一种从黄乳海参提取制备高品质胶原蛋白的方法
【专利摘要】本发明涉及生物技术，具体的说是一种从黄乳海参（Holothuia?fuscogliva）体壁中提取制备高品质胶原蛋白的方法。将去除内脏、破壁后的海参于提取液中搅拌离心得到胶原纤维沉淀；胶原纤维沉淀中经NaOH搅拌调节至中性，而后酶解2-4天，酶解液离心，收集上清液并向其中加入终浓度为1-1.5M的NaCl，过夜离心，沉淀于0.5M?HAc中溶解，透析处理后即为黄乳海参胶原蛋白。本发明具快速、简便、纯度高、易产业化等特点，为实现黄乳海参胶原蛋白的高值化利用提供了重要的技术支持。
【专利说明】一种从黄乳海参提取制备高品质胶原蛋白的方法【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术,具体的说是一种从黄乳海参(Holothuia fuscogliva)体壁中提取制备高品质胶原蛋白的方法。
【背景技术】
[0002]胶原蛋白(或称胶原)是由三条α多肽链形成的三股螺旋结构。它是由动物细胞合成的一种生物高分子，广泛存在于动物骨、腱、软骨和皮肤及其它结缔组织中，约占哺乳动物总蛋白的I/3，在骨头与肌腱中约有90%以上，皮肤中约有50%以上的蛋白质为胶原蛋白。近年来，随着研究的进展，人们发现胶原的功能不仅仅限于对有机体的支撑作用，它有着更精细、更复杂的生物功能，关系到细胞的增殖、分化和移动等生命现象，使动物的骨、腱、软骨和皮肤保持一定的机械强度。此外，胶原蛋白因其弱的抗原性和良好的生物相容性，在烧伤、创伤、眼角膜疾病、美容、矫形、硬组织修复、创面止血等，胶原的高亲水性、无毒、体内生物相容性、降解性好等优点使其广泛的应用于医药学方面。
[0003]黄乳海参(Holothuiafuscogliva),属棘皮动物门(Echinodermata),海参纲(Holothuroidea),楣手目(Aspidochirotida),海参科(Holothuriidae),海参属(Holothuria)0多分布于西沙群岛和新喀里多尼亚；生活在珊瑚礁内，水深约10_45m ;大形种，长度可达500mm，宽130mm。体壁厚而粗糙。口腹位，周围有疣襟部，具触手20个。背面散布很小的疣足和管足，身体两侧各有5-6个很大的乳房状突起。体壁内骨片丰富，包括桌形体和扣状体。桌形体有两种:一种底盘边缘平滑，塔部顶端齿少；另一种桌形体底盘边缘有瘤状突起，顶端齿多。有的桌形体大，有立柱5-6个，顶端齿多，几乎把整个盘都盖满。扣状体有的简单，有的复杂，形成有孔中空纺锤形穿孔体。背面灰褐色，并带小的白色斑块，两侧有大的白色斑块；腹面为浅的栗子褐色。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是 提供一种从黄乳海参提取制备高品质胶原蛋白的方法。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0006]—种从黄乳海参提取制备闻品质I父原蛋白的方法，将去除内脏、破壁后的海参于提取液中搅拌离心得到胶原纤维沉淀；胶原纤维沉淀中经NaOH搅拌调节至中性，而后酶解2-4天，酶解液离心，收集上清液并向其中加入终浓度为1-1.5M的NaCl，过夜离心，沉淀于0.5M HAc中溶解，透析处理后即为黄乳海参胶原蛋白。
[0007]将去除内脏的海参体壁切成碎块浸泡于10-30倍(w/v)蒸馏水中，搅拌0.5-2h后弃洗涤液，向浸泡后的海参体壁碎块中加入其10-30倍体积的提取液中搅拌12-36h，弃洗涤液，然后向海参碎块中加入其10-30倍体积的蒸馏水搅拌提取12-36h，用筛絹滤去未溶解海参碎块，10000-12000g离心10-30min得胶原纤维沉淀；
[0008]所述提取液为含5mM EDTA 的 0.1M pH8.0Tris-HCl。
[0009]向所述的胶原纤维沉淀中加入其10-30倍体积的0.1M NaOH搅拌2_4天，搅拌后以10000-12000g离心10-30min得沉淀，用蒸馏水洗涤沉淀至中性，然后向沉淀中加入其10-30倍体积的含0.5-1% (w/v)的胃蛋白酶的0.5MHAc，酶解2-4天。
