一种ghk三肽的合成方法
【专利摘要】本发明公开了一种GHK三肽的合成方法，采用常规液相合成法，先用乙酸对硝基苯酯对赖氨酸进行保护，然后将Boc-Gly-OH与组氨酸反应得到的二肽用二碳酸二叔丁酯进行保护，最后将保护的二肽与保护的赖氨酸反应，得到GHK三肽。本发明用乙酸对硝基苯酯对赖氨酸进行保护，该保护基可选择性的酰化离羧酸官能团较远的氨基，与现有保护方法相比较，操作步骤简单，降低了生产成本，用二碳酸二叔丁酯对二肽进行保护，减少了其他副产物的生成，增加了化合物的亲酯性，有助于产物的分离纯化，提高了产物的收率，同时还可以减少消旋产物的生成。
【专利说明】—种GHK三肽的合成方法
【技术领域】
[0001]本发明属于化妆品【技术领域】，具体涉及一种通过液相手段合成GHK三肽的方法。【背景技术】
[0002]GHK三肽是一种含有三个氨基酸的活性多肽，氨基酸序列为H-Gly-His-Lys-OH，GHK-Cu在医学上最早用于促进伤口愈合及增进肌肤弹性，近来部分研究认为能改善细纹，PAL-GHK有丰唇之功效，使用在唇膏的生产上，使用后使嘴唇看起来丰润柔亮，拥有独特的唇景，也是安全的丰胸产品的必备原料。
[0003]目前，GHK的合成方法主要采用经典固相合成。固相合成即将保护氨基酸由C端向N端逐个延伸，通过缩合、脱除保护、再缩合、切割树脂、离心、冻干和高效液相制备得到纯度高于90%的GHK产品。该方法中所需要的树脂市场价格较为昂贵，且其交换活度小，并且在合成中所使用缩合剂和碱都明显过量，造成了 GHK原料成本的增高，因此，降低GHK生产成本的工艺方法研究具有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题在于克服现有GHK三肽制备方法存在的缺点，提供一种操作简单、成本低、产物易分离纯化的GHK三肽的合成方法
[0005]解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成:
[0006]1、合成 H-Lys (Ac) -OH
[0007]将赖氨酸完全溶解于蒸馏水中，室温搅拌，用质量分数为10%的氢氧化钠水溶液调节PH值至10~11，加入乙酸对硝基苯酯与1，4-二氧六环或四氢呋喃的质量-体积比为Ig:5~IOmL比为1:2~5的混合液,赖氨酸与乙酸对硝基苯酯的摩尔比为1:1.0~2,室温搅拌反应2~5小时，分离纯化产物，得到H-Lys (Ac) -0H。
[0008]2、合成 Boc-Gly-COOSu
[0009]将Boc-Gly-OH与1，4_ 二氧六环或四氢呋喃按质量-体积比为Ig:8~IOmL混合，室温搅拌，加入N-羟基丁二酰亚胺，搅拌至溶解，滴加N，N’ - 二环己基碳二亚胺与1，4- 二氧六环或四氢呋喃的质量-体积比为lg:2~5mL的混合溶液，Boc-Gly-OH与N-羟基丁二酰亚胺、N，N’ - 二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1~1.5:1~2，室温反应2~3小时，减压过滤除去固体不溶物，得到Boc-Gly-COOSu的1，4- 二氧六环或四氢呋喃溶液。
[0010]3、合成 Boc-Gly-His (Boc)-OH
[0011]将组氨酸和碳酸氢钠完全溶解于蒸馏水中，所得溶液滴加到步骤2得到的Boc-Gly-COOSu的1，4- 二氧六环或四氢呋喃溶液中，室温搅拌反应12~24小时；滴加二碳酸二叔丁酯与1，4-二氧六环或四氢呋喃的质量-体积比为lg:3~IOmL的混合液，加入氢氧化钠，Boc-Gly-OH与组氨酸、碳酸氢钠、二碳酸二叔丁酯、氢氧化钠的摩尔比为1:1.0~2:1.0~2:1.0~2:1.5~4，室温反应3~5小时，分离纯化产物，得到Boc-Gly-His(Boc)-0H。[0012]4、合成 Boc-Gly-Hi s (Boc) -COOSu
