一种聚合血红蛋白的超滤方法
【专利摘要】本发明涉及的是用于聚合血红蛋白的超滤方法，其特征在于在0～4℃及通氮等条件下，本发明的技术方案：一种聚合血红蛋白超滤方法，其特征在于它包括以下步骤：在超滤试验装置中，使溶液在泵送条件下正压循环，调节蠕动泵的速度与调节阀来控制进口压力为0.1MPa，回流压力0.02MPa，料液pH7.0～8.0，温度4℃，并在储液罐里不断补充磷酸盐缓冲液，从而达到分离去掉溶液中小分子的目的。先对纯化血红蛋白进行聚合，所用双功能试剂为戊二醛，再选用规格为为100kD截留分子量超滤膜堆对浓度为0.5％聚合血红蛋白溶液进行超滤，超滤缓冲液倍数是原始体积的8～10倍。
【专利说明】一种聚合血红蛋白的超滤方法
(-)【技术领域】:
[0001]本发明涉及生物医药领域，特别是一种聚合血红蛋白超滤方法。
(二)【背景技术】:
[0002]以输入全血为主要手段的传统输血方式在医疗救护方面发挥了极为重要的作用，但同时其自身也存在难以克服的各种缺点，主要表现在:输入前需进行交叉配型、存在多种病毒交叉感染的危险、血源紧张、贮存期较短且需要特殊的设施。为了解决上述矛盾，人们早在19世纪末就开始了有关红细胞代用品的研究。红细胞代用品是指具有扩充血容积、维持血管内外渗透压平衡并且有载氧功能，用以代替人红细胞的各种氧载体的总称。血液代用品的研制经历了从最初无载氧功能的血管扩容剂，如:高渗盐溶液、羟乙基淀粉溶液、明胶等到目前具有携氧功能的各种载体溶液。目前正在研制的以血红蛋白为基础各类产品与全血比较具有诸多优点，如:来源广泛、安全洁净、可长期保存、输入人体前无需进行交叉配型，特别适用于战争、自然灾害、以及其他突发事件中大量出血病人的急救。血红蛋白是人体内的物质，它的溶液作为红细胞代用品比化学合成物质更具优越性。
[0003]目前已有5家以血红蛋白为基础的产品完成或接近完成了III期临床研究，取得了明显的进展。然而，这些产品应用于临床时都程度不同地出现了诸如血管收缩、血压升高，心脏、肾脏、肝脏等器官受损等毒副作用。虽然引起这类毒副作用的主要原因还需要进一步研究，但现在可以确定的是:一方面这些以血红蛋白为基础的血液代用品(HBOCs)以小分子的形式进入血管壁内皮细胞能结合细胞内的舒张因子一氧化氮，从而诱导系统血管收缩进而造成血压升高；另一方面，由于小分子的粒径小于肾小球的滤过作用的阈值，经肾脏排出体外，引起血红 蛋白尿，严重的还会造成肾功能损伤或衰竭。因此，对这些HBOCs中小分子要尽量的去除，目前降低HBOCs中小分子含量的技术主要是柱层析和超滤，但前者主要存在的问题是操作周期长、成本高、产品得率低、难以适应规模化生产需要，后者则不仅操作周期短、操作简单且在操作的过程中不会对血红蛋白的生物活性、二级结构等造成损伤。
[0004]目前已有比较多的超滤技术应用于蛋白质分子量分级分离的研究报道，如平板式膜应用于分离免疫球蛋白，在细胞色素丙的纯化过程中使用超滤技术，应用萃取-超滤两步法从过期人血中提纯人血白蛋白，以及应用超滤技术分离血浆蛋白等。但超滤法用于HBOCs制品分子量的分级鲜见系统报道。超滤的原理是通过筛孔分离，主要利用压力差为推动力使溶液中的大分子截留，溶液中溶剂和小分子从高压侧透过到低压侧的分离过程。溶质或悬浮物料按大小不同而分离，比膜孔小的物质和溶剂一起透过膜，而较大的物质则被截留。以戊二醛为交联剂的PolyPHb是一种分子量连续分布且分布较宽的物质，采用本专利工艺使得制品分子量的分布较窄，且达到去除小分子的效果。
(三)
【发明内容】
:
[0005]本发明的目的在于提供一种聚合血红蛋白超滤方法，它针对上述情况，发明一种操作简便、成本低廉、高效的超滤工艺。
[0006]本发明的技术方案:一种聚合血红蛋白超滤方法，其特征在于它包括以下步骤:
(I)在超滤试验装置中，使溶液在泵送条件下正压循环，调节蠕动泵的速度与调节阀来控制进口压力为0.1MPa，回流压力0.02MP，料液PH7.0~8.0，温度4°C (由于PolyPHb温度高会造成高铁血红蛋白产生及变性)，并在储液罐里不断补充磷酸盐缓冲液，从而达到分离去掉溶液中小分子的目的。
[0007]上述步骤(1)中制备所用的原料天然红细胞来源为人胎盘血或过期的库存人血。