[0010]将所述酶解液以10000-12000g离心10-30min，取上清，并向上清中加入NaCl使其终浓度为1-1.5M，4°C静置过夜，10000-12000g离心10_30min，取沉淀；沉淀溶解于0.5MHAc 中，溶解后 4°C下用 20mM pH8.0PBS 透析 1-3 天，透析后 10000_12000g 离心 10_30min，收集沉淀；沉淀再溶于0.5MHAc中，溶解后4°C下用0.5M HAc透析1_3天，然后冷冻干燥后即为黄乳海参胶原蛋白。
[0011]将上述分离获得黄乳海参胶原蛋白通过SDS-PAGE电泳检测其纯度、等电点、氨基酸组成以及进行圆二色谱分析。
[0012]本发明的优点:
[0013]1.本发明是一种简单、快速获得胶原蛋白的方法，适合工业生产。
[0014]2.本发明获得的胶原蛋白纯度较高、品质好。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1为本发明实施例提供的SDS-PAGE电泳图片。
[0016]图2本发明实施例提供的等电点测定图片。
[0017]图3本发明实施例提供的胶原蛋白的氨基酸组成分析图。
[0018]图4本发明实施例提供的胶原蛋白的圆二色谱鉴定图片。
具体实施例
[0019]实施例1:
[0020]将去内脏后的黄乳海参(Holothuia fuscogliva)体壁切成碎块并磨成粉末,取100g浸泡于3L蒸馏水中，搅拌0.5h后弃洗涤液，加入3L提取液搅拌12h，弃洗涤液，然后将海参碎块置于3L的蒸馏水搅拌提取12h，用筛絹滤去未溶解海参碎块，1000Og离心30min得胶原纤维沉淀。所述提取液是含5mM EDTA的0.1M pH8.0Tris-HCl。向胶原纤维沉淀中加入3L0.1MNaOH搅拌2天，1000Og离心30min得沉淀，用蒸馏水洗涤沉淀至中性。然后向沉淀中加入IOmL0.5M HAc和0.05g的胃蛋白酶，酶解2天。将酶解液1000Og离心30min，取上清，并向上清中加入NaCl使其终浓度为1M，4°C静置过夜，1000Og离心30min，取沉淀。将沉淀溶解于0.5M HAc中，4°C下对20mM pH8.0PBS透析I天，然后1000Og离心30min，收集沉淀；将沉淀溶于0.5M HAc中，并于4°C下对0.5M HAc透析I天，然后冷冻干燥后即为黄乳海参胶原蛋白。
[0021]将上述所得黄乳海参胶原蛋白蛋白进行SDS-PAGE电泳检测其纯度，结果显示该胶原蛋白是由两条分子量约为150kDa的α和β链、以及分子量大于250kDa的Y链组成，其等电点集中在5.1-6.0和6.7，氨基酸组成分析结果显示该胶原蛋白富含甘氨酸(36.66%)、丙氨酸(14.00%)、脯氨酸(11.44%)、谷氨酸(8.93%)、天门冬氨酸(5.97%)及精氨酸(5.55%)等，圆二色谱分析结果显示，该胶原蛋白二级结构中既含有α螺旋又含有β折叠。因此，利用该方法制备到具有纯度高、结构好、氨基酸含量优的高品质海参胶原蛋白。
[0022]实施例2:
[0023]将去内脏后的黄乳海参(Holothuia fuscogliva)体壁切成碎块并磨成粉末,取200g浸泡于4L蒸馏水中，搅拌Ih后弃洗涤液，加入4L5mM EDTA的0.1M pH8.0Tris-HCl搅拌24h，弃洗涤液，然后将海参碎块置于4L的蒸馏水搅拌提取24h，用筛絹滤去未溶解海参碎块，IlOOOg离心20min得胶原纤维沉淀。向胶原纤维沉淀中加入4L0.1M NaOH搅拌3天，IlOOOg离心20min得沉淀,用蒸懼水洗漆沉淀至中性。然后向沉淀中加入20mL0.5MHAc和0.15g的胃蛋白酶，酶解3天。将酶解液IlOOOg离心20min，取上清，并向上清中加入NaCl使其终浓度为1.2M，4°C静置过夜，IlOOOg离心20min，取沉淀。将沉淀溶解于0.5MHAc中，4°C下对20mM pH8.0PBS透析2天，然后IlOOOg离心20min，收集沉淀；将沉淀溶于
0.5M HAc中，并于4°C下对0.5M HAc透析2天，然后冷冻干燥后即为黄乳海参胶原蛋白。将上述所得黄乳海参胶原蛋白蛋白进行SDS-PAGE电泳检测其纯度，结果显示该胶原蛋白是由两条分子量约为150kDa的α和β链、以及分子量大于250kDa的Y链组成，其等电点集中在5.1-6.0和6.7，氨基酸组成分析结果显示该胶原蛋白富含甘氨酸(36.66%)、丙氨酸(14.00%)、脯氨酸(11.44%)、谷氨酸(8.93%)、天门冬氨酸(5.97%)及精氨酸(5.55%)等，圆二色谱分析结果显示，该胶原蛋白二级结构中既含有α螺旋又含有β折叠。因此，利用该方法制备到具有纯度高、结构好、氨基酸含量优的高品质海参胶原蛋白。
