、VH3-13、VH3-74、VH3-64、VH3-23、VH3-38、VH3-53、VH3-66、VH3-20、VH3-9&VH3-43
[0040]?选自以下VH3家族成员的子集的V基因:VH3-48，VH3-21&VH3-11
[0041].νΗ3_48 基因
[0042]或其等位基因。
[0043]Genbank条目Μ99675中的序列是VH3-48基因的等位基因。Μ99675是包括两个外显子的DNA的基因组片段的Genbank核苷酸序列，所述外显子构成人类重链基因VH3-48(SEQ ID Ν0:22)并编码SEQ ID NO:21中给出的可变区氨基酸序列。在特定的方面，人类接受体重链框架来源于Μ99675。
[0044]为了构建完整的V-区域，框架4必需添加到种系编码的V基因Μ99675。适合的框架4序列包括人类JH4迷你基因(minigene)编码的那些(Kabat):
[0045]YFDYffGQGTLVTVSS (SEQ ID No:23)
[0046]其中属于CDR3区域的开头的四个残基被来自供体抗体的引入的CDR替换。
[0047]技术人员理解的是，种系V基因和J基因不包括重链⑶R3的整个的编码序列。然而，在本发明的抗体中，CDR3序列由供体免疫球蛋白提供。因而，VH基因例如VH3-48、JH迷你基因例如JH4的组合，以及一组重链CDR，例如SEQ ID NO:USEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3 (以一定方式组装以模拟成熟的、完整的重排重链可变区)足以定义本发明的重链可变区，例如在SEQ ID NO:26,28和30中表示的。
[0048]由Genp印t ID CAA51134编码的可变区具有SEQ ID NO:24中给出的氨基酸序列。[0049]由GenP印t ID CAA51134已知的轻链可变区框架序列是完整的重排轻链可变区的推定的氨基酸序列，与数据库中具有相同框架的另一个氨基酸序列=Genpept登记号码S40356 相同，并在 Klein，R.et al., Eur.J.1mmunol.23 (12), 3248-3262 (1993)中描述了。作为Genbank登记N0.X72467可获得的CAA51134的DNA编码序列作为SEQ ID NO:25来给出。
[0050]在本发明的特定的方面，人类接受体重链框架来源于M99675和JH4迷你基因，人类接受体轻链框架来源于CAA51135，任选地含有一个或多个，例如一到四个，更特别地一到三个，根据在具有序列SEQ ID NO:17的供体Vh结构域和具有序列SEQ ID NO:19的\结构域中存在的相应残基氨基酸残基的替换，其维持了供体抗体对β_淀粉样蛋白肽的所有的或基本上所有的结合亲和性。
[0051]“基本上所有的结合亲和性”是指，与供体抗体相比，治疗性抗体具有结合亲和性方面最多10倍降低。
[0052]在更特别的方面，来源于Μ99675和JH4的本发明的接受体重链框架具有选自位置24、48、93和/或94 (Kabat编号)的一到四个氨基酸残基替换。
[0053]在本发明的更特别的方面，来源于Μ99675和JH4的人类接受体重链框架包含以下的残基(或其保守性替换物):
[0054]( i)
[0055]位置残基
[0056]93V
[0057]94S
[0058]或
[0059](ii)
[0060]
UW残墓
24V
[0061]
93V
94S
[0062]或
[0063](iii)
[0064]
位置残基
48I
93V
94S
[0065]在本发明的一个实施方式中，提供了治疗性抗体，其包含具有SEQ ID NO:26、28或30中列出的序列的Vh链和具有SEQ ID NO:32中列出的序列的\结构域。
[0066]在本发明的另一个实施方式中，提供了治疗性抗体，所述抗体包含具有SEQ IDNO:34,36或38中列出的序列的重链和具有SEQ ID NO:40中列出的序列的轻链。
[0067]在本发明的另一个实施方式中，提供了包含根据本发明的的治疗性抗体的药物组合物。
[0068]在本发明的进一步的实施方式中，提供了治疗受到β淀粉样蛋白肽相关疾病影响的人类患者的方法，所述方法包括向所述患者施用治疗有效量的根据本发明的治疗性抗体的步骤。
[0069]还提供了根据本发明的治疗性抗体在制造用于治疗β淀粉样蛋白肽相关疾病的药物方面的用途。