[0008]上述步骤(1)中先对纯化血红蛋白进行聚合，所用双功能试剂为戊二醛。
[0009]上述步骤(1)中对聚合后血红蛋白进行超滤，所用超滤膜堆规格为为IOOkD截留
分子量。
[0010]上述步骤(1)中超滤聚合血红蛋白浓度为0.5%。
[0011]上述步骤(1)中超滤缓冲液倍数是原始体积的8~10倍
[0012]本发明的工作原理为:筛孔分离，主要利用压力差为推动力使溶液中的大分子截留，溶液中溶剂和小分子从高压侧透过到低压侧的分离过程。溶质或悬浮物料按大小不同而分离，比膜孔小的物质和溶剂一起透过膜，而较大的物质则被截留。以戊二醛为交联剂的PolyPHb是一种分子量连续分布且分布较宽的物质，采用本专利工艺使得制品分子量的分布较窄，且达到去除小分子的效果。
[0013]本发明的技术效果在于:在优选合`适超工艺上做了大量研究，结果表明，以结构、理化性质稳定、截留分子量合适、超滤效果最好为原则，确定超滤膜的规格为IOOkD截留分子量膜堆、PolyPHb浓度为0.5%、超滤倍数8~10倍为最适组和。
(四)【具体实施方式】:
[0014]以下将通过【具体实施方式】的形式再对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅局限于以下的【具体实施方式】，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0015]实施例1超滤实验
[0016]在超滤试验装置中，使溶液在泵送条件下正压循环，调节蠕动泵的速度与调节阀来控制进口压力为0.1MPa,回流压力0.02MP，料液ρΗ7.3~7.4，温度4°C，并在储液罐里不断补充磷酸盐缓冲液，使之达到分离浓缩目的。
[0017]实施例2超滤膜的选择与实验前清洗
[0018]I)选用的膜堆面积均为0.lm2，截留分子量为IOOkD与300kD2种规格，超滤液经
0.22 um膜过滤后使用，PolyPHb浓度为0.5 %，容量为200mL，边超滤边加入PBS液保持200mL体积，直至超滤10倍(超滤2L)后停止，取样以HPLC检测PolyPHb分子量分布。
[0019]2)先将调节阀门打开，用蒸馏水洗涤残留液体后，再将加热到50°C的0.5mol / LNaOH溶液采取连续体积洗滤方式循环>1L，再逐次用50°C蒸馏水和4°C磷酸盐缓冲液充分洗涤至中性待用；使用后的超滤膜经同样步骤清洗，最后打入0.1mol / L NaOH溶液浸泡放置。
[0020]实施例3PolyPHb浓度的选择
[0021]超滤前，将0.22 μ m膜过滤的PBS液，以PolyPHb将其浓度分别稀释成0.5%、I %，1.5%，均为200mL ;在相同条件下用IOOkD膜堆超滤，边超滤边加入PBS保持200mL体积，
0.5%、1%、1.5%各超滤20倍(4L)后停止，取样HPLC检测PolyPHb分子量分布。
[0022]实施例4超滤倍数的选择
[0023]超滤前，经0.22μπι膜过滤的PBS液，PolyPHb浓度为0.5%、容量为200mL，用IOOkD膜堆超滤，边超滤边加入PBS保持200mL体积，分别等体积超滤8倍、10倍、12倍，取样HPLC检测PolyPHb分子量分布`。
【权利要求】
1.一种聚合血红蛋白的超滤方法，其特征在于它包括以下步骤:(1)在超滤试验装置中，使溶液在泵送条件下正压循环，调节蠕动泵的速度与调节阀来控制进口压力为0.1MPa,回流压力0.02MP，料液pH7.0~8.0，温度4°C，并在储液罐里不断补充磷酸盐缓冲液，从而达到分离去掉溶液中小分子的目的。
2.根据权利要 求1所述的一种聚合血红蛋白超滤方法，所超滤聚合血红蛋白浓度为0.5%。
3.根据权利要求1所述的一种聚合血红蛋白超滤方法，超滤缓冲液倍数是原始体积的8~10倍。
【文档编号】C07K1/34GK103694344SQ201310703254
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月13日 优先权日:2013年12月13日
【发明者】李凤娟, 李燊, 冯杰 申请人:天津工业大学