[0024]实施例3:
[0025]将去内脏后的黄乳海参(Holothuia fuscogliva)体壁切成碎块并磨成粉末,取300g浸泡于3L蒸馏水中，搅拌2h后弃洗涤液，加入3L5mM EDTA0.1M pH8.0Tris-HCl搅拌36h，弃洗涤液，然后将海参碎块置于3L的蒸馏水搅拌提取36h，用筛絹滤去未溶解海参碎块，12000g离心IOmin得胶原纤维沉淀。向胶原纤维沉淀中加入3L0.1M NaOH搅拌4天，12000g离心IOmin得沉淀，用蒸馏水洗涤沉淀至中性。然后向沉淀中加入30mL0.5MHAc和
0.3g的胃蛋白酶，酶解3天。将酶解液12000g离心lOmin，取上清，并向上清中加入NaCl使其终浓度为1.5M，4°C静置过夜，12000g离心lOmin，取沉淀。将沉淀溶解于0.5M HAc中，4°C下对20mM pH8.0PBS透析3天，然后12000g离心lOmin，收集沉淀；将沉淀溶于0.5MHAc中，并于4°C下对0.5M HAc 透析3天，然后冷冻干燥后即为黄乳海参胶原蛋白。将上述所得黄乳海参胶原蛋白蛋白进行SDS-PAGE电泳检测其纯度，结果显示该胶原蛋白是由两条分子量约为150kDa的α和β链、以及分子量大于250kDa的Y链组成，其等电点集中在5.1-6.0和6.7，氨基酸组成分析结果显示该胶原蛋白富含甘氨酸(36.66%)、丙氨酸(14.00%)、脯氨酸(11.44%)、谷氨酸(8.93%)、天门冬氨酸(5.97%)及精氨酸(5.55%)等，圆二色谱分析结果显示，该胶原蛋白二级结构中既含有α螺旋又含有β折叠。因此，利用该方法制备到具有纯度高、结构好、氨基酸含量优的高品质海参胶原蛋白。
【权利要求】
1.一种从黄乳海参提取制备高品质胶原蛋白的方法，其特征在于:将去除内脏、破壁后的海参于提取液中搅拌离心得到胶原纤维沉淀；胶原纤维沉淀中经NaOH搅拌调节至中性，而后酶解2-4天，酶解液离心，收集上清液并向其中加入终浓度为1-1.5M的NaCl，过夜离心，沉淀于0.5M HAc中溶解，透析处理后即为黄乳海参胶原蛋白。
2.按权利要求1所述的从黄乳海参提取制备高品质胶原蛋白的方法，其特征在于:将去除内脏的海参体壁切成碎块浸泡于10-30倍(w/v)蒸馏水中，搅拌0.5-2h后弃洗涤液，向浸泡后的海参体壁碎块中加入其10-30倍体积的提取液中搅拌12-36h，弃洗涤液，然后向海参碎块中加入其10-30倍体积的蒸馏水搅拌提取12-36h，用筛絹滤去未溶解海参碎块，.10000-12000g离心10-30min得胶原纤维沉淀； 所述提取液为含 5mM EDTA 的 0.1M pH8.0Tris-HCl。
3.按权利要求1所述的从黄乳海参提取制备高品质胶原蛋白的方法，其特征在于:向所述的胶原纤维沉淀中加入其10-30倍体积的0.1M NaOH搅拌2-4天，搅拌后以10000-12000g离心10-30min得沉淀，用蒸馏水洗涤沉淀至中性，然后向沉淀中加入其10-30倍体积的含0.5-1% (w/v)的胃蛋白酶的0.5M HAc，酶解2-4天。
4.按权利要求1所述的从黄乳海参提取制备高品质胶原蛋白的方法，其特征在于:将所述酶解液以10000-12000g离心10-30min，取上清，并向上清中加入NaCl使其终浓度为1-1.5M，4°C静置过夜，10000-12000g离心10_30min，取沉淀；沉淀溶解于0.5M HAc中，溶解后4°C下用20mM pH8.0PBS透析1_3天，透析后10000_12000g离心10_30min，收集沉淀；沉淀再溶于0.5M HAc中，溶解后4°C下用0.5M HAc透析1_3天，然后冷冻干燥后即为黄乳海参胶原蛋白。
【文档编号】C07K14/78GK103740795SQ201410009988
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月9日 优先权日:2014年1月9日
【发明者】李鹏程, 李荣锋, 于华华, 刘松, 邢荣娥, 薛伟, 岳洋 申请人:中国科学院海洋研究所