[0070]在本发明的另一个实施方式中，提供了生产根据本发明的治疗性抗体的过程，所述过程包括在宿主细胞中表达编码所述抗体的多核苷酸。
[0071]在本发明的另一个实施方式中，提供了编码治疗性抗体重链的多核苷酸，所述治疗性抗体重链包含具有SEQ ID NO:26、28或30中所列的Vh链。
[0072]在本发明的另一个实施方式中，提供了编码治疗性抗体轻链的多核苷酸，所述治疗性抗体轻链包含具有SEQ ID NO:32中所列的\结构域。
[0073]在本发明的另一个实施方式中，提供了编码治疗性抗体重链的多核苷酸，所述治疗性抗体重链具有SEQ ID NO:34、36或38中所列的序列。
[0074]在本发明的另一个实施方式中，提供了编码治疗性抗体轻链的多核苷酸，所述治疗性抗体轻链具有SEQ ID NO:40中所列的序列。
[0075]在本发明的更特别的实施方式中，提供了编码治疗性抗体重链的多核苷酸，所述多核苷酸包含在SEQ ID NO:35、37、39或42中所列的序列。
[0076]在本发明的另一个更特别的实施方式中，提供了编码治疗性抗体轻链的多核苷酸，所述多核苷酸包含在SEQ ID NO:41或43中所列的序列。
[0077]在特定的实施方式中，作为抗体或片段和/或其衍生物的治疗性抗体基本上缺乏a)经典途径的补体的活化；和b)调节抗体依赖性细胞毒性的功能。
[0078]在本发明的另一个实施方式中，提供了抗体或其片段，其包含具有序列SEQ IDNO:17的VH结构域和具有序列SEQ ID NO:19的\结构域。
[0079]在本发明的另一个实施方式中，提供了编码包含具有序列SEQ ID N0:17的￥11结构域的抗体重链或其片段的多核苷酸，特别是SEQ ID N0:18的多核苷酸。
[0080]在本发明的另一个实施方式中，提供了编码包含具有序列SEQ ID N0:19的'结构域的抗体轻链或其片段的多核苷酸，特别是SEQ ID N0:20的多核苷酸。
[0081]发明的详细i兑明
[0082]1.杭体结构
[0083]1.1完整抗体
[0084]完整抗体通常是包含至少两个重链和两个轻链的异多聚糖蛋白。除了 IgM之外，完整抗体是大约150KDa的杂四聚糖蛋白，包括两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链。一般地，每条轻链通过一个共价的二硫键连接到重链，而不同的免疫球蛋白同种型的重链之间二硫键的数目是可变的。每条重链和轻链也具有链内的二硫键。每条重链在一个末端具有可变区(VH)，之后是多个恒定区。每条轻链具有可变区(')和在它另一个末端的恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区对准，轻链可变区与种类的可变区对准。来自大多数脊椎动物物种的抗体的轻链可以根据恒定区的氨基酸序列被分成称为Kappa和Lambda的两种类型之一。取决于它们的重链的恒定区的氨基酸序列，人类抗体可以被分成五种不同的种类，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM0 IgG和IgA可以进一步分成子类,IgGl、IgG2、IgG3和IgG4 ;以及IgAl和IgA2。具有至少IgG2a、IgG2b的小鼠和大鼠中存在物种变体。抗体的可变区赋予抗体上的结合特异性，显示了特定的变异性的某些区域称为互补决定区(CDR)。可变区的更保守的部分称为框架区域(FR)。完整重链和轻链的可变区各自包含三个CDR连接的四个FR。每条链中的⑶R通过FR区域紧密地保持在一起，来自另一条链的⑶R促进了抗体的抗原结合位点的形成。恒定区不直接地涉及抗体与抗原的结合，但是展现了各种效应物功能，例如参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、经由与Fe Y受体结合的吞噬作用、经由新生Fe受体(FcRn)的半衰期/清除率和经由补体级联的Clq组件的互补依赖性细胞毒性。人类IgG2恒定区缺乏通过经典途径活化补体的能力，或介导抗体依赖性细胞毒性的能力。IgG4恒定区缺乏通过经典途径活化补体的能力，仅仅微弱地介导抗体依赖性细胞毒性。基本上缺乏这些效应物功能的抗体可以称为“非裂解”抗体。