[0013]将Boc-Gly-His (Boc) -OH与1，4_ 二氧六环或四氢呋喃按质量-体积比为Ig:8~IOmL混合，室温搅拌，加入N-羟基丁二酰亚胺，搅拌至溶解，滴加N，N’ - 二环己基碳二亚胺与1，4-二氧六环或四氢呋喃的质量-体积比为lg:2~5mL的混合溶液，Boc-Gly-His (Boc) -OH与N-羟基丁二酰亚胺、N, N’ - 二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1~
1.5:1~2，室温反应2~3小时，减压过滤除去固体不溶物，得到Boc-Gly-His (Boc)-COOSu的1，4- 二氧六环或四氢呋喃溶液。
[0014]5、合成 Boc-Gly-His (Boc) -Lys (Ac) -OH
[0015]将H-Lys (Ac) -OH和碳酸氢钠完全溶解于蒸馏水中，所得溶液滴加到步骤4得到的Boc-Gly-His (Boc) -COOSu的1，4-二氧六环或四氢呋喃溶液中,H-Lys (Ac)-OH与碳酸氢钠、Boc-Gly-His(Boc)-OH的摩尔比为1.1~1.5:1.1~1.5:1，室温搅拌反应18~20小时，分离纯化产物，得到 Boc-Gly-His (Boc) -Lys (Ac) -0H。
[0016]6、合成GHK三肽
[0017]将Boc-Gly-His(Boc)-Lys(Ac)-OH加入三氟乙酸与蒸馏水的体积比为1:1的混合液中，B0c-Gly-His(B0c)-Lys(Ac)-OH与混合液的质量-体积比为lg:8~10mL，室温搅拌反应2~3小时，用乙酸乙酯萃取，水相减压浓缩至干，得到GHK三肽。
[0018]本发明的合成H-Lys (Ac)-OH步骤I的优选条件为:将赖氨酸完全溶解于蒸馏水中，室温搅拌，用质量分数为10%的氢氧化钠水溶液调节pH值至10~11，加入乙酸对硝基苯酯与1，4-二氧六环或四氢呋喃的体积比为1:3的混合液，赖氨酸与乙酸对硝基苯酯的摩尔比为1: 1.0~1.3，室温搅拌反应3~4小时，分离纯化产物，得到H-Lys (Ac) -0H。
[0019]本发明的合成Boc-Gly-His (Boc) -OH步骤3的优选条件为:将组氨酸和碳酸氢钠完全溶解于蒸馏水中，所得溶液滴加到步骤2得到的Boc-Gly-COOSu的1，4- 二氧六环或四氢呋喃溶液中，室温搅拌反应18~20小时；滴加二碳酸二叔丁酯与1，4- 二氧六环或四氢呋喃的质量-体积比为Ig:5~SmL的混合液，加入氢氧化钠，Boc-Gly-OH与组氨酸、碳酸氢钠、二碳酸二叔丁酯、氢氧化钠的摩尔比为1:1.1~1.5:1.1~1.5:1.3~1.5:2~3，室温反应3~5小时，分离纯化产物，得到Boc-Gly-His (Boc)-0H。
[0020]本发明采用乙酸对硝基苯酯对赖氨酸进行保护，该保护基可选择性的酰化离羧酸官能团较远的氨基，与现有保护方法相比较，操作步骤明显简单，也可以降低生产成本。同时，采用二碳酸二叔丁酯对二肽进行保护，可以增加化合物的亲酯性，有助于产物的分离纯化，还可以减少消旋产物的生成。
【专利附图】
【附图说明】
[0021 ] 图1是实施例1合成的GHK三肽的质谱图。
[0022]图2是实施例1合成的GHK三肽的液相色谱图。
【具体实施方式】
