含有鼠神经生长因子的表达载体及细胞的制作方法
【专利摘要】本发明涉及用于表达生长因子的表达载体和细胞，具体地，本发明涉及含有鼠神经生长因子的重组载体及重组细胞，本发明还涉及所述重组细胞的制备方法、鼠神经生长因子的纯化方法以及所述重组载体或重组细胞用于制备鼠神经生长因子的用途。本发明利用哺乳动物细胞表达系统成功表达了鼠神经生长因子，并进一步证明了该鼠神经生长因子序列正确且具有较高的比活性高，具有良好的应用前景。
【专利说明】含有鼠神经生长因子的表达载体及细胞
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于表达生长因子的表达载体和细胞，具体地，本发明涉及含有鼠神经生长因子的重组载体及重组细胞，本发明还涉及所述重组细胞的制备方法、鼠神经生长因子的纯化方法以及所述重组载体或重组细胞用于制备鼠神经生长因子的用途。
【背景技术】
[0002]神经生长因子，简称NGF，是一种分泌性蛋白，属于神经营养因子家族，对维持神经元的存活，以及促进其生长具有重要作用。NGF最早在1952年由丽塔蒙特兰奇发现，最初是由蛇毒中分离而得，随后人们发现鼠颌下腺中富含NGF，且比活性很高，从鼠颌下腺中提取NGF工艺相对简便，所以很长一段时期，人们将对NGF的研究集中在鼠颌下腺提取的NGF上。
[0003]在鼠颌下腺中，NGF以7SNGF的形式存在，7SNGF有两个阿尔法亚基，两个伽马亚基和两个beta亚基组成的多聚体，在该多聚体中，beta亚基具备能够有效结合NGF受体，且具备完全的NGF活性，由此beta亚基又被称为鼠神经生长因子，简称mNGF。mNGF链内形成3对beta折叠，链内形成3对二硫键，由于这三对二硫键的形成，进行正确复性是比较困难的，另外在mNGF的前体链内有3个N糖基化位点，其中2个位于前肽部分，I个位于成熟肽部分，前肽的N糖基化有助于mNGF的折叠和分泌。
[0004]鼠颌下腺提取的NGF，能够有效治疗外周神经损伤，持续性角膜缺损、角膜溃疡、干燥性角膜结膜炎、白内障术后愈合、青光眼等，并成功治愈鼻咽癌放疗引起的放射性颞叶坏死。针对正己烷中毒引起的神经损伤以及视神经损伤，mNGF功效显著，目前已经有上市产品-注射用神经生长因子。
[0005]由于市售mNGF都是鼠颌下腺中提取，可能存在动物源性病毒的污染，因此已有研究应用大肠杆菌[1_4]、酵母[5]、昆虫细胞和哺乳动物细胞[11]表达系统对mNGF进行表达。但大肠杆菌表达出的mNGF容易出现错误折叠，导致生物学活性降低，而利用酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞表达NGF，也存在表达量低或活性偏低的问题。
[0006]因此，本领域亟需能够提高NGF表达量和/或维持NGF生物学活性的表达系统。
【发明内容】
[0007]本发明成功构建了鼠神经生长因子的真核表达载体，获得了能够稳定表达鼠神经生长因子的真核表达细胞，以及具有正确序列和较高活性的鼠神经生长因子，由此完成了本发明。
[0008]本发明 第一方面涉及重组载体，其含有鼠神经生长因子基因的核酸序列。
[0009]在本发明的实施方案中，所述载体为适合鼠神经生长因子表达的载体，优选为真核表达载体，例如为pcDNA3.1、pEGFP-Cl、pPIC9K ;在本发明的具体实施方案中，所述载体为 Freedom? pCHOl.0。
[0010]在本发明的实施方案中，将鼠神经生长因子基因的核酸序列插入载体的多克隆位点，即得到重组载体。
[0011]在本发明的具体实施方案中，所述重组载体为pXL-mNGF。
[0012]在本发明中的实施方案中，所述鼠神经生长因子基因的核酸序列为SEQ ID N0:3或SEQ ID NO:5所示的序列。其氨基酸序列分别对应于SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示的序列。
[0013]在本发明的具体实施方案中，所述鼠神经生长因子基因的核酸序列为SEQ ID NO:3所示的序列。
[0014]本发明第二方面涉及重组细胞，其含有本发明第一方面任一项的重组载体。
[0015]在本发明的实施方案中，所述细胞为适合鼠神经生长因子表达的细胞，优选为真核细胞，例如为CHO细胞、293细胞、Hela细胞；在本发明的具体实施方案中，所述细胞为CHO细胞。
[0016]根据本发明第二方面任一项的重组细胞，所述重组细胞为经过无血清培养基驯化培养后的细胞。
[0017]在本发明的实施方案中，所述无血清培养基为⑶Forti? CH0。
[0018]在本发明的实施方案中，所述重组细胞是在无血清培养基中培养的。
[0019]在本发明的实施方案中，所述重组细胞的培养方式为悬浮培养。
[0020]根据本发明第二方面任一项的重组细胞，所述重组细胞为经过氨甲喋呤和嘌呤霉素加压筛选培养后的细胞。