[0085]1.1.1人类杭体[0086]人类抗体可以通过本领域技术人员已知的许多方法来产生。人类抗体可以通过利用人类骨髓瘤或小鼠-人类杂交骨髓瘤细胞系的杂交瘤方法来产生，参见KozborJ.1mmunol133，3001，(1984)和 Brodeur, Monoclonal Antibody Production Techniquesand Applications, pp51_63 (Marcel Dekker Inc, 1987)。可选择的方法包括利用嗤菌体库或转基因小鼠，两者都利用了人类V区库(参见Winter G, (1994), Annu.Rev.1mmunol12, 433-455, Green LL (1999) , J.1mmunol.methods231, 11-23)。
[0087]几个转基因小鼠品系现在是可获得的，其中它们的小鼠免疫球蛋白基因座已经用人免疫球蛋白基因片段替换(参见 Tomizuka K, (2000) PNAS97, 722-727;Fishwild D.M(1996)Nature Biotechnol.14，845-851，Mendez MJ, 1997, Nature Genetics, 15, 146-156)。在抗原攻击时，这种小鼠能够产生人类抗体的所有部分，从中可以选择感兴趣的抗体。
[0088]特别注意的是Trimera? 系统(参见 Eren R et al, (1998)Immunology93:154-161),其中人类淋巴细胞被移植到照射的小鼠中，选择淋巴细胞抗体系统(SLAM,参见Babcook et al, PNAS (1996)93:7843-7848)，其中人类(或其他物种)淋巴细胞被有效地穿过大量集中的体外抗体产生过程，随后是deconvulated、限制稀释和选择过程，以及Xenomouse II?。可选择的方法是可以从Morphotek Inc获得的，利用Morphodoma?技术。
[0089]噬菌体展示技术可以用于产生人类抗体(和其片段)，参见McCafferty;Nature, 348,552-553 ( 1990)和 Griffiths AD et al ( 1994)EMB013:3245-3260。依据这种技术，抗体V区基因按照框架被克隆到丝状噬菌体的主要和次要外壳蛋白基因中，例如M13或fd，在噬菌体粒子的表面上被呈现(通常借助于辅助噬菌体)为功能性抗体片段。根据抗体的功能性质的选择产生了编码展现那些性质的抗体的基因的选择。噬菌体展示技术可以用于从库中选择抗原特异性抗体，所述库从取自受如上所述的疾病或失调影响个体、或作为选择取自未免疫的人类供体的人类B细胞制成(参见Marks; J.Mol.Bi0.222，581-597，1991)。当期望完整的人类抗体包含Fe结构域时，必需的是重新将噬菌体展示的衍生片段克隆到包含期望的恒定区的哺乳动物表达载体中并建立稳定的表达细胞系。
[0090]亲合成熟(Marks;Bio/technollO, 779-783 (1992))的技术可以用于改善结合亲和性，其中原始人类抗体的亲和性通过用天然发生的变体连续替换H和L链的V区并在改善的结合亲和性的基础上选择来改善。这种技术的变体例如“表位印记”现在也是可用的，参见 W093/06213。也参见 Waterhouse;Nucl.Acids Res21, 2265-2266 (1993)。
[0091]1.2嵌合的和人源化抗体
[0092]在人类疾病或失调的治疗中使用非人类抗体带来了潜在的免疫原性的现在公认的难题，特别是在抗体的重复施用时，也就是，患者的免疫系统可以将非人类完整抗体识别为非自身的并产生中和反应。除了开发完全人类抗体(参见上文)之外，多年来已经开发了各种技术来克服这些难题，一般地涉及降低完整治疗性抗体中非人类氨基酸序列的组成，而保持相对容易从免疫的动物，例如大鼠、小鼠或兔获得非人类抗体。大致两种方法已经用于实现这一点。第一种是嵌合抗体，其一般包括融合到人类恒定区的非人类(例如，哨齿动物如小鼠)可变区。由于抗体的抗原结合位点定位于可变区之内，嵌合抗体保持了它对抗体的结合亲和性，但是获得了人类恒定区的效应物功能，因而能够进行效应物功能，例如上文中所述的。嵌合抗体一般使用重组DNA方法产生。编码抗体的DNA (例如，cDNA)使用常规过程(例如，通过使用寡核苷酸探针，其能够特异性地结合编码本发明的抗体的H和L链可变区的基因，例如上文描述的SEQ ID NO:18和20的DNA)来分离和测序。杂交瘤细胞充当这种DNA的典型来源。一旦被分离出来,DNA可以被放入表达载体中，然后将表达载体转染入宿主细胞，例如E.coliXOS细胞、PerC6细胞或不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以获得抗体的合成。通过用人类L和H链的编码序列替换相应的非人类(例如，鼠)H和L恒定区，可以修饰DNA，参见，例如Morrison;PNAS81，6851 (1984)。因而，本发明的另一个实施方式，提供了嵌合抗体，其包含具有序列SEQ ID NO: 17的Vh结构域和具有序列SEQ ID NO:19的\结构域、融合到人类恒定区(其可以是IgG同种型，例如IgGl)。
