一种利那洛肽的制备方法
【专利摘要】本发明属于药物合成【技术领域】，公开了一种采用完全选择性形成三对二硫键合成利那洛肽的方法。使用本发明的工艺，可以在同一个溶液体系中，依次完成利那洛肽中三对二硫键的形成，因此该工艺的操作方法相当简单，同时也大大提高利那洛肽最终精肽的收率，并且可以实现大规模生产。
【专利说明】一种利那洛肽的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物合成【技术领域】，具体涉及一种利那洛肽的制备方法。
【背景技术】
[0002]利那洛肽,英文名称为Linaclotide ;商品名称为Linzess ;中文通用名称为利那洛肽。其为一种GC-C (肠上皮细胞尿苷酸环化酶C)受体激动剂，2012年8月美国FDA批准用于治疗成人慢性特发性便秘和便秘型肠易激综合症(IBS-C)。该药物由Iixrnwood制药公司开发，化合物结构为14个氨基酸组成的含有三对二硫键的多肽(三对二硫键分别为:1-6 ；2-10和5-13)，可以通过细胞表达和化学合成制得，具体肽序如下式所示:
[0003]
【权利要求】
1.一种利那洛肽的制备方法，包括如下步骤: 1)Fmoc-Tyr (tBu)-树脂的制备:Fmoc-Tyr (tBu)-OH和载体树脂反应，获得Fmoc-Tyr (tBu)-树脂； 2)利那洛肽肽树脂的制备=Fmoc-Tyr(tBu)-树脂采用逐一偶联的方式偶联Fmoc保护基团的其他氨基酸，获得利那洛肽肽树脂，其中1-6位的Cys侧链采用Hqm保护，2_10位的Cys侧链采用Trt保护,5_13位的Cys侧链采用Acm保护； 3)利那洛肽线性肽粗肽的制备:利那洛肽肽树脂经裂解反应，获得带有Acm保护基团及Hqm保护基团的线性肽粗肽； 4)利那洛肽2-10位第一对二硫键的形成:氧气氧化得到2-10位成环的第一对二硫键； 5)利那洛肽Hqm保护基团的脱除及1-6位第二对二硫键的形成:加入水合肼，脱除Hqm保护基团的同时形成第二对二硫键； 6)利那洛肽5-13位第三对二硫键的形成:加入碘和醋酸，形成第三对二硫键； 7)纯化和冻干后获得利那洛肽精肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤I)中的载体树脂为WangResin,优选WangResin的替代度为0.2~1.2mmol/g,更优选为0.3~1.0mmol/g,最优选为0.6~0.8mmol/g°
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所用的具有Fmoc保护基团的氨基酸分别为 Fmoc-Tyr (tBu)-OH、Fmoc-Cys (Acm)-OH、Fmoc-Cys (Trt) -0H> Fmoc-Cys (Hqm) -OH>Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr (tBu) -0H> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asn (Trt) -OH 和Fmoc-Glu(OtBu)-OH。
4.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中步骤I)中的偶联体系为HOBt/DIC/DMAP, HOBt/DCC/DMAP, HOAt/DIC/DMAP, HBTU/HOBt/DIPEA, TBTU/HOBt/DIPEA, PyBOP/HOBt/DIPEA，优选为 HOBt/DIC/DMAP 或 HBTU/HOBt/DIPEA。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤2)中逐一偶联的方式采用的偶联试剂为 DIC+A 或 B+A+C，其中 A 为 HOBt 或 HOAt ；B 为 HBTU、HATU、TBTU 或 PyBOP，C 为 DIPEA或 TMP，优选为 HOBt+DIC 或 HOBt+HBTU+DIPEA。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤3)中的裂解试剂为三氟乙酸TFA、三异丙基硅烷TIS、1，2-乙二硫醇EDT、苯酚PhOH和水组成的混合试剂，混合试剂中各组分的体积比优选为TFA: TIS: EDT: PhOH: H20=85_95:2-5:0-3:0-2:1-5，更加优选为TFA: TIS:EDT:PhOH:H20=90:3:2:1:4 或 TFA:EDT:H20=90:5: 5，裂解时间优选为 1.5-3.5 小时。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤4)中2-10位形成第一对二硫键采用的是带Acm和Hqm保护基团肽的水溶液，溶液的浓度为0.l_2mg肽/ml，优选浓度为0.1-1mg肽/ml，用氨水调节pH为7.0，往其中通入氧气进行氧化，氧化时间为4小时。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤5)中选择性脱除Hqm保护基团同时形成1-6位第二对二硫键采用的是往上述水溶液中加入5%的水合肼，用醋酸和氨水调节pH=8.5，空气下氧化反应，反应时间为5-44小时，优选为10-24小时。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤6)中5-13位形成第三对二硫键采用的是往上述水溶液加入相当于肽的5-40倍当量的碘，优选10-30倍当量，然后加入水溶液体积20%的醋酸，氧化时间为0.2-1小时，优选为0.2-0.5小时。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤7)所述的纯化为反相高效液相色谱纯化。`
【文档编号】C07K7/08GK103626849SQ201310617050
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年11月27日 优先权日:2013年11月27日
【发明者】戴政清, 刘剑, 马亚平, 袁建成 申请人:深圳翰宇药业股份有限公司