[0021]根据本发明第二方面任一项的重组细胞，所述加压筛选为两个阶段的加压筛选。
[0022]在本发明的实施方案中，所述第一阶段为细胞培养的第21-29天，例如为第25天。
[0023]在本发明的实施方案中，所述第二阶段为第一阶段细胞培养后的18-25天，例如为21天。
[0024]在本发明的实施方案中，所述第一阶段筛选中氨甲喋呤的浓度为100~200nM ;第二阶段筛选中氨甲喋呤的浓度为500~1000nM ；
[0025]在本发明的实施方案中，所述第一阶段筛选中嘌呤霉素的浓度为10~20y g/mL ；第二阶段筛选中嘌呤霉素的浓度为30~50 ii g/mL。
[0026]在本发明的实施方案中，细胞的基础培养基为含有8mM谷氨酰胺的无血清培养基。
[0027]在本发明的实施方案中，加压筛选时的培养基是在基础培养基中加入氨甲喋呤和嘌呤霉素后得到的选择培养基。
[0028]根据本发明第二方面任一项的重组细胞，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏编号为CGMCC N0.8305。
[0029]本发明第三方面涉及鼠神经生长因子，其由本发明第一方面任一项的重组载体或第二方面任一项的重组细胞制备得到。
[0030]本发明第四方面涉及本发明第一方面任一项的重组载体或第二方面任一项的重组细胞用于制备或生产鼠神经生长因子的用途。
[0031]本发明第五方面涉及本发明第二方面任一项的重组细胞的制备方法，其包括以下步骤:
[0032](I)将本发明第一方面任一项的重组载体转染入CHO细胞中，在含有无血清培养基的细胞培养瓶中静止培养10~14天(例如12天)，所述无血清培养基中氨甲喋呤的浓度为100~200nM，嘌呤霉素的浓度为10~20 μ g/mL ；
[0033](2)将步骤(1)培养获得的细胞转移至摇瓶中摇动培养11~15天(例如第13天)，每3~4天传一代，培养基与步骤(1)相同；
[0034](3)适当增加细胞密度，继续在含有无血清培养基的摇瓶中摇动培养18~25天，每3~4天传一代，所述无血清培养基中氨甲喋呤的浓度为500~ΙΟΟΟηΜ，嘌呤霉素的浓度为30~50 μ g/mL,即获得本发明第二方面任一项的重组细胞；
[0035](4)任选地，还包括对所获得的细胞进行单克隆筛选、以获得更高表达量的细胞株的过程。
[0036]在本发明的实施方案中，所述无血清培养基为⑶Forti? CHO培养基。
[0037]在本发明的实施方案中，步骤(1)中接种细胞的密度为IXlO5~9X105/ml，例如为 3X105 ~8X105/ml，例如为 5X105/ml。
[0038]在本发明的实施方案中，步骤(2)中接种细胞的密度为lX105~6X105/mlj^B为 3 X105/ml ο
[0039]在本发明的实施方案中，步骤(3)中接种细胞的密度为2X IO5~7X105/ml，例如为 4 X105/ml ο
[0040]在本发明的实施方案中，所述单克隆筛选的方法为本领域所公知，例如可采用有限稀释法筛选单克隆细 胞。
[0041]在本发明的实施方案中，所述细胞培养的条件为37°C，5%~8%C02。
[0042]在本发明的实施方案中，当在摇床上培养细胞时，摇床的转速为100_150rpm，例如为 120rpm。
[0043]本发明还涉及鼠神经生长因子的制备方法，其包括本发明第五方面任一项的制备方法，以及培养重组细胞和收获细胞培养上清的步骤。
[0044]本发明还涉及鼠神经生长因子的纯化方法，其包括以下步骤:
[0045]I)培养表达鼠神经生长因子的重组细胞，收获细胞培养上清；
[0046]2)将细胞培养上清用离子交换层析进行纯化，得到纯化后的样品；
[0047]3)将步骤2)获得的样品用分子筛层析进行纯化，得到纯化的鼠神经生长因子。
[0048]在本发明的实施方案中，所述表达鼠神经生长因子的重组细胞为本发明第二方面任一项的重组细胞；
[0049]在本发明的具体实施方案中，所述重组细胞是按照本发明第五方面任一项所述的制备方法制备得到的。
[0050]在本发明的实施方案中，所述离子交换层析中的填料为阳离子交换填料；在本发明的具体实施方案中，所述离子交换填料为琼脂糖凝胶，例如为SP Sepharose Fast Flow。
[0051]在本发明的实施方案中，所述分子筛层析中的填料为葡聚糖和琼脂糖的混合物，例如为Superdex,例如为Superdex75 ;在本发明的具体实施方案中，所述分子筛填料为superdex75pre grade0
[0052]发明的有益效果
[0053]本发明成功构建了鼠神经生长因子的真核表达载体，通过加压筛选获得了稳定表达鼠神经生长因子的真核细胞株，并进一步获得了纯化的鼠神经生长因子。该鼠神经生长因子序列正确、表达量高、活性好，能够在无血清培养基中悬浮培养，为鼠神经生长因子的大规模制备奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0054]图1为pXL-mNGF表达质粒示意图