[0093]第二种方法涉及产生人源化抗体，其中抗体的非人类内容通过使可变区人源化来降低。人源化的两种技术已经变得流行。第一种是通过⑶R移植来人源化。⑶R构造环靠近抗体的N-末端，在此它们形成装配在框架区域提供的支架中的表面。抗体的抗原结合特异性主要由拓扑图和由它的CDR表面的化学特性决定。这些特征随后由单独的CDR的构象、CDR的分布以及包含CDR的残基的侧链的性质和分布来决定。免疫原性的大的降低可以通过仅仅移植非人类(例如，鼠)抗体(“供体”抗体)的CDR到适合的人类框架(“接受体框架”)和恒定区中来实现(参见Jones et al (1986) Nature321, 522-525andVerhoeyen M et al (1988)Science239, 1534-1536)。然而，CDR 移植本身不能产生抗原结合性质的完全保留，经常发现的是，如果要恢复显著的抗原结合亲和性，供体抗体的某些框架残基需要被保留(有时称为“回复突变”)在人源化分子中(参见Queen C et al (1989)PNAS86, 10, 029-10, 033, Co, M et al (1991) Nature351, 501-502)。在这种情况中，显示了与非人类供体抗体的最大序列同源性(一般60%或更高)的人类V区域可以从数据库中选择以提供人类框架(FR)。人类FR的选择可以从人类共有的或单独的人类抗体来进行。此时来自供体抗体的必需关键残基被替换到人类接受体框架中以保持CDR构象。抗体的计算机建模可以用于帮助鉴定这种结构上重要的残基，参见W099/48523。
[0094]做为选择，人源化可以通过“饰面”(veneering)的过程来实现。独特的人类和鼠免疫球蛋白重链和轻链可变区的统计分析揭示了，暴露的残基的确切模式在人类和鼠抗体中是不同的，各表面位置中的大多数具有对少数不同残基的强的偏爱性(参见PadlanE.A.et al; (1991) Mol.1mmunol.28, 489-498and Pedersen J.T.et al (1994) J.Mol.Biol.235;959-973)。因而，有可能通过替换其框架区域中与在人类抗体中通常发现的不同的暴露残基来降低非人类Fv的免疫原性。因为蛋白质抗原性可能与表面可接近性相关，表面残基的替换可能足以使小鼠可变区对于人类免疫系统来说成为“看不见的”。(还参见 Mark G.E.et al (1994) in Handbook of Experimental Pharmacology vol.113:Thepharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, ppl05-134)o 这种人源化的过程被称为“饰面”，因为引物仅改变了抗体的表面，支持性残基保持原状。进一步可选择的方法包括W004/006955中阐述的，和Humaneering? (Kalobios)的过程，其利用了细菌表达系统，并产生在序列上接近人类种系的抗体(Alfenito-M Advancing ProteinTherapeutics January2007, San Diego, California)。 [0095]对本领域技术人员明显的是，术语“衍生的”意图是不仅定义在材料的物理来源的意义上的来源，还定义结构上相同于所述材料、但不来源于参考来源的材料。因而，“供体抗体中存在的残基”不必是从供体抗体纯化的。
[0096]本领域公认的是，某些氨基酸替换被认为是“保守的”。氨基酸根据常见的侧链性质被分成几组，维持了本发明的治疗性抗体的所有的或基本上所有的结合亲和性的组内的替换被认为是保守性替换，参见以下表1:
[0097]表1
[0098]
【权利要求】