[0023]下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。
[0024]实施例1
[0025]1、合成 H-Lys (Ac) -OH[0026]将IOg (0.07mol)赖氨酸与40mL蒸馏水加入反应瓶中，室温搅拌，用质量分数为10%的氢氧化钠水溶液调节pH值至10，缓慢加入15.2g (0.08mol)乙酸对硝基苯酯(由上海谱振生物科技有限公司提供)与80mLl，4- 二氧六环的混合液，室温搅拌反应4小时，过滤，减压浓缩滤液，用乙酸乙酯萃取，水相用质量分数为10%的柠檬酸水溶液调节pH值至3，用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥后减压过滤，滤液减压浓缩至干，得到H-Lys (Ac) -0H,收率为 96%。
[0027]2、合成 Boc-Gly-COOSu
[0028]将10g(0.057mol)Boc-Gly-0H与IOOmLl, 4_二氧六环加入反应瓶中，室温搅拌，加入7.2g (0.063mol)N-羟基丁二酰亚胺，搅拌至溶解，缓慢滴加12.9g (0.063mol)N，N’- 二环己基碳二亚胺与50mLl，4- 二氧六环的混合溶液，室温反应3小时，减压过滤除去固体不溶物，得到Boc-Gly-COOSu的1，4- 二氧六环溶液。
[0029]3、合成 Boc-Gly-His (Boc)-OH
[0030]将10.6g (0.068mol)组氨酸和5.7g (0.068mol)碳酸氢钠溶解于30mL蒸懼水中，所得溶液滴加到步骤2得到的Boc-Gly-COOSu的1，4- 二氧六环溶液中，室温搅拌反应20小时，然后滴加14.8g (0.068mol)二碳酸二叔丁酯与50mLl, 4-二氧六环的混合液,再加入
4.6g(0.114mol)氢氧化钠，室温反应5小时，过滤，减压浓缩滤液，用乙酸乙酯萃取，水相用质量分数为10%的柠檬酸水溶液调节pH值至3，用乙酸乙酯萃取，有机相依次经水洗、饱和食盐水洗、无水硫酸钠干燥、减压过滤、减压浓缩，得到Boc-Gly-His (Boc) -0H,收率为90%。
[0031]4、合成 Boc-Gly-His (Boc) -COOSu
[0032]将IOg (0.057mol) Boc-Gly-His(Boc)-OH 与 IOOmLl, 4_ 二氧六环加入反应瓶中，室温搅拌，然后加入7.Sg (0.068mol) N-羟基丁二酰亚胺，搅拌至溶解，再缓慢滴加14g(0.068mol) N, N’ - 二环己基碳二亚胺与30mLl, 4- 二氧六环的混合溶液,室温反应3小时，减压过滤除去固体不溶物，得到Boc-Gly-His(Boc)-COOSu的1，4- 二氧六环溶液。
[0033]5、合成 Boc-Gly-His (Boc) -Lys (Ac) -OH
[0034]将12.8g (0.068mol)H-Lys(Ac)-0H 和 5.7g (0.068mol)碳酸氢钠溶解于 50mL蒸馏水中，所得溶液滴加到步骤4得到的B0c-Gly-His(B0c)-COOSu的1，4- 二氧六环溶液中，室温搅拌反应20小时，用质量分数为10%的柠檬酸水溶液调节pH值至3，用乙酸乙酯萃取，有机相依次经水洗、饱和食盐水洗、无水硫酸钠干燥、减压过滤、减压浓缩，得到Boc-Gly-His (Boc) -Lys (Ac) -0H,收率为 90%。
[0035]6、合成 H-Gly-His-Lys-OH
[0036]将IOg Boc-Gly-His (Boc)-Lys (Ac)-OH加入IOOmL三氟乙酸与蒸懼水的体积比为