[0055]图2为电泳结果图，其中左图为PCR产物电泳结果，IaneM:marker DL2000 ；lanel, lane2:PCR产物；右图为EcoRV、PacI双酶切pXL-mNGF产物电泳结果，Lane M:Marker DL15000 ；Lane 1:EcoRV、PacI 双酶切产物；Lane2:未经酶切的表达质粒 pXL-mNGF。
[0056]图3为pEGFP-Nl质粒转染细胞(转染阳性对照组)图。
[0057]图4为瞬时转染48h表达上清Western Blot结果，其中I为瞬时转染pXL_mNGF的细胞48小时表达上清；2为阳性对照:鼠颌下腺提取NGF ；3为瞬时转染空载体的细胞48小时表达上清。
[0058]图5为第二次ELISA实验标准曲线。
[0059]图6为鸡胚背根神经节活性测定。
[0060]图7为第一阶段筛选活细胞比例随筛选时间的变化趋势图。
[0061]图8为蛋白产率评估结果。
[0062]图9为Western Blot鉴定结果，其中I为未转染的CHO细胞培养上清；2为稳定转染的细胞表达上清；3为阳性对照(鼠颌下腺提取的NGF)。
[0063]图10为克隆扩大培养流程图。
[0064]图11为显微镜下单细胞照片，其中左图为96孔板中其中一孔单细胞，右图为96孔板中一单细胞培养12天。
[0065]图12为离子交换层析图。
[0066]图13为4~12%SDS_PAGE电泳图，其中M =Marker, S1:离子交换上样前的样品
[0067]图14为离子交换层析产物经4~12%SDS_PAGE还原电泳图谱，字母t后面的数字
表示收集管编号(按照收集顺序编号):
[0068]
【权利要求】
1.重组载体，其含有鼠神经生长因子基因的核酸序列；优选的，所述载体为Freedom?pCHOl.0 ;进一步优选的，所述重组载体为pXL-mNGF。
2.重组细胞，其含有权利要求1的重组载体；优选的，所述细胞为CHO细胞。
3.权利要求2的重组细胞，其为经过无血清培养基驯化培养后的细胞，优选地，所述无血清培养基为⑶Forti? CHO。
4.权利要求2的重组细胞，其为经过氨甲喋呤和嘌呤霉素加压筛选培养后的细胞。
5.权利要求4的重组细胞，所述加压筛选为两个阶段的加压筛选， 优选地，所述第一阶段筛选中氨甲喋呤的浓度为100~200nM ;第二阶段筛选中氨甲喋呤的浓度为500~1000nM ； 优选地，所述第一阶段筛选中嘌呤霉素的浓度为10~20μ g/mL ;第二阶段筛选中嘌呤霉素的浓度为30~50 μ g/mL。
6.权利要求2-5任一项的重组细胞，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏编号为CGMCC N0.8305。
7.鼠神经生长因子，其由权利要求1的重组载体或权利要求2-6任一项的重组细胞制备得到。
8.权利要求1的重组载体或权利要求2-6任一项的重组细胞用于制备或生产鼠神经生长因子的用途。
9.权利要求2-6任一项的重组细胞的制备方法，其包括以下步骤: (1)将权利要求1的重组载体转染入CHO细胞中，在含有无血清培养基的细胞培养瓶中静止培养10~14天(例如12天)，所述无血清培养基中氨甲喋呤的浓度为100~200nM，嘌呤霉素的浓度为10~20 μ g/mL ； (2)将步骤(1)培养获得的细胞转移至摇瓶中摇动培养11~15天(例如第13天)，每3~4天传一代，培养基与步骤(1)相同； (3)适当增加细胞密度，继续在含有无血清培养基的摇瓶中摇动培养18~25天，每3~4天传一代，所述无血清培养基中氨甲喋呤的浓度为500~ΙΟΟΟηΜ，嘌呤霉素的浓度为30~50 μ g/mL,即获得权利要求2-6任一项的重组细胞； (4)任选地，还包括对所获得的细胞进行单克隆筛选、以获得更高表达量的细胞株的过程。
10.鼠神经生长因子的制备方法，其包括权利要求9的制备方法，以及培养重组细胞和收获细胞培养上清的步骤。
11.鼠神经生长因子的纯化方法，其包括以下步骤: 1)培养表达鼠神经生长因子的重组细胞，收获细胞培养上清； 2)将细胞培养上清用离子交换层析进行纯化，得到纯化后的样品； 3)将步骤2)获得的样品用分子筛层析进行纯化，得到纯化的鼠神经生长因子； 优选地，所述表达鼠神经生长因子的重组细胞为权利要求2-6任一项的重组细胞；进一步优选地，所述重组细胞是按照权利要求9所述的制备方法制备得到的。
【文档编号】C07K1/18GK103740754SQ201310544508
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年10月25日 优先权日:2013年10月25日
【发明者】饶春明, 徐莉, 李永红, 韩春梅, 史新昌, 陶磊 申请人:中国食品药品检定研究院