1.一种治疗性抗体，其是抗体或抗原结合片段和/或其衍生物，其结合β-淀粉样蛋白肽，并且其包含以下⑶尺:
CDRHl:DNGMA (SEQ ID No:1)
CDRH2:FISNLAYSIDYADTVTG (SEQ ID No:2)
CDRH3:GTWFAY (SEQ ID No:3) 处在来源于VH3基因家族的人类重链可变区之内，和:
CDRLl:RVSQSLLHSNGYTYLH (SEQ ID No:4)
CDRL2:KVSNRFS (SEQ ID No:5)
CDRL3:SQTRHVPYT (SEQ ID No:6) 处在来源于GenP印t条目CAA51135中公开的氨基酸序列的人类轻链可变区(SEQ IDNO:24)之内。
2.根据权利要求1的治疗性抗体，其中所述抗体或抗原结合片段和/或其衍生物以低于IOOpM的平衡常数KD结合β -淀粉样蛋白肽1-12 (SEQ ID NO:15)，具有的与β -淀粉样蛋白肽2-13 (SEQ ID NO:44)的结合的平衡常数KD，1000倍大于与肽1-12 (SEQ ID NO:15)的结合的平衡常数，两种测定都在利用在链霉抗生物素蛋白芯片上捕获的肽的表面等离子共振分析中进行。
3.根据权利要求1的治疗性抗体，其中所述抗体或抗原结合片段和/或其衍生物以低于IOnM的平衡常数KD结合 β-淀粉样蛋白肽1-40，具有的与β -淀粉样蛋白肽2_13(SEQID NO:44)的结合的平衡常数KD，1000倍大于与肽1-12 (SEQ ID NO:15)的结合的平衡常数，这些测定在利用BiOCOre?3000的表面等离子共振分析中进行，其中所述抗体首先在CM5生物传感器芯片的蛋白A表面捕获到1000-2500共振单位的水平，已在HBS-EP缓冲液中稀释的β -淀粉样蛋白1-40、2-13或1-12以4-500ηΜ的浓度范围流过捕获的抗体表面(即实施例的方法B)。
4.根据权利要求1、2或3的治疗性抗体，其中所述人类重链可变区来源于: ?选自以下VH3家族成员的子集的V基因:VH3-48、VH3-21、VH3-11、VH3-7、VH3-13、VH3-74、VH3-64、VH3-23、VH3-38、VH3-53、VH3-66、VH3-20、VH3-9& VH3-43?选自以下VH3家族成员的子集的V基因:VH3-48、VH3-21&VH3-11? VH3-48 基因或其等位基因。
5.根据权利要求4的治疗性抗体，其中所述人类接受体重链框架与框架4一同来源于M99675 (SEQ ID NO:21)。
6.根据权利要求5的治疗性抗体，其中框架4序列是由人类JH4迷你基因(Kabat)编码的:
YFDYffGQGTLVTVSS (SEQ ID No:23) 其中属于CDR3区域的开始的四个残基被来自供体抗体的引入的CDR替换。
7.根据权利要求6的治疗性抗体，其含有根据在具有序列SEQIDNO:17的供体VH结构域和具有序列SEQ ID NO:19的VL结构域中存在的相应残基的、维持供体抗体对β -淀粉样蛋白肽的所有的或基本上所有的结合亲和性的一个或多个氨基酸残基替换。
8.根据权利要求7的治疗性抗体，其中来源于Μ99675和JH4的人类接受体重链框架含有选自位置24、48、93和/或94 (Kabat编号)的一到四个氨基酸残基替换。
9.根据权利要求8的治疗性抗体，其中人类接受体重链框架包含以下的残基(或其保守性替换): ⑴
10.根据任何前述权利要求的治疗性抗体，其是IgGl同种型。
11.根据任何前述权利要求的治疗性抗体，其基本上缺乏a)通过经典途径的补体的活化；和b)调节抗体依赖性细胞毒性的功能。
12.根据权利要求10的治疗性抗体，其中残基235和237已经被突变成丙氨酸。
13.一种包含根据任一前述权利要求的治疗性抗体的药物组合物。
14.权利要求1到12的任一项的治疗性抗体，用于治疗β淀粉样蛋白肽相关疾病。
15.用于制备权利要求1到12的任一项的治疗性抗体的方法，其中所述方法包括在宿主细胞中表达编码所述抗体的多核苷酸。
【文档编号】C07K16/18GK103539857SQ201310338011
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2007年3月27日 优先权日:2006年3月30日
【发明者】S.A.伯比奇, J.H.艾利斯, S.K.福德, V.格尔马谢夫斯基, U.库马, K.L.菲尔波特, P.E.索登 申请人:葛兰素集团有限公司