I: I的混合液中，室温搅拌反应3小时，用乙酸乙酯萃取，水相减压浓缩至干，用反向高效液相色谱(填料为F型粒径为30~50 μ m的SBC MCI GEI反相色谱填料，由成都科谱生物有限公司提供，流动相A是用质量分数为28%的氨水溶液调节pH值至8.5的超纯水，流动相B是用质量分数为28%的氨水溶液调节pH值至8.5的甲醇，流动相梯度选择为O~40分钟，A:B由83:17到73:27)进行分离纯化，得到GHK三肽，收率为90%。 [0037]发明人采用质谱仪对得到的产物进行结构表征，结果见图1。由图1可见，所得产物的分子量及分子离子峰与GHK三肽分子量以及分子离子峰一致，说明制备产物为GHK三肽。采用液相色谱仪对得到的产物的纯度进行测定，液相色谱图见图2。由图2可见，所制备的GHK三肽的纯度大于90%。
[0038]实施例2
[0039]本实施例的合成H-Lys (Ac)-OH步骤I中，将IOg (0.07mol)赖氨酸与40mL蒸馏水加入反应瓶中，室温搅拌，用质量分数为10%的氢氧化钠水溶液调节pH值至11，缓慢加入26.6g (0.0.14mol)乙酸对硝基苯酯(由上海谱振生物科技有限公司提供)与250mLl, 4-二氧六环的混合液，室温搅拌反应5小时，该步骤的其他步骤与实施例1相同，得到H-Lys (Ac) -0H。其他步骤与实施例1相同，得到GHK三肽。
[0040]实施例3
[0041]本实施例的合成Boc-Gly-His(Boc)-OH 步骤 3 中，将 17.8g (0.0.114mol)组氨酸和9.6g (0.114mol)碳酸氢钠溶解于30mL蒸馏水中，所得溶液滴加到步骤2得到的Boc-Gly-COOSu的1，4-二氧六环溶液中，室温搅拌反应20小时，然后滴加24.6g(0.114mol) 二碳酸二叔丁酯与200mLl，4- 二氧六环的混合液，再加入9.3g (0.228mol)氢氧化钠，室温反应3小时，该步骤的其他步骤与实施例1相同，得到Boc-Gly-His (Boc)-0H。其他步骤与实施例1相同，得到GHK三肽。
[0042]实施例4
[0043]在实施例1~3中，所用的1，4- 二氧六环用等体积的四氢呋喃替换，其他步骤与相应实施例相同，得到GH K三肽。
【权利要求】
1.一种GHK三肽的合成方法，其特征在于它由下述步骤组成:
(1)合成H-Lys (Ac) -OH 将赖氨酸完全溶解于蒸馏水中，室温搅拌，用质量分数为10%的氢氧化钠水溶液调节pH值至10~11，加入乙酸对硝基苯酯与1，4-二氧六环或四氢呋喃的质量-体积比为Ig: 5~IOmL的混合液,赖氨酸与乙酸对硝基苯酯的摩尔比为1:1~2,室温搅拌反应2~5小时，分离纯化产物，得到H-Lys (Ac) -OH ； (2)合成Boc-Gly-COOSu 将Boc-Gly-OH与1，4- 二氧六环或四氢呋喃按质量-体积比为Ig:8~IOmL混合，室温搅拌，加入N-羟基丁二酰亚胺，搅拌至溶解，滴加N，N’ - 二环己基碳二亚胺与1，4- 二氧六环或四氢呋喃的质量-体积比为lg:2~5mL的混合溶液，Boc-Gly-OH与N-羟基丁二酰亚胺、N，N’ - 二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1~1.5:1~2，室温反应2~3小时，减压过滤除去固体不溶物，得到Boc-Gly-COOSu的1，4- 二氧六环或四氢呋喃溶液； (3)合成Boc-Gly-His(Boc)-OH 将组氨酸和碳酸氢钠完全溶解于蒸馏水中，所得溶液滴加到步骤(2)得到的Boc-Gly-COOSu的1，4- 二氧六环或四氢呋喃溶液中，室温搅拌反应12~24小时；滴加二碳酸二叔丁酯与1，4- 二氧六环或四氢呋喃的质量-体积比为Ig: 3~IOmL的混合液，加入氢氧化钠，Boc-Gly-OH与组氨酸、碳酸氢钠、二碳酸二叔丁酯、氢氧化钠的摩尔比为1:1~2:1~2:1~2:1.5~4，室温反应3~5小时，分离纯化产物，得到Boc-Gly-His (Boc)-OH ；
(4)合成Boc-`Gly-His (Boc) -COOSu 将Boc-Gly-His (Boc)-OH与I，4_ 二氧六环或四氢呋喃按质量-体积比为lg:8~IOmL混合，室温搅拌，加入N-羟基丁二酰亚胺，搅拌至溶解，滴加N，N’-二环己基碳二亚胺与1，4-二氧六环或四氢呋喃的质量-体积比为lg:2~5mL的混合溶液，Boc-Gly-His (Boc) -OH与N-羟基丁二酰亚胺、N, N’ - 二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1~1.5:1~2，室温反应2~3小时，减压过滤除去固体不溶物，得到Boc-Gly-His (Boc) -COOSu的1，4- 二氧六环或四氢呋喃溶液；
(5)合成Boc-Gly-His (Boc) -Lys (Ac) -OH 将H-Lys (Ac)-OH和碳酸氢钠完全溶解于蒸馏水中，所得溶液滴加到步骤(4)得到的Boc-Gly-His (Boc) -COOSu的1，4-二氧六环或四氢呋喃溶液中,H-Lys (Ac)-OH与碳酸氢钠、Boc-Gly-His(Boc)-OH的摩尔比为1.1~1.5:1.1~1.5:1，室温搅拌反应18~20小时，分离纯化产物，得到 Boc-Gly-His (Boc) -Lys (Ac) -OH ； (6)合成GHK三肽 将Boc-Gly-His (Boc) -Lys (Ac) -OH加入三氟乙酸与蒸懼水的体积比为1:1的混合液中，B0c-Gly-His(B0c)-Lys(Ac)-OH与混合液的质量-体积比为lg:8~10mL，室温搅拌反应2~3小时，用乙酸乙酯萃取，水相减压浓缩至干，得到GHK三肽。
2.根据权利要求1所述的GHK三肽的合成方法，其特征在于:所述的合成H-Lys (Ac) -OH步骤(1)中，将赖氨酸完全溶解于蒸馏水中，室温搅拌，用质量分数为10%的氢氧化钠水溶液调节pH值至10~11,加入乙酸对硝基苯酯与1，4-二氧六环或四氢呋喃的体积比为1:3的混合液，赖氨酸与乙酸对硝基苯酯的摩尔比为1:1.0~1.3，室温搅拌反应3~4小时，分离纯化产物，得到H-Lys (Ac) -0H。
3.根据权利要求1所述的GHK三肽的合成方法，其特征在于:所述的合成Boc-Gly-His (Boc) -OH步骤(3)中，将组氨酸和碳酸氢钠完全溶解于蒸馏水中，所得溶液滴加到步骤(2)得到的Boc-Gly-COOSu的1，4-二氧六环或四氢呋喃溶液中，室温搅拌反应18~20小时；滴加二碳酸二叔丁酯与1，4_二氧六环或四氢呋喃的质量-体积比为Ig:5~8mL的混合液，加入氢氧化钠，Boc-Gly-OH与组氨酸、碳酸氢钠、二碳酸二叔丁酯、氢氧化钠的摩尔比为1:1.1~1.5:1.1~1.5:1.3~1.5:2~3，室温反应3~5小时，分离纯化产物，得到 Boc-Gly -His (Boc) -0H。
【文档编号】C07K1/06GK103665102SQ201310751827
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】刘林, 张腾, 宋卫, 刘晓芸, 张忠旗, 杨晓琳, 赵金礼 申请人:陕西东大生化科技有限责任公司